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    組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的玉米F1雜交種印跡基因的表達(dá)變異研究

    2018-06-27 07:53:56呂睿麗張美善
    關(guān)鍵詞:胚乳雜交種印跡

    呂睿麗,楊 巍,劉 寶,張美善

    (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 長春 130118; 2.東北師范大學(xué)表觀遺傳學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 130024)

    通過有性生殖產(chǎn)生的子代繼承了來自父、母雙親本的兩套染色體組.按照孟德爾遺傳規(guī)律,子代中來自雙親本的等位基因應(yīng)均等表達(dá).雖然絕大多數(shù)基因遵循這個(gè)表達(dá)規(guī)律,但在哺乳動(dòng)物和開花植物中,也有少部分基因只表達(dá)源自某一親本的等位基因,而另一親本的等位基因完全或部分沉默,即子代基因組根據(jù)親本來源選擇表達(dá)(擇親表達(dá)),這種現(xiàn)象稱為基因組印跡,具有這種特殊表達(dá)模式的基因稱為印跡基因[1].植物中無論是正交還是反交,印跡基因均只有來自某一親本的等位基因表達(dá).只有來自母本等位基因表達(dá)(父本等位基因沉默)的基因稱為母本印跡基因(maternally expressed imprinted gene,MEG);只有來自父本等位基因表達(dá)(母本等位基因沉默)的基因稱為父本印跡基因(paternally expressed imprinted gene,PEG)[1-2].隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的普及應(yīng)用,人們已從擬南芥、水稻、玉米、高粱和蓖麻等植物中識(shí)別出了幾百個(gè)印跡基因[3-7].Zhang等[8]和Waters等[5]從以玉米自交系B73和Mo17為親本材料制備的F1正反雜交種授粉后10 ~14 d的胚乳中,分別獲得了179個(gè)(68個(gè)MEG和111個(gè)PEG)和100個(gè)(54個(gè)MEG和46個(gè)PEG)印跡基因.開花植物基因組印跡的發(fā)生部位主要是發(fā)育種子的胚乳,印跡基因主要在種子器官特異表達(dá)[3-8].Waters等[5]分析了71個(gè)印跡基因在不同組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其中31個(gè)基因(20個(gè)MEG和11個(gè)PEG)顯示胚乳特異表達(dá)或優(yōu)先表達(dá),說明MEG更傾向于胚乳特異表達(dá)模式.

    印跡基因可被熱脅迫誘導(dǎo)表達(dá).擬南芥印跡基因SDS具有胚乳特異表達(dá)、在營養(yǎng)器官沉默的表達(dá)特性.當(dāng)植株受到熱脅迫時(shí),擬南芥幼葉中SDS基因會(huì)被脅迫刺激而激活表達(dá);脅迫越強(qiáng),誘導(dǎo)表達(dá)效果也越顯著.SDS基因的誘導(dǎo)表達(dá)有利于植株抵抗脅迫[9].

    在組織培養(yǎng)過程中,植物外植體在含有植物激素的培養(yǎng)基中失去原有的分化狀態(tài),形成無規(guī)律的細(xì)胞團(tuán),即愈傷組織.對(duì)于植物來說,組織培養(yǎng)是強(qiáng)脅迫[10].許多研究表明,組織培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生可遺傳的遺傳變異和表觀遺傳變異,稱為體細(xì)胞克隆變異.植物體細(xì)胞克隆變異可導(dǎo)致基因組中很多基因的表達(dá)模式發(fā)生改變[10-12].

    本實(shí)驗(yàn)以玉米F1正反雜交種幼胚為外植體,誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)愈傷組織;選取前人在文獻(xiàn)中報(bào)道的20個(gè)玉米印跡基因(10個(gè)MEG和10個(gè)PEG)[5,8],研究了在不同繼代培養(yǎng)時(shí)間(0,3,5,9和12個(gè)月)的愈傷組織中發(fā)生的印跡基因的表達(dá)變異,以為體細(xì)胞克隆變異機(jī)制及印跡基因功能研究提供理論參考.

    1 材料與方法

    1.1 植物材料

    玉米自交系親本B73(B)和Mo17(M)種植于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)地.以人工授粉方法制造F1正反雜交種BM(B73 × Mo17,B73為母本、Mo17為父本)和MB(Mo17 × B73,Mo17為母本、B73為父本).授粉后18 d,從田間選取BM和MB的穗,迅速拿到實(shí)驗(yàn)室,用鑷子取胚和胚乳,用液氮冷凍,儲(chǔ)存于-70℃冰箱備用.葉片材料取自3葉期植株.不同植物材料的取樣均設(shè)置3個(gè)重復(fù).

    1.2 愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)

    取授粉后18 d的玉米幼嫩種子,先用表面活性劑清洗(去除表面張力),再用自來水沖洗干凈,在超凈工作臺(tái)上用70%的酒精進(jìn)行表面消毒30 s,無菌水沖洗2次后用0.1%的HgCl2溶液浸泡滅菌8 min,然后用無菌水反復(fù)沖洗5~6次.在超凈工作臺(tái)上用鑷子剝?nèi)シN皮,取出幼胚,將幼胚盾片朝上分別接種于N6E誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6 3.99 g/L + 2,4-D 2 mg/L + 肌醇 0.1 g/L + 脯氨酸 2.76 g/L + 水解酪蛋白 0.1 g/L + 3 %蔗糖 + 0.68 %瓊脂,pH=5.8)和馬鈴薯培養(yǎng)基(馬鈴薯用200 g/L無菌水煮沸20 min后過濾,加5 %蔗糖、0.68 %瓊脂,調(diào)pH=5.8);每個(gè)三角瓶中接種10個(gè)幼胚,置于25℃人工氣候箱進(jìn)行暗培養(yǎng).約15 d后長出愈傷組織,把一部分愈傷用液氮冷凍,儲(chǔ)存于-70℃冰箱(0繼代時(shí)間愈傷組織).同時(shí),將愈傷組織分別轉(zhuǎn)移到N6繼代培養(yǎng)基(N6 3.99 g/L + 2,4-D 2 mg/L + 肌醇 0.1 g/L + 3%蔗糖 + 0.68 %瓊脂,pH=5.8)和馬鈴薯繼代培養(yǎng)基(馬鈴薯用200 g/L無菌水煮沸20 min 后過濾,加5 %蔗糖、0.68 %瓊脂,pH=5.8),置于25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng).繼代頻率為每隔14~20 d繼代一次,每2~3個(gè)月取愈傷組織冷凍,并儲(chǔ)存于-70℃冰箱,直到用于總RNA提取.愈傷組織的取樣設(shè)置3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)的愈傷組織分別取自不同的三角瓶.

    1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

    總RNA提取按照Invitrogen公司Trizol試劑說明書進(jìn)行.取1 μL總RNA,用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific,http://www.nanodrop.com)測(cè)定RNA濃度和質(zhì)量.各樣品RNA質(zhì)量濃度為0.5~1.5 μg/μL,D(260)/D(280)=1.9~2.0,符合反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)要求.另外,用經(jīng)DEPC處理的水制備1.0%瓊脂糖凝膠,鑒定RNA的完整性.

    取提取的總RNA 2 μg,用DNaseⅠ(TransGen Biotech)進(jìn)行去基因組DNA處理,以O(shè)ligo(dT)為下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,具體方法參照TransGen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen Biotech,http://www.transgen.com.cn)說明書進(jìn)行.

    從Zhang等和Waters等[5,8]報(bào)道的玉米印跡基因中隨機(jī)選出20個(gè)印跡基因,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(見表1).同時(shí),以玉米肌動(dòng)蛋白基因Actin(ID:GRMZM2G126010)設(shè)計(jì)參照引物進(jìn)行PCR,調(diào)整各個(gè)樣品的起始量進(jìn)行均一化.Actin基因的正反向引物序列分別為CCTGAAGATCACCCTGTGCT和GCAGTCTCCAGCTCCTGTTC.PCR反應(yīng)參數(shù)為:95℃初始變性2 min;然后,95℃30 s,60℃40 s,72℃40 s,25~30次循環(huán)(對(duì)不同引物,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整循環(huán)數(shù));最后72℃延伸8 min.PCR反應(yīng)體系為20 μL,使用的試劑購自Takara公司.RT-PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳.基因功能注釋信息查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和MaizeGDB(https://www.maizegdb.org/)(見表2).

    表1 玉米印跡基因RT-PCR引物序列

    表2 玉米印跡基因功能注釋信息和參考文獻(xiàn)

    注:*表示MEG為母本印跡基因;**表示PEG為父本印跡基因.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同繼代培養(yǎng)時(shí)間玉米愈傷組織中母本印跡基因的表達(dá)變異

    本研究用于組織培養(yǎng)的基因型為玉米兩個(gè)正反F1雜交種:B73 × Mo17(BM)和Mo17 × B73(MB).由于許多印跡基因只在種子器官表達(dá),在營養(yǎng)器官沉默,本試驗(yàn)把種子器官(胚、胚乳)作為實(shí)材,把營養(yǎng)器官(葉片)作為參照.首先檢測(cè)在5個(gè)不同繼代培養(yǎng)時(shí)間(0,3,5,9,12個(gè)月)愈傷組織中10個(gè)玉米MEG的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4個(gè)MEG出現(xiàn)不同程度的表達(dá)變異.其中,胚乳特異表達(dá)的GRMZM2G147226基因在繼代培養(yǎng)9個(gè)月(BM)和12個(gè)月(BM和MB)的愈傷中出現(xiàn)微弱的激活表達(dá);胚、胚乳特異表達(dá)的GRMZM2G370991基因在0繼代培養(yǎng)時(shí)間的BM愈傷組織、繼代培養(yǎng)9個(gè)月(MB)和12個(gè)月(BM和MB)的愈傷中出現(xiàn)微弱的激活表達(dá)(見圖1、表3).除了激活表達(dá),印跡基因的體細(xì)胞克隆表達(dá)變異也出現(xiàn)了基因沉默變異,如在胚、胚乳和葉片中都有表達(dá)的GRMZM2G033413基因,在繼代培養(yǎng)9個(gè)月(MB)和12個(gè)月(BM和MB)的愈傷中出現(xiàn)了基因沉默的現(xiàn)象.GRMZM2G169695基因則在繼代培養(yǎng)3個(gè)月和5個(gè)月的愈傷中出現(xiàn)了基因沉默的現(xiàn)象(見圖1、表3).從正反雜交種之間的變異情況來看,只有2個(gè)基因(GRMZM2G147226和GRMZM2G370991)在個(gè)別年齡的愈傷組織中存在差異.

    另外,有6個(gè)MEG未顯示任何變異.其中,具有胚乳或(和)胚特異表達(dá)特性(葉片中不表達(dá))的5個(gè)MEG(GRMZM2G073700,GRMZM2G062650,GRMZM2G118205,GRMZM2G014119和GRMZM2G150134),在各個(gè)時(shí)期愈傷組織中都沒有任何激活;而GRMZM2G374088基因則在不同器官及不同時(shí)期愈傷組織中都顯示了高表達(dá)(見圖1、表3).

    圖1 10個(gè)玉米母本印跡基因(MEG)在不同繼代培養(yǎng)時(shí)間愈傷組織中的表達(dá)結(jié)果

    表達(dá)模式愈傷組織有無變異及變異類型母本印跡基因(MEG)父本印跡基因(PEG)胚乳特異表達(dá)有變異,愈傷表達(dá)激活GRMZM2G147226GRMZM2G127160GRMZM2G449489胚、胚乳特異表達(dá)有變異,愈傷表達(dá)激活GRMZM2G370991AC191534.3_FG003GRMZM2G028366胚、胚乳和葉片均表達(dá)有變異,愈傷表達(dá)沉默GRMZM2G033413GRMZM2G169695GRMZM2G006732胚乳特異表達(dá)無變異,愈傷不表達(dá)GRMZM2G073700GRMZM2G062650GRMZM2G091819胚、胚乳特異表達(dá)無變異,愈傷不表達(dá)GRMZM2G118205GRMZM2G014119胚特異表達(dá)無變異,愈傷不表達(dá)GRMZM2G150134胚、胚乳和葉片均表達(dá)無變異,愈傷表達(dá)GRMZM2G374088GRMZM2G138382GRMZM2G103909GRMZM2G447406GRMZM5G845175

    2.2 不同繼代培養(yǎng)時(shí)間玉米愈傷組織中父本印跡基因的表達(dá)變異

    對(duì)10個(gè)玉米父本印跡基因(PEG)在正反F1雜交種BM和MB 5個(gè)不同繼代培養(yǎng)時(shí)間(0,3,5,9,12個(gè)月)的愈傷組織中表達(dá)情況的分析表明,有50%的PEG出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)變異,而且相對(duì)于MEG,PEG的基因表達(dá)變異更加明顯.具體來說,有2個(gè)PEG (GRMZM2G127160和GRMZM2G449489)只在胚乳中特異表達(dá),而在胚和葉片中不表達(dá),但是在9個(gè)月和12個(gè)月繼代培養(yǎng)的愈傷組織中都有少量激活表達(dá)(見圖2、表3);2個(gè)胚和胚乳特異表達(dá)的PEG(AC191534.3_FG003和GRMZM2G028366)分別在5個(gè)月MB和9,12個(gè)月繼代培養(yǎng)的愈傷組織中出現(xiàn)了明顯的激活表達(dá)(見圖2、表3);在胚、胚乳和葉片中都有表達(dá)的基因GRMZM2G006732在不同時(shí)期的愈傷組織中均出現(xiàn)了基因沉默,或表達(dá)極其微弱(見圖2、表3).

    在無變異的5個(gè)PEG中,只有GRMZM2G091819屬胚乳特異表達(dá)基因,另外4個(gè)PEG(GRMZM2G138382,GRMZM2G103909,GRMZM2G447406和GRMZM5G845175)在不同器官及不同時(shí)期的愈傷中都有表達(dá),尤其是GRMZM2G447406和GRMZM5G845175基因在不同器官及不同時(shí)期愈傷組織中均有相似的較高表達(dá)(見圖2、表3).

    3 討論

    在近年來常用的mRNA含量測(cè)定技術(shù)中,雖然熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法的應(yīng)用越來越廣泛,但事實(shí)上,如果只需評(píng)估樣品之間基因表達(dá)水平的相對(duì)差異,半定量RT-PCR(semi quantitative reverse transcription PCR,SqRT-PCR)技術(shù)則完全可以滿足實(shí)驗(yàn)要求.與經(jīng)典的檢測(cè)基因的表達(dá)方法如Northern印跡、RNA酶保護(hù)分析等相比,半定量RT-PCR法具有專一性好、快速簡便、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn).尤其是在需要檢測(cè)不同器官之間表達(dá)差異顯著的基因時(shí),比起熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法,半定量RT-PCR方法能夠更直觀地顯示基因表達(dá)是否存在器官特異性,以及是否發(fā)生激活或沉默.本實(shí)驗(yàn)的研究目的是為了檢測(cè)玉米印跡基因在不同培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織中的表達(dá)變異,而印跡基因在不同組織之間表達(dá)差異顯著,所以本研究采用了半定量RT-PCR方法分析了基因表達(dá).

    本文的研究結(jié)果表明,玉米印跡基因的表達(dá)變異在繼代培養(yǎng)9個(gè)月和12個(gè)月時(shí)明顯增加,這與前人的研究結(jié)果相似.薛美鳳等[13]報(bào)道,愈傷組織的培養(yǎng)時(shí)間是造成體細(xì)胞克隆變異和再生植株表型變異的一個(gè)重要原因,隨著胚性愈傷組織選擇培養(yǎng)時(shí)間的延長和繼代次數(shù)的增多,愈傷細(xì)胞感受的脅迫越來越強(qiáng),體細(xì)胞胚變異頻率逐漸升高.

    圖2 10個(gè)玉米父本印跡基因(PEG)在不同繼代培養(yǎng)時(shí)間愈傷組織中的表達(dá)結(jié)果

    從基因功能注釋來看,在發(fā)生表達(dá)變異的4個(gè)MEG中,有2個(gè)MEG(GRMZM2G370991和GRMZM2G033413)分別被注釋為EIN2(乙烯不敏感2)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和脫落酸不敏感類似蛋白(見表2).乙烯和脫落酸是兩種“逆境激素”,在植物遇到逆境脅迫時(shí)含量增加,以便植物抵抗不良的環(huán)境條件.愈傷細(xì)胞經(jīng)歷離體培養(yǎng)和植物激素等化學(xué)物質(zhì)刺激的“強(qiáng)脅迫”,可能激活與抗逆激素相關(guān)的編碼基因,這也說明玉米印跡基因除了在種子發(fā)育過程中起重要作用以外,在抗脅迫過程中也可能起一定作用.

    [參 考 文 獻(xiàn)]

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