糖脅迫下魯氏接合酵母的代謝指紋分析

韓曉江，徐志嬌，岳田利，牛 晨，魏建平，蔡 瑞*，袁亞宏*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一類(lèi)能夠在高滲透壓培養(yǎng)條件下（高糖或高鹽環(huán)境中）生長(zhǎng)的酵母菌。魯氏接合酵母在pH值為1.5～7.5的范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)的pH值為3.0～4.0。在溫度為15～35 ℃的范圍內(nèi)能夠生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)的溫度為25～30 ℃[1]。魯氏接合酵母可以用來(lái)生產(chǎn)發(fā)酵食品，也存在于高糖食品中，在合適條件下能夠引起高糖食品腐敗變質(zhì)。由于高糖環(huán)境對(duì)高滲酵母生長(zhǎng)具有抑制作用，高滲酵母污染高糖食品后生長(zhǎng)比較緩慢，但是貯存溫度的快速變化會(huì)導(dǎo)致高糖食品表面生成冷凝水，從而降低糖濃度，加速高滲酵母在高糖食品表面的生長(zhǎng)[2]。

目前對(duì)魯氏接合酵母的研究主要集中在兩個(gè)方面：一是高滲酵母耐高滲機(jī)理的研究，代謝通路以及基因分子；二是高滲酵母發(fā)酵的應(yīng)用，對(duì)食品的危害以及控制方面等。鄭聃等[3]研究得出釀酒酵母和魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)積累的海藻糖含量均隨著NaCl濃度的升高而遞增，2 種酵母菌胞內(nèi)甘油含量均隨脅迫鹽濃度的增加而上升，在0.9 mol/L NaCl脅迫下胞內(nèi)甘油含量均達(dá)到最高值，當(dāng)NaCl濃度大于0.9 mol/L時(shí)胞內(nèi)甘油含量均有所下降。Tikam等[4]研究發(fā)現(xiàn)在鹽和糖條件下，魯氏接合酵母產(chǎn)生甘油和阿拉伯糖醇，如果糖用作應(yīng)激劑而不是鹽，則D-阿拉伯糖醇高度產(chǎn)生和積累，而甘油濃度保持不變。Hosono[5]研究發(fā)現(xiàn)在15 g/100 mL NaCl溶液條件下，相對(duì)于基本培養(yǎng)基，細(xì)胞膜脂肪酸C16∶1、C18∶1含量增加，C18∶0、C18∶2含量減少，脂肪酸不飽和度降低，麥角甾醇含量增加了2.9 倍，麥角甾醇對(duì)磷脂比率增加了5 倍。Guo Hong等[6]對(duì)不同糖度條件下魯氏接合酵母細(xì)胞總蛋白進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)168 個(gè)蛋白點(diǎn)不同，鑒定出47 個(gè)蛋白點(diǎn)，這些蛋白參與糖代謝、能量代謝、氨基酸代謝等。Wei Yonghua等[7]利用基因組改組獲得高度耐鹽的魯氏接合酵母突變株，其在鹽條件下增強(qiáng)ZrGPD1轉(zhuǎn)錄并降低ZrFPS1的轉(zhuǎn)錄，研究發(fā)現(xiàn)魯氏接合酵母在鹽條件下都依賴(lài)甘油生產(chǎn)的感應(yīng)和抑制促進(jìn)甘油通過(guò)質(zhì)膜擴(kuò)散。此外，對(duì)魯氏接合酵母的應(yīng)用方面也有所研究，利用魯氏接合酵母發(fā)酵生產(chǎn)中間代謝產(chǎn)物以及釀造醬油等。Taing等[8]研究發(fā)現(xiàn)，30%葡萄糖、初始pH 5.0和25 ℃培養(yǎng)溫度時(shí)，魯氏接合酵母發(fā)酵產(chǎn)生的蘋(píng)果酸和琥珀酸量最大。吳雅男[9]研究在不同醬油釀造工藝中分別添加魯氏接合酵母S和S3-2并考察其風(fēng)味物質(zhì)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加酵母組檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和含量均多于空白組，說(shuō)明添加魯氏接合酵母對(duì)醬油的釀造其風(fēng)味物質(zhì)有著重要作用。在含糖量較高的果汁中，較低的水分活度能夠抑制腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)[10]，但高滲酵母能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，從而對(duì)果汁的品質(zhì)造成一定的影響。主要包括以下3 個(gè)方面：1）高滲酵母為適應(yīng)高滲環(huán)境，代謝一些相容性物質(zhì)，如生成強(qiáng)烈的酒精等令人不愉快氣味，引起果汁渾濁，顏色加深，在果汁表面形成菌膜或在果汁底部形成白色沉淀，破壞果汁的感官風(fēng)味并降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11]；2）高滲酵母代謝過(guò)程中產(chǎn)生CO2等氣體，會(huì)引起脹袋脹氣，從而使果汁發(fā)生腐敗，危害消費(fèi)者健康[12]；3）高滲酵母生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)代謝掉糖類(lèi)等固形物質(zhì)，使果汁中的固形物含量降低，果汁中溶質(zhì)的溶解性發(fā)生變化，從而使水分活度升高，致使腐敗菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不合格，造成企業(yè)損失。

近年來(lái)，很多學(xué)者從魯氏接合酵母產(chǎn)生的甘油、海藻糖，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及蛋白質(zhì)方面研究魯氏接合酵母耐高滲的機(jī)理，尚鮮有從魯氏接合酵母在糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的高滲培養(yǎng)條件下所產(chǎn)生的細(xì)胞外、胞內(nèi)全物質(zhì)進(jìn)行研究的報(bào)道。本研究采用頂空固相微萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用對(duì)魯氏接合酵母胞外物質(zhì)檢測(cè)分析，利用硅烷化衍生-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)魯氏接合酵母胞內(nèi)物質(zhì)檢測(cè)分析，可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定酵母生長(zhǎng)OD值，采用主成分分析（principal components analysis，PCA）、正交偏最小二乘方判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）模型進(jìn)行得分分析，對(duì)其物質(zhì)差異性分析，為研究魯氏接合酵母耐高糖滲透壓提供理論依據(jù)；對(duì)酵母胞內(nèi)外代謝指紋分析，從物質(zhì)成分角度闡述魯氏接合酵母耐高滲；此外，本研究對(duì)高糖環(huán)境下食品受到魯氏接合酵母污染的檢測(cè)及其污染控制都有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏接合酵母1130、釀酒酵母2#（Saccharomyces cerevisiae）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院健康食品制造與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室提供。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉（均為分析純）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲基鹽酸鹽、N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MSTFA） 上海源葉生物有限公司；3-辛醇（氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞98%） 日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；吡啶 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純） 四川西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-1700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、120150-T230L氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；MD200-1氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司；YT-CJ-2ND型超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與培養(yǎng)

將保存在甘油管的魯氏接合酵母1130、釀酒酵母2#自然條件下解凍后，置于滅菌后的YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，于28 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。取第1代活化的種子液以2%的接種量接種于滅菌完成的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌液濃度達(dá)到108CFU/mL后，作為種子液待用。分別配制糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%（基本培養(yǎng)條件）、80%（高滲培養(yǎng)條件）的YPD培養(yǎng)基，魯氏接合酵母接種量2%分別接種于2%（記為Z1）、80%（記為Z2）糖的YPD培養(yǎng)基中，釀酒酵母以2%接種量接種于2%糖（記為S1）的YPD培養(yǎng)基中，于28 ℃、120 r/min搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。期間定時(shí)取樣測(cè)OD值，并取對(duì)數(shù)期樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 酵母生長(zhǎng)情況分析

根據(jù)王虎玄等[11]對(duì)魯氏接合酵母生長(zhǎng)的研究，采用YPD平板涂布稀釋法進(jìn)行計(jì)數(shù)，取樣采用紫外分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.3 胞外物質(zhì)的測(cè)定

1.3.3.1 樣品制備與前處理

根據(jù)宋江等[13]測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)。YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)，取4 mL于10 mL離心管中10 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取樣品瓶中，每個(gè)樣品瓶中加入1.2 g氯化鈉、3 μL質(zhì)量濃度為3.267 mg/L的3-辛醇溶液，上機(jī)測(cè)定。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱：DB-17MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為He，流速1.8 mL/min，不分流進(jìn)樣。程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min后以4 ℃/min的速度升溫至120 ℃，再以6 ℃/min的速度升溫至240 ℃，保持9 min。

1.3.3.3 質(zhì)譜條件

電子電離源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

1.3.4 胞內(nèi)物質(zhì)的測(cè)定

1.3.4.1 胞內(nèi)物質(zhì)的淬滅與提取

根據(jù)Kim等[14]測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)。菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取5 mL菌液緩慢加入到含20 mL預(yù)冷（-20 ℃）淬滅試劑（體積分?jǐn)?shù)60%甲醇溶液）的50 mL離心管中，于-20 ℃淬滅30 min，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取出倒掉上清液，用5 mL清洗劑進(jìn)行清洗2 次，離心5 min，去上清液。2.5 mL無(wú)水甲醇（-40 ℃）重懸酵母泥，冷凍3 次，離心5 min，吸取上清液，再加2.5 mL無(wú)水甲醇（-40 ℃），渦旋30 s，離心5 min，合并兩次上清液，氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.3.4.2 胞內(nèi)物質(zhì)的衍生

離心管中淬滅、提取的胞內(nèi)物經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，向每個(gè)離心管中加入100 μL含20 mg/mL甲基鹽酸鹽的吡啶溶液，30 ℃水浴2 h，進(jìn)行污化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，再向每個(gè)樣品中加入100 μL的MSTFA溶液，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.3.4.3 色譜條件

色譜柱：DB-17MS毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度270 ℃，載氣為He，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL，程序升溫：起始溫度150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升溫至270 ℃，保持24 min。

1.3.4.4 質(zhì)譜條件

電子電離源，電子能量為70 eV，離子源溫度為250 ℃，接口溫度為280 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 80～500。

1.3.5 定性與定量

氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定的圖譜，根據(jù)保留時(shí)間、NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和相似度對(duì)檢測(cè)出的各個(gè)物質(zhì)進(jìn)行匹配，相似度大于80的物質(zhì)作為檢測(cè)出物質(zhì)成分進(jìn)行定性分析。胞外物質(zhì)成分根據(jù)加入的3-辛醇含量，計(jì)算檢測(cè)出的各個(gè)物質(zhì)含量，重復(fù)取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel軟件處理，SIMCA-P軟件對(duì)各物質(zhì)做PCA模型、PLS-DA模型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魯氏接合酵母、釀酒酵母生長(zhǎng)期間OD值變化

圖1 酵母生長(zhǎng)期間OD值變化Fig.1 Changes in OD value during yeast growth

由圖1可知，Z2的適應(yīng)期時(shí)間基本在45 h，這與王虎玄等[11]研究的溫度與pH值條件對(duì)魯氏接合酵母生長(zhǎng)影響的研究適應(yīng)趨勢(shì)基本一致，在80%高糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，魯氏接合酵母為了適應(yīng)高滲環(huán)境，會(huì)改變細(xì)胞組成以及產(chǎn)生相容性物質(zhì)抵御高滲環(huán)境帶來(lái)的沖擊。此研究中，滲透壓較高，適應(yīng)時(shí)間在45 h左右，Z2在45～70 h處于緩慢生長(zhǎng)，70～100 h生長(zhǎng)速率較快，此時(shí)期也處于對(duì)數(shù)時(shí)期，后期生長(zhǎng)變慢趨于穩(wěn)定。S1、Z1的適應(yīng)時(shí)間較短，S1在12 h后對(duì)數(shù)期就結(jié)束，生長(zhǎng)較慢趨于穩(wěn)定，Z1的適應(yīng)時(shí)間比S1長(zhǎng)2 h，在24 h后生長(zhǎng)變慢趨于穩(wěn)定，但到穩(wěn)定期時(shí)Z1比S1的OD值高，可以達(dá)到3.01，而S1趨于穩(wěn)定時(shí)OD值為2.78，Z2達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)OD值為2.01。

2.2 胞外物質(zhì)成分分析

表1 S1、Z1、Z2發(fā)酵胞外物質(zhì)成分及其質(zhì)量濃度Table1 Concentrations of extracellular compounds from Z. rouxii and S. cerevisiae mg/L

續(xù)表1 mg/L

續(xù)表1 mg/L

如表1所示，Z2共36 種，其中醇類(lèi)9 種，酯類(lèi)16 種，酸類(lèi)3 種，無(wú)酮類(lèi)物質(zhì)；Z1共47 種，其中醇類(lèi)9 種，酯類(lèi)12 種，酸類(lèi)5 種，酮類(lèi)6 種；S1共45 種，其中醇類(lèi)9 種，酯類(lèi)10 種，酸類(lèi)5 種，酮類(lèi)6 種。在Z2以醇類(lèi)、酯類(lèi)居多，與Z1、S1比較沒(méi)有產(chǎn)生酮類(lèi)化合物。

2.3 胞外物質(zhì)的PCA

根據(jù)已有報(bào)道[15-16]利用PCA、PLS-DA模型對(duì)檢測(cè)物質(zhì)的分析，采用無(wú)監(jiān)督的PCA模型對(duì)S1、Z1、Z2胞外物質(zhì)分析，見(jiàn)圖2。

圖2 S1、Z1、Z2發(fā)酵胞外物質(zhì)PCA圖Fig.2 PCA score plot of extracellular substances from Z. rouxii and S. cerevisiae

軟件自動(dòng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合分析，共獲得2 個(gè)主成分，R2X=0.881，Q2=0.702。由圖2可以觀察到，S1、Z1、Z2分別分布在PCA得分圖不同的區(qū)域，顯示S1、Z1、Z2具有顯著差異。一般來(lái)說(shuō)R2X值大于0.4表示該模型可靠，此研究中PCA的R2X=0.881，因此當(dāng)前PCA模型能可靠地用于解釋S1、Z1、Z2樣本之間的差異性。

2.4 胞外物質(zhì)的PLS-DA分析

采用有監(jiān)督的PLS-DA模型對(duì)S1、Z1、Z2胞外物質(zhì)進(jìn)行更進(jìn)一步分析[17-20]，見(jiàn)圖3。并通過(guò)PLS-DA模型VIP（variable importance in the projection）值（閾值＞1）尋找它們之間的差異物質(zhì)，PLS-DA模型主成分的VIP值如圖4所示。

從圖3可以觀察到，S1、Z1、Z2在得分圖可以完全分開(kāi)，R2=0.996 7，Q2=0.980 7，兩者都接近1，說(shuō)明所建模型可信度高，Z1、Z2在得分圖完全分開(kāi)，說(shuō)明80%糖的高滲透壓與2%糖條件下魯氏接合酵母生長(zhǎng)所產(chǎn)生的物質(zhì)有顯著差異；S1、Z1是在2%糖條件下生長(zhǎng)的不同菌種，兩者也可以分開(kāi)，說(shuō)明不同的菌種也有顯著差異。Z2能夠在高滲透壓下生長(zhǎng)，為了篩選出受高糖滲透壓影響的標(biāo)志性代謝物，選取VIP值大于1的差異變量，并是Z2產(chǎn)生的物質(zhì)，43、44、46、53、51、40和41號(hào)物質(zhì)，即7-辛烯酸乙酯、3-（甲硫基）丙基乙酸酯、2-十三烷醇、十五烷酸-3-甲基丁酯、9-癸烯酸乙酯、3-（甲硫基）-1-丙醇、2-癸醇7 種物質(zhì)，同時(shí)這些醇類(lèi)、酯類(lèi)也賦予了特殊的氣味和風(fēng)味。在高滲培養(yǎng)條件下，為了適應(yīng)高滲環(huán)境，魯氏接合酵母會(huì)產(chǎn)生一些特殊的物質(zhì)來(lái)抵御高滲環(huán)境，主要是醇類(lèi)物質(zhì)，此研究檢測(cè)出3 種醇類(lèi)物質(zhì)。

圖3 S1、Z1、Z2發(fā)酵胞外物質(zhì)PLS-DA圖Fig.3 PLS-DA score plot of extracellular substances from Z. rouxii and S. cerevisiae

圖4 PLS-DA模型主成分的VIP值Fig.4 VIP values of principal components in the PLS-DA model

2.5 胞內(nèi)物質(zhì)成分分析

對(duì)Z1、Z2培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液淬滅、提取、硅烷化衍生后，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用上機(jī)測(cè)樣，根據(jù)NIST 14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各物質(zhì)進(jìn)行匹配，進(jìn)行定性分析，挑選匹配度大于80的物質(zhì)，其分類(lèi)及百分比見(jiàn)表2，Z1、Z2各物質(zhì)成分見(jiàn)表3。

魯氏接合酵母為了適應(yīng)高滲環(huán)境，會(huì)產(chǎn)生一些相容性物質(zhì)使細(xì)胞能夠適應(yīng)高滲透壓環(huán)境，生長(zhǎng)時(shí)期、碳源、氮源不同，產(chǎn)生的物質(zhì)種類(lèi)和含量也會(huì)有差別[21]，主要是一些醇類(lèi)、糖類(lèi)物質(zhì)，還會(huì)有酮類(lèi)物質(zhì)。由表2可以看出，Z2與Z1相比較，物質(zhì)數(shù)量減少，醇類(lèi)物質(zhì)增加了2 種，但百分占比較Z1低，酸類(lèi)物質(zhì)百分占比無(wú)太大變化；酯類(lèi)物質(zhì)Z2比Z1物質(zhì)少了6 種，百分占比降低至13.72%，降低幅度較大，這也說(shuō)明魯氏接合酵母實(shí)際運(yùn)用中，在基本的葡萄糖含量條件下產(chǎn)生的酯類(lèi)種類(lèi)含量較高，在醬油生產(chǎn)中，魯氏接合酵母能夠產(chǎn)生較多的風(fēng)味物質(zhì)[22]；糖類(lèi)種類(lèi)及含量增加，魯氏接合酵母為了適應(yīng)高糖環(huán)境，會(huì)產(chǎn)生海藻糖、中間代謝的麥芽糖及其他糖類(lèi)物質(zhì)，來(lái)抵御外界的高滲環(huán)境，產(chǎn)生的糖類(lèi)物質(zhì)促進(jìn)了魯氏接合酵母在高糖環(huán)境下的生長(zhǎng)，同時(shí)氨基酸百分占比增加。研究結(jié)果表明，Z2產(chǎn)生的醇類(lèi)、糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)物質(zhì)是主要增加的物質(zhì)，Tikam等[4]綜述的魯氏接合酵母對(duì)食品中糖脅迫下的反應(yīng)會(huì)使酵母細(xì)胞產(chǎn)生甘油等醇類(lèi)、海藻糖等糖類(lèi)以及代謝物變化，與本研究相似。表3中Z1、Z2產(chǎn)生的相同物質(zhì)有23 種，Bubnova等[23]研究魯氏接合酵母耐鹽調(diào)節(jié)方式中，檢測(cè)到甘油、海藻糖的含量是動(dòng)態(tài)變化的，但一直存在魯氏接合酵母生長(zhǎng)中，在本研究Z1、Z2產(chǎn)生的不同物質(zhì)中，也檢測(cè)到甘油、海藻糖。產(chǎn)生的麥芽糖也在一定程度上促進(jìn)魯氏接合酵母耐高滲，以麥芽糖為底物，海藻糖在海藻糖合成酶催化下以TreS途徑進(jìn)行生物合成[24]，本研究Z2產(chǎn)生的麥芽糖說(shuō)明海藻糖在高糖環(huán)境下是以TreS途徑合成的海藻糖。Z1、Z2都檢測(cè)到角鯊烯，說(shuō)明兩者都在生長(zhǎng)過(guò)程生成了角鯊烯，但在不同物質(zhì)中，Z1檢測(cè)到了膽固醇，而Z2檢測(cè)到的是羊毛固醇，鯊烯可以與固醇載體蛋白接合，經(jīng)加氧酶、環(huán)化酶催化反應(yīng)，生成羊毛固醇，再經(jīng)一系列氧化、脫羧、還原步驟，生成膽固醇，Z1產(chǎn)生了膽固醇，說(shuō)明此反應(yīng)鏈完整；Z2只產(chǎn)生了羊毛固醇，研究表明，在高糖條件下，膽固醇反應(yīng)鏈被切斷或者還沒(méi)到膽固醇的合成這一步驟，也有可能羊毛固醇這一物質(zhì)能夠抵御高滲環(huán)境，羊毛固醇在此反應(yīng)鏈中積累，而不再進(jìn)行下一步反應(yīng)。Z1產(chǎn)生了尿素、戊二胺、丁二胺等含氮物質(zhì)，Z2并沒(méi)有產(chǎn)生含氮的化合物，高糖滲透環(huán)境下魯氏接合酵母對(duì)氮的代謝有所減弱，說(shuō)明高糖影響了氮代謝。酪氨酸脫氨基可以參與延胡索酸的合成，賴(lài)氨酸參與乙酰CoA的合成，半胱氨酸參與丙酮酸的合成，說(shuō)明在高糖環(huán)境下產(chǎn)生的這些氨基酸間接影響了魯氏接合酵母耐高滲，此外，景天庚酮糖、木糖醇、D-木糖、D-半乳糖也可參與碳水化合物的代謝[25-30]。

表2 Z1、Z2胞內(nèi)物質(zhì)種類(lèi)Table2 Classes of intracellular materials from Z. rouxii

表3 Z1、Z2胞內(nèi)物質(zhì)成分Table3 Comparison of intracellular materials from Z. rouxii under two culture conditions

3 結(jié) 論

在高糖滲透壓下，魯氏接合酵母Z2適應(yīng)期達(dá)45 h，菌體呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)100 h后趨向穩(wěn)定，但生長(zhǎng)穩(wěn)定后，其OD值低于基本培養(yǎng)條件下的OD值。

采用固相微萃取，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)酵母胞外物質(zhì)，高滲培養(yǎng)條件下魯氏接合酵母共有36 種；基本培養(yǎng)條件下魯氏接合酵母共有47 種；基本培養(yǎng)條件培養(yǎng)釀酒酵母共45 種。得到高滲培養(yǎng)條件下魯氏接合酵母的特征性物質(zhì)為7-辛烯酸乙酯、3-（甲硫基）丙基乙酸酯、2-十三烷醇、十五烷酸-3-甲基丁酯、9-癸烯酸乙酯、3-（甲硫基）-1-丙醇、2-癸醇。

采用硅烷化衍生處理，氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)酵母胞內(nèi)物質(zhì)，高糖滲透壓與基本培養(yǎng)條件下魯氏接合酵母產(chǎn)生了27 種不同的物質(zhì)，沒(méi)有產(chǎn)生含氮化合物，氮代謝受到了影響，此外這些物質(zhì)參與糖代謝、能量代謝，其中海藻糖在高糖環(huán)境下是以TreS途徑合成的海藻糖。本研究為后續(xù)研究魯氏接合酵母耐高糖滲透壓提供了理論依據(jù)，對(duì)魯氏接合酵母的檢測(cè)以及控制都有重要的意義，對(duì)于產(chǎn)生的差異性物質(zhì)誘導(dǎo)基因的形成和其耐高滲機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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