HPGFC雙柱串聯(lián)檢測(cè)右旋糖酐蔗糖酶催化產(chǎn)物及右旋糖酐聚合過(guò)程

黃雙霞，侯殿志,2，陳華磊，于 玥，陳 山,3,*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004）

右旋糖酐是蔗糖經(jīng)右旋糖酐蔗糖酶催化產(chǎn)生的一種主鏈含α-（1,6）糖苷鍵大于90%的葡聚糖，并伴有以α-（1,2）、α-（1,3）或α-（1,4）糖苷鍵連接的分支[1-2]。右旋糖酐的用途與其聚合的葡聚糖分子數(shù)目密切相關(guān)，分子質(zhì)量不同，其作用也不盡相同[3-5]。大分子質(zhì)量的右旋糖酐（mw＞106Da）可用作色譜柱填充劑[6]；中等分子質(zhì)量的右旋糖酐（105Da＜mw＜106Da）性質(zhì)穩(wěn)定、有良好的生物相容性和保濕性，可用作冰淇淋和果醬的增稠劑，化妝品和眼藥水的添加劑等[7]；低分子質(zhì)量的右旋糖酐（104Da＜mw＜105Da）是優(yōu)良的血漿代替品[8]；小分子質(zhì)量的右旋糖酐（mw＜104Da）可用于右旋糖酐衍生品的制備[9-10]。

目前，多糖類物質(zhì)的分子質(zhì)量測(cè)定方法主要有滲透壓法、超速離心法、黏度法、高壓電泳法和光散射法等[11]。然而，這些方法普遍存在著操作麻煩且誤差大等問(wèn)題。高效凝膠過(guò)濾色譜（high performance gel filtration chromatography，HPGFC）法以其快速、高分辨和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，在多糖及聚合物分子質(zhì)量、分子質(zhì)量分布及多聚分散性的測(cè)定方面得到廣泛應(yīng)用[12]。HPGFC法測(cè)定多糖時(shí)，通常采用單柱分析或與質(zhì)譜聯(lián)用[13-14]。而以酶法催化蔗糖制備右旋糖酐的體系中除了產(chǎn)物右旋糖酐外，還含有底物蔗糖及副產(chǎn)物果糖、葡萄糖等[15]。因此，建立一種能夠精密監(jiān)測(cè)產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量變化、蔗糖、葡萄糖及果糖濃度等指標(biāo)的方法對(duì)于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)非常重要。

工業(yè)上右旋糖酐的制備主要是通過(guò)腸膜狀明串珠菌（Leuconstoc mesenteriodes）分泌的右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖來(lái)完成的[16]。但由于發(fā)酵體系成分復(fù)雜，除含有大量菌體外，還含有其他營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致其合成機(jī)理難以實(shí)現(xiàn)有效的解析[17]。以分離純化得到的右旋糖酐蔗糖酶與蔗糖溶液直接接觸制備右旋糖酐，反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，使得右旋糖酐合成機(jī)理的研究更具可行性[18-19]。目前，關(guān)于右旋糖酐的聚合機(jī)理還不明了，對(duì)該合成規(guī)律進(jìn)行研究和探討有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)不同分子質(zhì)量右旋糖酐的定向制備[20]。此外，右旋糖酐合成機(jī)理方面的研究基本都是限制在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行的，未采用干預(yù)措施，對(duì)于制備過(guò)程中是否存在抑制或者間歇合成的現(xiàn)象不能做出合理的解釋[21-23]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建右旋糖酐蔗糖酶耦合兩級(jí)膜對(duì)右旋糖酐的聚合過(guò)程進(jìn)行探討和分析[24]，以期為酶法耦合膜分離技術(shù)定向制備特定分子質(zhì)量右旋糖酐的實(shí)現(xiàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸膜明串珠菌CICC-21724 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 美國(guó)Polymer Laboratories公司；果糖、蔗糖、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、醋酸鈉、冰醋酸、硫酸、氯化鈣、3,5-二硝基水楊酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇6000（分析純） 廣東光華科技股份有限公司；牛肉膏、酵母膏（生物試劑）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂（生物試劑）廣東環(huán)凱生物科技有限公司；蛋白胨（生物試劑）北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 HPGFC儀（配有G1362A示差折光檢測(cè)器及GPC數(shù)據(jù)分析軟件） 美國(guó)Agilent公司；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；ZHJH-1115C垂直流超凈工作臺(tái)、ZHWY-211B全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Avanti J-E多用途高效離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Stat Fax 2100酶標(biāo)儀 美國(guó)Awarendss公司；Barnstead Easy Pure LF超純水機(jī) 美瑞泰克科技（天津）有限公司；323E/D蠕動(dòng)泵 斯派沙克集團(tuán)公司；膜包（PXBO05A50、PXBO10A50、PXBO50A50、PXBO100C50） 默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 右旋糖酐蔗糖酶的制備與分離純化

25 ℃斜面培養(yǎng)基中復(fù)活腸膜明串珠菌，24 h后進(jìn)行平板劃線獲取單菌落，25 ℃、24 h恒溫培養(yǎng)；挑取單菌落至種子培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)；對(duì)數(shù)期接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中（搖床培養(yǎng)條件同上），24 h后將發(fā)酵液4 ℃離心20 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，離心后的上清液即為右旋糖酐蔗糖粗酶液。采用課題組前期研究得到的雙水相法對(duì)右旋糖酐蔗糖粗酶液進(jìn)行純化[25]。

1.3.2 右旋糖酐蔗糖酶的酶活測(cè)定

25 ℃催化單底物蔗糖1 min內(nèi)生成1 μmol果糖所需的右旋糖酐蔗糖酶酶量，定義為一個(gè)酶活單位（U）。作為一種糖基轉(zhuǎn)移酶，右旋糖酐蔗糖酶能將催化蔗糖產(chǎn)生的D-吡喃葡萄糖基轉(zhuǎn)移到右旋糖酐鏈上，同時(shí)釋放出果糖分子。通常情況下，果糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)吸光度與還原糖含量的線性關(guān)系計(jì)算酶活[26]。

1.3.3 HPGFC單柱和雙柱的檢測(cè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)

對(duì)比單柱和雙柱對(duì)系列右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果以及對(duì)催化反應(yīng)混合液中右旋糖酐、底物蔗糖及副產(chǎn)物果糖、葡萄糖的檢測(cè)效果。樣品的制備：在右旋糖酐蔗糖酶為0.2 U/mL，底物蔗糖濃度為0.2 mol/L，反應(yīng)體系為400 mL條件下制備得到的催化產(chǎn)物經(jīng)沸水浴滅活后，用超純水稀釋100 倍，過(guò)0.45 μm微孔膜，待測(cè)。

色譜柱：分別為KS-Guard+KS-801、KS-Guard+KS-805、KS-Guard+KS-805+KS-801。KS-Guard為保護(hù)柱。

色譜分離條件：安捷倫1100系統(tǒng)配示差檢測(cè)器，流動(dòng)相為超純水，流速1.0 mL/min，檢測(cè)器溫度33 ℃，柱溫箱溫度65 ℃，進(jìn)樣20 μL。

1.3.4 HPGFC雙柱串聯(lián)檢測(cè)各標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)溶液：將分子質(zhì)量分別為5 900、22 800、47 300、112 000、212 000、404 000、778 000 Da的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品，配成10 mg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm微孔膜過(guò)濾，進(jìn)樣量20 μL，每個(gè)樣品平行操作3 次。

精確配制系列濃度蔗糖、葡萄糖和果糖溶液，在1.3.3節(jié)色譜分離條件下進(jìn)樣檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算R2值，驗(yàn)證HPGPC雙柱串聯(lián)是否可有效實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中蔗糖、葡萄和果糖的定量測(cè)定。

1.3.5 HPGFC雙柱串聯(lián)的精密性實(shí)驗(yàn)

精確配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L和1.0 mmol/L系列濃度蔗糖溶液，將樣品的3 次峰面積進(jìn)行平均，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），驗(yàn)證系統(tǒng)的精密度。

1.3.6 蔗糖轉(zhuǎn)化率、右旋糖酐產(chǎn)量和得率測(cè)定方法的構(gòu)建

反應(yīng)體系中底物蔗糖經(jīng)右旋糖酐蔗糖酶作用，被等量的轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，絕大部分葡萄糖被用于合成目標(biāo)產(chǎn)物右旋糖酐，果糖則被游離于反應(yīng)體系中。因此，實(shí)驗(yàn)以果糖峰開始下降的前一個(gè)取樣點(diǎn)作為聚合反應(yīng)的終點(diǎn)。最后反應(yīng)體系的終止樣中，含有未轉(zhuǎn)化的蔗糖、合成的右旋糖酐和生成的果糖、未來(lái)得及合成右旋糖酐的游離葡萄糖。

根據(jù)樣品中蔗糖、葡萄糖和果糖的峰面積分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到對(duì)應(yīng)濃度，即可計(jì)算出樣品中剩余的蔗糖、葡萄糖和果糖的質(zhì)量；最后按照質(zhì)量守恒定律，通過(guò)公式（1）～（3）可以得出各指標(biāo)：

1.3.7 右旋糖酐蔗糖酶添加量及蔗糖濃度對(duì)各指標(biāo)的影響

右旋糖酐蔗糖酶添加量為0.2 U/mL時(shí)，探索0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L和1.0 mol/L系列蔗糖濃度對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)化率、右旋糖酐產(chǎn)量和得率的影響規(guī)律；蔗糖濃度為0.1 mol/L時(shí)，探索0.1、0.2、0.4、0.6 U/mL和0.8 U/mL不同右旋糖酐蔗糖酶添加量對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)化率、右旋糖酐產(chǎn)量和得率的變化規(guī)律。反應(yīng)體系均為400 mL，30 h進(jìn)行取樣，樣品處理按1.3.3節(jié)方法。

1.3.8 右旋糖酐蔗糖酶耦合兩級(jí)膜對(duì)右旋糖酐聚合過(guò)程

1.3.8.1 酶法耦合兩級(jí)膜裝置的示意圖及其運(yùn)行過(guò)程

圖1 酶法耦合兩級(jí)膜過(guò)程裝置圖Fig.1 Schematic diagram of the process of enzymatic treatment coupled with two-stage membrane separation

如圖1所示，將膜裝置按實(shí)驗(yàn)流程圖進(jìn)行連接，然后將經(jīng)高壓滅菌過(guò)的蔗糖溶液進(jìn)行膜的預(yù)處理，使連接管路內(nèi)預(yù)充滿本次實(shí)驗(yàn)的蔗糖溶液。然后將配制好的蔗糖酶溶液放進(jìn)料液桶中（進(jìn)行磁力攪拌和水浴恒溫25 ℃），分別啟動(dòng)一級(jí)膜和二級(jí)膜的蠕動(dòng)泵（大約在0.5 h左右啟動(dòng)二級(jí)膜蠕動(dòng)泵），通過(guò)調(diào)節(jié)2 個(gè)蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速來(lái)平衡膜裝置的流速，使整個(gè)系統(tǒng)處于平衡循環(huán)狀態(tài)。

1.3.8.2 右旋糖酐聚合過(guò)程

為了更加細(xì)致準(zhǔn)確地分析酶法耦合兩級(jí)膜干預(yù)條件下右旋糖酐的聚合過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)對(duì)一級(jí)膜料液桶和二級(jí)膜料液桶分別進(jìn)行定時(shí)取樣檢測(cè)，以監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中目標(biāo)產(chǎn)物分子質(zhì)量的走勢(shì)。從右旋糖酐蔗糖酶和底物蔗糖溶液接觸時(shí)開始計(jì)時(shí)，在兩者反應(yīng)0、2、4、6、8、10、20、30、40 h和50 h分別進(jìn)行取樣，樣品處理按1.3.3節(jié)方法。以蔗糖（濃度0.1～1.0 mol/L）為反應(yīng)底物，加入右旋糖酐蔗糖酶（濃度0.1～0.8 U/mL），耦合膜過(guò)程，構(gòu)建終體積為400 mL的反應(yīng)體系。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPGFC單柱和雙柱串聯(lián)對(duì)不同分子質(zhì)量右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)效果

由圖2可以看出，在單柱KS-801檢測(cè)情況下，7 種不同分子質(zhì)量的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間十分接近，色譜峰幾乎重疊和覆蓋在一起，很難完全分離鑒定。各右旋糖酐樣品的分子質(zhì)量由于均超過(guò)了柱子的最大分離范圍，根據(jù)尺寸排阻的分離原理，它們無(wú)法進(jìn)入凝膠孔隙而直接被流動(dòng)相超純水淋洗出來(lái)。相比而言，KS-805柱由于排阻極限達(dá)到5×105，可以實(shí)現(xiàn)7 種分子質(zhì)量右旋糖酐的完全分離。在KS-805+KS-801雙柱串聯(lián)的情況下，7 種不同分子質(zhì)量的右旋糖酐分離效果很理想，各個(gè)色譜峰之間不存在重疊和覆蓋的問(wèn)題，且相比于KS-805，各個(gè)色譜峰分布也相對(duì)比較分散。在此檢測(cè)條件下，樣品先進(jìn)入KS-805柱內(nèi)，根據(jù)分子質(zhì)量大小，依次得到有效分離；進(jìn)入KS-801柱后，直接被洗脫出。KS-805+KS-801雙柱串聯(lián)可以很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)右旋糖酐各個(gè)分子質(zhì)量的分離和鑒定，且效果較好。

圖2 單柱和雙柱條件下不同分子質(zhì)量右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品的出峰情況Fig.2 Chromatographic peaks for different molecular masses of dextran under single-column and double-column separation conditions

2.2 HPGFC單柱和雙柱串聯(lián)對(duì)催化反應(yīng)混合液的檢測(cè)效果

圖3 單柱和雙柱檢測(cè)條件下催化產(chǎn)物的出峰情況Fig.3 Chromatographic peaks of catalytic reaction products under single-column and double-column separation conditions

從圖3可以看出，KS-801單柱可有效分離和鑒定小分子右旋糖酐、葡萄糖和果糖，但由2.1節(jié)結(jié)果可知KS-801單柱無(wú)法對(duì)大分子右旋糖酐的分子質(zhì)量進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)算和分析；KS-805單柱雖然排阻限較大，但是由于不具備配位體功能，無(wú)法分離和鑒定出小分子葡萄糖和果糖，且產(chǎn)物右旋糖酐的峰出現(xiàn)拖尾，連接到蔗糖峰，這對(duì)于右旋糖酐分子質(zhì)量的計(jì)算和分析會(huì)產(chǎn)生不良的影響。

在KS-805+KS-801雙柱串聯(lián)使用的情況下，根據(jù)尺寸排阻與配位體交換原理，右旋糖酐和其他小分子糖類（葡萄糖、果糖等）得到了有效的分離和鑒定；右旋糖酐峰與其他糖類峰之間也沒有出現(xiàn)拖尾和連接的現(xiàn)象。另外，由于葡萄糖基被鏈接到右旋糖酐蔗糖酶上進(jìn)行右旋糖酐的合成，故在圖3中，葡萄糖峰很低。由以上分析可見，KS-805+KS-801雙柱串聯(lián)對(duì)樣品中的大小分子糖類均可實(shí)現(xiàn)有效的檢測(cè)。

2.3 HPGFC雙柱串聯(lián)檢測(cè)右旋糖酐分子質(zhì)量校正曲線的繪制

圖4 右旋糖酐分子質(zhì)量校正曲線Fig.4 Calibration cure of dextran

根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)，繪制得到的右旋糖酐分子質(zhì)量校正曲線如圖4所示。其擬合方程為：Y=13.619 9-1.548 08X+0.115 34X2-0.003 79X3。Y為右旋糖酐分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)，X為洗脫體積，R2為0.999 8，表明KS-805和KS-801雙柱串聯(lián)使用能夠很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物中各個(gè)分子質(zhì)量右旋糖酐的測(cè)定。

2.4 HPGFC雙柱串聯(lián)檢測(cè)蔗糖、葡萄糖和果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程

圖5 不同濃度蔗糖的HPGFC洗脫疊加圖Fig.5 Overlapping chromatograms for different concentrations of sucrose

表1 蔗糖、葡萄糖及果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程Table1 Fitting equations of standard curves for sucrose,glucose and fructose

從圖5可以看出，不同濃度的蔗糖出峰時(shí)間穩(wěn)定，隨著蔗糖濃度的增大，峰面積增大，也表明檢測(cè)方法具有較好的穩(wěn)定性。由表1可知蔗糖、葡萄糖及果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程，三者R2均大于0.998，線性相關(guān)性比較好。根據(jù)上述分析可知，HPGFC雙柱串聯(lián)可以很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)體系中蔗糖、葡萄糖及果糖濃度的定量跟蹤檢測(cè)。

2.5 HPGFC雙柱串聯(lián)檢測(cè)的精密性結(jié)果

表2 不同濃度蔗糖的峰面積均值及RSDTable2 Mean values of peak area and RSD for different concentrations of sucros

由表2可知，不同蔗糖濃度3 次峰面積均值的RSD較?。ǖ陀?%），表明KS-805+KS-801雙柱串聯(lián)檢測(cè)具有較高的精密性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可靠和準(zhǔn)確性。

2.6 右旋糖酐蔗糖酶添加量及蔗糖濃度對(duì)蔗糖轉(zhuǎn)化率、右旋糖酐產(chǎn)量和得率的影響

根據(jù)1.3.6節(jié)中公式（1）～（3）計(jì)算得到各反應(yīng)體系系列的蔗糖轉(zhuǎn)化率、右旋糖酐產(chǎn)量及右旋糖酐得率，如表3所示。

同一右旋糖酐蔗糖酶添加量體系各反應(yīng)系列，隨著蔗糖底物濃度的升高，蔗糖轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì)，右旋糖酐產(chǎn)量不斷增加，右旋糖酐得率也不斷上升。在右旋糖酐蔗糖酶添加量一定的情況下，當(dāng)蔗糖底物濃度和右旋糖酐蔗糖酶添加量都充足時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化率自然會(huì)較高，但是隨著蔗糖濃度的提升，右旋糖酐蔗糖酶量不足，高濃度的蔗糖又會(huì)對(duì)右旋糖酐蔗糖酶表現(xiàn)出抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致蔗糖轉(zhuǎn)化率降低。另外一方面，盡管蔗糖濃度升高出現(xiàn)其轉(zhuǎn)化率降低的現(xiàn)象，但是相對(duì)低濃度的蔗糖底物，其合成產(chǎn)物右旋糖酐的產(chǎn)量仍會(huì)持續(xù)增加。右旋糖酐得率自然也會(huì)因?yàn)? 種指標(biāo)的改變不斷上升。

表3 不同右旋糖酐蔗糖酶添加量及蔗糖底物濃度條件下蔗糖轉(zhuǎn)化率、右旋糖酐產(chǎn)量及得率的變化Table3 Effect of enzyme dosage and sucrose concentration on the conversion of sucrose and dextran yield

同一蔗糖底物濃度反應(yīng)體系，整體上則表現(xiàn)為隨著右旋糖酐蔗糖酶添加量的增加，蔗糖轉(zhuǎn)化率和右旋糖酐產(chǎn)量相應(yīng)上升，但右旋糖酐得率出現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象。蔗糖底物濃度一定時(shí)，右旋糖酐蔗糖酶添加量的不斷增加使得合成反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行且相對(duì)比較完全，進(jìn)而蔗糖轉(zhuǎn)化率和右旋糖酐產(chǎn)量會(huì)不斷上升。右旋糖酐得率表現(xiàn)出先上升后略微下降的現(xiàn)象有可能是因?yàn)榈孜镎崽怯邢?，?dǎo)致被右旋糖酐蔗糖酶水解成的葡萄糖基有限，即便全部的葡萄糖基被用于右旋糖酐的合成，其得率相對(duì)于大量被轉(zhuǎn)化的蔗糖仍然相對(duì)較小。進(jìn)而當(dāng)右旋糖酐蔗糖酶添加量超過(guò)一定限度時(shí)（0.4 U/mL），右旋糖酐得率出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。

2.7 右旋糖酐聚合過(guò)程分析

在檢測(cè)方法建立的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建右旋糖酐蔗糖酶耦合兩級(jí)膜干預(yù)右旋糖酐的聚合過(guò)程，對(duì)其合成機(jī)理進(jìn)行更深一步的研究。為更加細(xì)致準(zhǔn)確地分析其聚合過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)分別在一級(jí)膜料液桶和二級(jí)膜料液桶進(jìn)行定時(shí)取樣，監(jiān)測(cè)右旋糖酐的分子質(zhì)量變化。

2.7.1 蔗糖濃度對(duì)一級(jí)膜料液中產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量的影響

在右旋糖酐蔗糖酶添加量為0.2 U/mL不變的情況下，改變反應(yīng)體系的底物濃度（0.2～1.0 mol/L），一級(jí)膜料液桶中產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量變化如圖6。從整體上看，同一右旋糖酐蔗糖酶添加酶量反應(yīng)體系，不同濃度蔗糖底物溶液中聚合成的產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)并沒有表現(xiàn)出大幅度波動(dòng)的現(xiàn)象（從小分子慢慢形成大分子），而是在檢測(cè)的初始階段即為百萬(wàn)級(jí)別分子質(zhì)量的右旋糖酐。5 個(gè)反應(yīng)系列的產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量變化趨勢(shì)在一級(jí)膜料液桶中整體趨于一致，在反應(yīng)的前10 h呈現(xiàn)出很小幅度的上升趨勢(shì)，之后產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量幾乎不再改變，趨于平衡。從各個(gè)反應(yīng)系列的變化曲線可以看出，產(chǎn)物右旋糖酐的分子質(zhì)量隨著蔗糖底物溶液濃度的升高出現(xiàn)小幅度下降，但重均分子質(zhì)量還都是維持在106Da以上。同一右旋糖酐蔗糖酶添加量反應(yīng)體系，產(chǎn)物右旋糖酐的分子質(zhì)量與蔗糖底物的濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Kim等[27]在右旋糖酐蔗糖酶添加量一定的條件下，改變蔗糖底物濃度（0.1～4.0 mol/L），研究終產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量的變化情況，結(jié)果表明，隨著蔗糖底物濃度的升高，產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量逐漸降低，這也與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。另外，有研究表明[28-29]，高濃度的蔗糖溶液會(huì)致使右旋糖酐蔗糖酶的活性位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而造成聚合反應(yīng)受到一定程度的抑制，反應(yīng)稍微傾向于合成低聚糖，結(jié)果產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量相對(duì)較小。

圖6 0.2 U/mL反應(yīng)體系中一級(jí)膜料液桶中右旋糖酐分子質(zhì)量變化Fig.6 Changes in molecular mass of dextran during reaction catalyzed by 0.2 U/mL dextransucrase in the fi rst stage of membrane treatment

2.7.2 蔗糖濃度對(duì)二級(jí)膜料液中產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量的影響

以0.2 U/mL和1.0 mol/L反應(yīng)體系為代表，得到的一級(jí)膜料液桶和二級(jí)膜料液桶中起始樣和終止樣的色譜疊加對(duì)比如圖7所示。

通過(guò)對(duì)0.2 U/mL反應(yīng)體系各系列設(shè)置時(shí)間段的樣品進(jìn)行檢測(cè)分析表明，在二級(jí)膜料液桶中均未有目標(biāo)產(chǎn)物右旋糖酐的出現(xiàn)。由于樣品數(shù)量較多，但為了更好地研究證實(shí)右旋糖酐的聚合機(jī)理，以0.2 U/mL、1.0 mol/L為代表得到起始點(diǎn)2 h和終止點(diǎn)30 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的一級(jí)膜料液桶和二級(jí)膜料液桶中樣品的色譜疊加圖。對(duì)比圖7的2 個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)的一級(jí)膜料液桶和二級(jí)膜料液桶中樣品色譜疊加圖，可以明顯的看出在一級(jí)膜料液桶樣品色譜疊加圖中有大分子質(zhì)量右旋糖酐的峰顯現(xiàn)，而二級(jí)膜料液桶樣品色譜疊加圖中除蔗糖、游離葡萄糖、果糖外，并沒有右旋糖酐的峰出現(xiàn)；這一現(xiàn)象很好地證明了右旋糖酐的聚合可能不是一個(gè)從小到大慢慢聚合、不斷釋放的過(guò)程；而是右旋糖酐鏈在酶活性位點(diǎn)上不斷聚合葡萄糖基，當(dāng)達(dá)到一定分子質(zhì)量水平（mw＞106Da）時(shí)才從酶活性位點(diǎn)脫落的過(guò)程。在單酶法耦合兩級(jí)膜的作用下，如果右旋糖酐的聚合是一個(gè)從小到大且不斷從酶活性位點(diǎn)上脫落的過(guò)程，則在兩級(jí)膜的作用下，按照檢測(cè)條件要求，應(yīng)該會(huì)相應(yīng)地檢測(cè)到中小分子質(zhì)量的右旋糖酐；但是根據(jù)目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在各個(gè)系列樣品中均未檢測(cè)到產(chǎn)物右旋糖酐，而只有小分子的糖類（蔗糖、葡萄糖、果糖）。同時(shí)從圖7也可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，底物蔗糖由于被消耗，其峰值明顯下降較多；水解蔗糖產(chǎn)生的葡萄糖也被用于右旋糖酐的合成，峰值明顯小于果糖；此外，隨著反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行也使得果糖峰不斷增大。

圖7 0.2 U/mL、1.0 mol/L反應(yīng)體系中反應(yīng)起始樣和終止樣的疊加譜圖Fig.7 Overlapping chromatograms of reaction products at 2 and 30 h from 0.2 U/mL dextransucrase and 1.0 mol/L surocse in two stage of membrane treatment

2.7.3 右旋糖酐蔗糖酶添加量對(duì)一級(jí)膜料液中產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量的影響

圖8 0.1 mol/L反應(yīng)體系中一級(jí)膜料液桶中右旋糖酐分子質(zhì)量變化Fig.8 Changes in molecular nass of dextran during catalysis of 0.1 mol/L sucrose the fi rst stage of membrane treatment

在蔗糖底物濃度為0.1 mol/L不變的情況，改變反應(yīng)體系的右旋糖酐蔗糖酶添加量（0.1～0.8 U/mL），一級(jí)膜料液桶中產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量的變化如圖8所示。從產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量變化趨勢(shì)曲線可以看出，除了0.8 U/mL反應(yīng)系列分子質(zhì)量低于106Da之外，其他系列產(chǎn)物右旋糖酐的分子質(zhì)量水平普遍都處于106Da以上。從開始檢測(cè)到有大分子右旋糖酐生成，到反應(yīng)終止，整個(gè)反應(yīng)體系各個(gè)系列的產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量在整個(gè)聚合反應(yīng)過(guò)程并沒有出現(xiàn)大幅度的波動(dòng)現(xiàn)象。結(jié)合圖6和圖8兩個(gè)不同反應(yīng)體系各系列的產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量的變化情況，可以從一個(gè)側(cè)面間接證明，在單酶法作用底物蔗糖制備右旋糖酐時(shí)，整個(gè)聚合過(guò)程應(yīng)該是葡萄糖基被不斷的被轉(zhuǎn)移到右旋糖酐鏈上，直至達(dá)到一定分子質(zhì)量水平（106Da左右）才從右旋糖酐蔗糖酶上脫落。另外，在蔗糖底物濃度相同的情況，不同的右旋糖酐蔗糖酶添加量對(duì)產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量變化的影響并不是很大，基本都維持在百萬(wàn)級(jí)別以上；隨著右旋糖酐蔗糖酶添加量的增加，產(chǎn)物右旋糖酐的分子質(zhì)量整體上呈下降趨勢(shì)，這與Falconer等[30]的研究結(jié)果相一致。同一蔗糖底物濃度反應(yīng)體系，產(chǎn)物右旋糖酐的分子質(zhì)量與右旋糖酐蔗糖酶添加量呈反相關(guān)關(guān)系。右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖產(chǎn)生的D-葡萄糖基被不斷的轉(zhuǎn)移到右旋糖酐鏈上，共價(jià)結(jié)合到右旋糖酐蔗糖酶的活性位點(diǎn)上；右旋糖酐蔗糖酶添加量的減少導(dǎo)致反應(yīng)體系溶液中的酶分子也相應(yīng)減少，進(jìn)而用于共價(jià)鏈接右旋糖酐鏈的酶活性位點(diǎn)也隨著減少；因此相同濃度的蔗糖底物反應(yīng)溶液，右旋糖蔗糖酶添加量少的反應(yīng)體系中酶活性位點(diǎn)也相對(duì)較少，右旋糖酐鏈附著在較少數(shù)量的活性位點(diǎn)上不斷聚合葡萄糖基，形成較高分子質(zhì)量的右旋糖酐。

2.7.4 右旋糖酐蔗糖酶添加量對(duì)二級(jí)膜料液中產(chǎn)物右旋糖酐分子質(zhì)量的影響

圖9 0.1 U/mL、0.1 mol/L反應(yīng)體系中反應(yīng)起始樣和終止樣的疊加譜圖Fig.9 Overlapping chromatograms of reaction products at 2 and 30 h from 0.1 U/mL dextransucrase and 0.1 mol/L surocse

結(jié)合一級(jí)膜料液桶中反應(yīng)的起點(diǎn)和終點(diǎn)，以0.1 U/mL和0.1 mol/L反應(yīng)體系為代表，得到一級(jí)膜料液桶和二級(jí)膜料液桶中起始樣和終止樣的色譜疊加對(duì)比圖如圖9所示。同一取樣時(shí)間點(diǎn)，一級(jí)膜料液桶樣品色譜疊加圖中出現(xiàn)大分子質(zhì)量右旋糖酐，而二級(jí)膜料液桶樣品色譜疊加圖中只有蔗糖、葡萄糖、果糖小分子糖類，未有目標(biāo)產(chǎn)物右旋糖酐。這與2.7.2節(jié)的研究結(jié)果相一致，右旋糖酐的聚合應(yīng)該是在酶活性上葡萄糖基不斷聚合，直至右旋糖酐鏈達(dá)到一定分子質(zhì)量才脫落的過(guò)程，且分子質(zhì)量水平幾乎都處于百萬(wàn)級(jí)別以上（mw＞106Da）。另外，相比于同一右旋糖酐蔗糖酶添加量反應(yīng)體系的其他系列，0.1 U/mL系列右旋糖酐蔗糖酶添加量較少，目標(biāo)產(chǎn)物右旋糖酐的產(chǎn)量也較低，相應(yīng)的溶液黏度也比較稀，但是也并未在二級(jí)膜中檢測(cè)到與一級(jí)膜標(biāo)記截留量有出入的右旋糖酐分子，這說(shuō)明超濾膜對(duì)此反應(yīng)體系具有很好的截留性。從圖9也可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，一級(jí)膜料液桶和二級(jí)膜料液桶樣品中蔗糖底物被逐漸消耗，葡萄糖由于被用于聚合右旋糖酐，其峰值明顯小于果糖峰。

3 結(jié) 論

通過(guò)分別采用單柱KS-801、KS-805及雙柱串聯(lián)對(duì)不同分子質(zhì)量的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品和催化反應(yīng)混合液進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，KS-805+KS-801雙柱串聯(lián)使用可以很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中不同分子質(zhì)量的右旋糖酐、蔗糖、葡萄糖和果糖的有效檢測(cè)；在初步建立雙柱串聯(lián)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，繪制得到的右旋糖酐分子質(zhì)量校正曲線、蔗糖、葡萄糖和果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性較高，表明此法可以對(duì)樣品中右旋糖酐分子質(zhì)量實(shí)現(xiàn)精確的測(cè)定，且可以定量跟蹤檢測(cè)催化反應(yīng)混合液中蔗糖、葡萄糖和果糖的濃度變化。最后通過(guò)對(duì)不同濃度蔗糖溶液的定量檢測(cè)，3次峰面積均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于1%且出峰情況穩(wěn)定，表明該檢測(cè)方法和系統(tǒng)具有較高的精密性和可靠性。

此外，在檢測(cè)方法得到建立的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建右旋糖酐蔗糖酶耦合兩級(jí)膜探究了右旋糖酐的聚合過(guò)程。通過(guò)跟蹤檢測(cè)不同蔗糖濃度和右旋糖酐蔗糖酶添加量條件下，一級(jí)膜和二級(jí)膜料液桶中右旋糖酐分子質(zhì)量的變化，間接證實(shí)了右旋糖酐的聚合機(jī)理是右旋糖酐分子鏈在右旋糖酐蔗糖酶活性位點(diǎn)上不斷聚合葡萄糖基，直至達(dá)到一定的分子質(zhì)量（mw＞106Da）才脫落，而不是一個(gè)從小到大、慢慢聚合、不斷脫落的過(guò)程。

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