荔枝汁中谷蛋白結(jié)構(gòu)及特性

袁星星，余元善，吳繼軍，肖更生，徐玉娟,*，鄒 波

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

荔枝（Litchi chinensis），屬無患子科荔枝屬植物，原產(chǎn)于中國南部，一直以來，中國都是世界上最大的荔枝生產(chǎn)地，由于荔枝適宜生長在熱帶及亞熱帶地區(qū)，因此荔枝主要種植于我國廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地，其中廣東是中國荔枝分布最多的省，據(jù)2016年廣東統(tǒng)計(jì)年鑒[1]，近6年來廣東荔枝產(chǎn)量均處于上升趨勢，僅2015年總產(chǎn)量高達(dá)128.05萬 t。

大量研究表明，荔枝果實(shí)中富含糖分、有機(jī)酸、膳食纖維、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，并含有豐富的多酚和花色苷等生物活性物質(zhì)[2]。由于荔枝成熟期集中且不耐貯藏，故荔枝主要以鮮食為主，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有20%以上的荔枝因腐爛變質(zhì)造成損失[3]，因此荔枝深加工在荔枝產(chǎn)業(yè)中越來越受重視。近年來，國內(nèi)外關(guān)于荔枝的研究主要集中在荔枝活性成分分離鑒定[4]、荔枝褐變[5-7]、荔枝風(fēng)味[3,8-9]等方面，而對(duì)荔枝汁體系不穩(wěn)定現(xiàn)象尚未進(jìn)行深入探討。陳奇[10]、劉爽[11]、陳雪[12]等研究表明酸性蛋白飲料有凝聚沉淀的傾向，原因可能是該酸性蛋白飲料的pH值接近蛋白等電點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白沉淀，致使飲料不穩(wěn)定現(xiàn)象發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)荔枝汁果肉沉淀物的營養(yǎng)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)荔枝汁果肉沉淀物中蛋白質(zhì)含量非常高，約占干質(zhì)量的23%。利用Osborne分級(jí)法對(duì)荔枝蛋白的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的含量組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)谷蛋白所占比例最高，超過72%，因此荔枝蛋白主要為谷蛋白，而谷蛋白水溶性較差，一般溶于稀堿溶液，可初步推斷谷蛋白是導(dǎo)致荔枝汁不穩(wěn)定的重要因素之一[13]。目前，國內(nèi)外關(guān)于谷蛋白的研究主要集中在小麥[14-16]、米糠[17-18]等農(nóng)作物中，分別研究了小麥谷蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)面團(tuán)特性的影響，米糠谷蛋白結(jié)構(gòu)及其功能特性。劉麗等[16]指出，高分子麥谷蛋白亞基與低分子麥谷蛋白亞基通過分子間二硫鍵形成麥谷蛋白聚合體，影響面團(tuán)流變學(xué)特性。關(guān)于荔枝谷蛋白結(jié)構(gòu)及其功能特性的研究鮮見報(bào)道。

本研究擬以荔枝谷蛋白為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析、熱穩(wěn)定性和紅外光譜分析，并測定其表面疏水性、巰基和二硫鍵含量，旨在對(duì)荔枝谷蛋白的結(jié)構(gòu)及特性作探討，為荔枝飲料穩(wěn)定性的進(jìn)一步研究提供參考，同時(shí)也促進(jìn)了荔枝果渣中蛋白質(zhì)的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試?yán)笾χ瓰闊岚褪蠚⒕笾χɑ粗Γ晒銏@食品有限公司提供。

SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 美國MYM生物科技有限公司；甘氨酸（glycine，Gly）、SDS、5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22GIII高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀、Universal HoodII凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；PB-10型pH計(jì) 德國Sartorius公司；UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)有限公司；Kjeltec TM8400自動(dòng)凱氏定氮儀瑞典福斯儀器公司；DSC200F3差示掃描量熱儀 德國耐馳公司；Magna 760紅外光譜儀 美國Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 荔枝汁谷蛋白的制備

參考Horax等[19]提取荔枝汁沉淀物中不同類型蛋白質(zhì)（按溶解特性分）的方法，略作改動(dòng)。稱取10 g荔枝汁沉淀，分別以1∶10（g/mL）加入蒸餾水、1 mol/L的NaCl溶液、體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液和0.1 mol/L的NaOH溶液提取荔枝汁清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，4 ℃、10 000 r/min離心25 min，收集谷蛋白上清液，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH值至等電點(diǎn)，4 ℃、10 000 r/min離心25 min，沉淀再以1∶10（g/mL）加蒸餾水洗滌3 次，收集沉淀，沉淀冷凍干燥后即為荔枝汁谷蛋白樣品，用于指標(biāo)分析。所制得的樣品經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，按換算系數(shù)為6.25計(jì)算，其蛋白質(zhì)含量為（74.89±0.56）%。

1.3.2 荔枝汁谷蛋白等電點(diǎn)的測定

準(zhǔn)確稱取等量的荔枝汁谷蛋白溶液，用0.02 mol/L的HCl溶液分別調(diào)至不同的pH值（1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0），4 ℃、10 000 r/min離心25 min，傾去上清液，將離心管倒扣5 min，稱量離心管沉淀物質(zhì)量。離心沉淀率計(jì)算公式如下[13]：

式中：SR為離心沉淀率；m2為離心后沉淀物的質(zhì)量/g；m1為離心前溶液的質(zhì)量/g。

1.3.3 SDS-PAGE分析

1.3.3.1 樣品處理

稱取1 g荔枝樣品，以1∶10加入蒸餾水洗3 次，加0.25 g交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，再加5 mL蛋白質(zhì)裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲），還原電泳中蛋白質(zhì)裂解液含有40 mmol/L二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)pH值至6.8，4 ℃、12 000 r/min離心25 min，上清液用于SDS-PAGE分析。

1.3.3.2 SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)步驟

參考黎衛(wèi)等[20]的方法，略作改動(dòng)。蛋白樣品加入上樣緩沖液后，沸水浴5 min，冷卻后上樣5 μL，采用5 g/100 mL濃縮膠和10 g/100 mL分離膠進(jìn)行垂直電泳，預(yù)電泳和濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V，待溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距離分離膠下邊緣1 cm左右時(shí)關(guān)閉電源，結(jié)束電泳，染色及脫色步驟均參照SDS-PAGE快速配制試劑盒說明書，脫色后拍照保存。

1.3.4 表面疏水性的測定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考王洪偉等[21]的方法，略作改動(dòng)。取已知濃度的SDS溶液（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L）1 mL，加入20 mL氯仿，混合均勻后加入5 mL亞甲基藍(lán)溶液（0.24 g/L），充分混合均勻，2 500 r/min離心15 min，取底層SDS與亞甲基藍(lán)的混合物，于655 nm波長處測定吸光度。其蛋白質(zhì)的表面疏水性用1 mg蛋白質(zhì)結(jié)合SDS含量（μg/mg）表示。吸光度（y）與SDS濃度（x）的回歸方程為y=4.74x+0.006 8（R2=0.999 2）。

1.3.4.2 表面疏水性的測定

參考王洪偉等[21]的方法，略作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取10 mg蛋白質(zhì)樣品溶解于40 mL SDS溶液（0.1 mmol/L），充分?jǐn)嚢? h，5 000 r/min離心10 min，上清液在蒸餾水中透析36 h后，取1 mL透析液與20 mL氯仿混合均勻，然后在氯仿層中加入5 mL 0.24 g/L亞甲基藍(lán)溶液，充分混合均勻，2 500 r/min離心15 min，取底層SDS與亞甲基藍(lán)的混合物，于655 nm波長處測定吸光度。蛋白質(zhì)表面疏水性的計(jì)算公式如下：

1.3.5 巰基和二硫鍵含量的測定

分別稱取0.05 g蛋白質(zhì)樣品于4 mL Tris-Gly 8 mol/L尿素溶液（pH 8.0），充分?jǐn)嚢? h，10 000 r/min離心10 min，取上清液作為蛋白液樣品，采用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液的蛋白質(zhì)含量。

1.3.5.1 游離巰基含量的測定

參考Hakimia等[22]的方法，略作改動(dòng)。準(zhǔn)確量取1.0 mL蛋白液樣品，加入5.0 mL Tris-Gly 8 mol/L尿素溶液（pH 8.0）和0.04 mL DTNB溶液（4 mg/mL），迅速混合后于25 ℃保溫反應(yīng)25 min，然后在412 nm波長處測定吸光度。游離巰基含量按下式計(jì)算：

式中：73.53為106/（1.36×104），1.36×104為Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；A412nm為波長412 nm處所測得的吸光度；ρ為蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為稀釋因子，對(duì)游離巰基測定中的D值取6.04。

1.3.5.2 總巰基含量的測定

準(zhǔn)確量取0.6 m L的蛋白液樣品，然后加入3.0 mL Tris-Gly 8 mol/L尿素溶液（含40 mmol/L DTT，pH 8.0），混合均勻后于25 ℃保溫反應(yīng)1 h，再加入6 mL 12% TCA，混合均勻后繼續(xù)保溫反應(yīng)1 h，5 000 r/min離心10 min，沉淀物繼續(xù)用12% TCA溶液洗滌，重復(fù)4 次，沉淀加入9.0 mL Tris-Gly 8 mol/L尿素溶液（pH 8.0），然后加入0.09 mL DTNB溶液（4 mg/mL），混勻后于25 ℃保溫反應(yīng)25 min，然后在412 nm波長處測定吸光度?？値€基含量按下式計(jì)算：

式中：D為稀釋因子，對(duì)總巰基含量測定中的D值取16.15。

1.3.5.3 二硫鍵含量的計(jì)算

1.3.6 熱穩(wěn)定性的測定

精確稱取蛋白質(zhì)樣品（5 mg左右）并記錄質(zhì)量，將蛋白質(zhì)均勻地鋪在鋁制坩堝中壓片，然后置于差示掃描量熱儀中進(jìn)行升溫掃描。以空鋁盒為空白對(duì)照，掃描溫度范圍為25～150 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮?dú)饬魉贋?0.0 mL/min。

1.3.7 紅外光譜分析

稱取一定量的蛋白質(zhì)樣品與溴化鉀混合（質(zhì)量比1∶100），用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片，然后于紅外光譜儀中作全波長（400～4 000 cm-1）掃描。利用PeakFit v4.12軟件對(duì)酰胺I帶區(qū)域（1 600～1 700 cm-1）圖譜進(jìn)行分析。先基線校正，然后用Gaussian去卷積，再由二階導(dǎo)數(shù)擬合，確定各個(gè)子峰與各二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，然后根據(jù)各子峰所占面積計(jì)算出各部分二級(jí)結(jié)構(gòu)所占的比例。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0和Origin 8.5軟件進(jìn)行相關(guān)性和線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝沉淀谷蛋白等電點(diǎn)

蛋白質(zhì)由氨基酸組成，其分子表面帶有很多可解離基團(tuán)，如谷氨酸、天冬氨酸殘基中的γ值和β-羧基，賴氨酸殘基中的ε-氨基，精氨酸殘基中的胍基和組氨酸的咪唑基，此外，在肽鏈兩端還有游離的α-氨基和α-羧基，因此，蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)[23]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其游離的正、負(fù)離子相等，凈電荷為零，此時(shí)蛋白質(zhì)沉淀率最大。由圖1可知，在pH值為3.5處，谷蛋白沉淀率達(dá)到最大值14%，根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處溶解度最低原理，因此荔枝谷蛋白等電點(diǎn)pI值為3.5左右。張敏等[18]和王艷玲[24]按照Osbron法提取米糠中4 種蛋白質(zhì)，采用福林-酚法測定4 種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其中谷蛋白的等電點(diǎn)為4.6；郭榮榮等[25]根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)電導(dǎo)率最低的原理分別測定各蛋白液的等電點(diǎn)，其中谷蛋白的等電點(diǎn)也為4.6左右；李小華等[26]采用雙縮脲法測定山毛豆種子4 種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)谷蛋白等電點(diǎn)為3.5～3.8。在pH 4.0左右，荔枝谷蛋白沉淀率較高，當(dāng)pH值大于5.0時(shí)沉淀率顯著降低，因此谷蛋白溶于稀堿溶液。酸性荔枝飲料pH值在4.0左右，因此這也是酸性荔枝飲料穩(wěn)定性差的重要原因之一。

圖1 pH值對(duì)荔枝汁谷蛋白沉淀的影響Fig.1 Effect of pH values on glutelin precipitation in litchi juice

2.2 荔枝谷蛋白SDS-PAGE分析

對(duì)荔枝谷蛋白組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，判斷荔枝谷蛋白組分分子質(zhì)量大小。以Marker中各蛋白遷移率（即比移值，樣品點(diǎn)中心處與點(diǎn)樣處的距離除以展開劑前沿與點(diǎn)樣處的垂直距離）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=-1.039 6x+5.189 4，R2=0.984 8。

由圖2可知，非還原態(tài)條帶明顯比還原態(tài)條帶少，且非還原態(tài)中，117 kDa以上的條帶有3 條，而還原態(tài)只有1 條，非還原態(tài)中，分子質(zhì)量較小的亞基條帶明顯比還原態(tài)少，但不管是非還原態(tài)還是還原態(tài)，谷蛋白亞基分子質(zhì)量大部分處于30～90 kDa，主要集中在50 kDa左右。非還原狀態(tài)下，荔枝谷蛋白約有10 個(gè)條帶，還原態(tài)下約有12 個(gè)條帶，說明荔枝谷蛋白組分復(fù)雜且含有二硫鍵，經(jīng)DTT還原后，某些大分子條帶消失，出現(xiàn)新的小分子條帶。通過對(duì)比荔枝谷蛋白還原態(tài)和非還原態(tài)，可知其亞基分子質(zhì)量大部分都大于50 kDa，說明荔枝谷蛋白分子較大，更易于沉淀，可能是導(dǎo)致荔枝汁體系不穩(wěn)定的原因之一。Wang Zengxuan等[27]研究指出，米糠谷蛋白分子是由多肽鏈彼此通過二硫鍵及疏水作用連接而成，形成大分子蛋白質(zhì)聚合體，導(dǎo)致其溶解性較低，限制了米糠谷蛋白在液態(tài)食品及飲料中的應(yīng)用。

圖2 荔枝汁谷蛋白的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE prof i le of glutelin in litchi juice

2.3 谷蛋白的表面疏水性

SDS是一種蛋白質(zhì)變性劑，然而在極低濃度下，SDS還不足以使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，但其能與蛋白質(zhì)疏水鍵相互作用結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，經(jīng)透析后用氯仿將未結(jié)合的SDS提取出來并與亞甲基藍(lán)結(jié)合，通過測定SDS-亞甲基藍(lán)吸光度的不同反映蛋白質(zhì)表面疏水性基團(tuán)的多少。本研究運(yùn)用SDS法測定荔枝谷蛋白表面疏水性，根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得知荔枝谷蛋白表面疏水性為（74.25±5.26）μg/mg（1 mg的荔枝谷蛋白樣品結(jié)合74.25 μg SDS）。對(duì)比耿瑋蔚等[28]運(yùn)用同樣的方法測定大豆分離蛋白表面疏水性可知，荔枝谷蛋白表面疏水性與經(jīng)2 g/100 mL SDS溶液處理后的表面疏水性相當(dāng)，因?yàn)殡S著SDS質(zhì)量濃度提高，大豆分離蛋白表面疏水性也有不同程度的提高，因此可推斷荔枝谷蛋白表面疏水性大于大豆分離蛋白表面疏水性。王中江等[29]研究表明大豆分離蛋白的表面疏水性在等電點(diǎn)附近出現(xiàn)最大值，其表面疏水性與溶解度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。荔枝汁pH值約為4.5，處于荔枝谷蛋白等電點(diǎn)附近，因此荔枝汁出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象。

2.4 谷蛋白的巰基和二硫鍵分析

蛋白質(zhì)是由氨基酸聚合而成的生物大分子物質(zhì)，二硫鍵等基團(tuán)間的相互作用為蛋白質(zhì)產(chǎn)生維持高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能提供基礎(chǔ)，其中半胱氨酸殘基中的巰基是所有蛋白質(zhì)氨基酸殘基中最活潑的基團(tuán)，在體內(nèi)參與抗氧化、亞硝基化和巰基-二硫鍵交換等多種重要生理反應(yīng)[30]。二硫鍵由半胱氨酸殘基的兩個(gè)硫醇基氧化而成，在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面扮演著重要角色[31]。本研究采用Ellman’s試劑比色法測定荔枝谷蛋白的巰基和二硫鍵，其中游離巰基含量為（29.83±1.72）μmol/g，總巰基含量為（40.59±2.04）μmol/g，二硫鍵含量為（5.38±0.18）μmol/g?？梢娎笾χ鹊鞍字饕杏坞x巰基，其二硫鍵含量較少，結(jié)合圖2，對(duì)比還原前和還原后的荔枝谷蛋白分子質(zhì)量，可知經(jīng)DTT還原后，只有小部分大分子質(zhì)量的條帶消失，說明經(jīng)DTT還原的二硫鍵較少，與該結(jié)果相符。由于在不同環(huán)境下，二硫鍵和游離巰基會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，如半胱氨酸在堿性溶液中易被氧化形成二硫鍵，生成胱氨酸[30]，因此氨基酸組成及排列在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能中也扮演著重要角色。

2.5 谷蛋白的熱穩(wěn)定性分析

差示掃描量熱法是一種熱分析法，在程序控制溫度下，測量輸入到試樣和參比物的功率差（如以熱的形式）與溫度的關(guān)系。本研究采用差示掃描量熱分析荔枝谷蛋白熱穩(wěn)定性，由圖3可知，荔枝谷蛋白的變性溫度為105.24℃，均比王洪偉等[21]研究的麥谷蛋白（66.81 ℃）和青稞谷蛋白（71.28 ℃）以及Adebiyi等[32]研究的米糠谷蛋白（75.4±0.2）℃變性溫度高。對(duì)于蛋白質(zhì)，熱處理（差示掃描量熱檢測）是一個(gè)變性或蛋白質(zhì)展開的過程[19]，變性溫度越大，熱穩(wěn)定性越好，說明荔枝谷蛋白的熱穩(wěn)定性比麥谷蛋白、青稞谷蛋白、米糠谷蛋白好，荔枝汁飲料在熱殺菌過程中可以保持較好的穩(wěn)定性。黎衛(wèi)等[33]研究不同pH值（5.0、7.0、9.0）對(duì)芡實(shí)谷蛋白熱變性的影響，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在pH 5.0時(shí)谷蛋白變性溫度最高，原因可能是谷蛋白等電點(diǎn)在pH 5.0附近，蛋白質(zhì)所帶凈電荷少，凈靜電排斥能量小于其他穩(wěn)定谷蛋白質(zhì)的相互作用的能量，谷蛋白較穩(wěn)定，從而其變性溫度較高[34]。本研究的谷蛋白樣品也是在等電點(diǎn)處制備，有可能導(dǎo)致其變性溫度較高。

圖3 荔枝汁谷蛋白的差示掃描量熱曲線Fig.3 DSC curve of glutelin in litchi juice

2.6 谷蛋白的紅外光譜分析

蛋白質(zhì)在中紅外區(qū)（4 000～400 cm-1）有若干特征吸收峰，其中酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）對(duì)于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最有研究價(jià)值[35]。酰胺I帶一般能反映蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其主要與C＝O的伸縮振動(dòng)有關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的氨基酸殘基間形成的氫鍵較強(qiáng)時(shí)，C＝O的電子云密度較低，僅需提供較少的能量就可以使其振動(dòng)，C＝O的吸收峰向低波數(shù)方向移動(dòng)，接近1 600 cm-1，基于此原理，運(yùn)用紅外光譜分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，其對(duì)應(yīng)關(guān)系如下：β-折疊（1 610～1 640 cm-1）、無規(guī)則卷曲（1 640～1 650 cm-1）、α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）和β-轉(zhuǎn)角（1 660～1 700 cm-1）[21]。

圖4 荔枝汁谷蛋白的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of glutelin in litchi juice

由圖4可知，樣品酰胺I帶有很強(qiáng)的吸收峰，說明樣品蛋白質(zhì)含量非常高。運(yùn)用PeakFit v4.12軟件對(duì)紅外光譜圖酰胺I帶進(jìn)行分析，得知荔枝谷蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主，其中β-折疊占33.92%，β-轉(zhuǎn)角占64.7%，少數(shù)為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。β-折疊是一種具有特定幾何形狀的伸展結(jié)構(gòu)，主要與局部的協(xié)同性氫鍵形成有關(guān)，它也是一種重復(fù)性的結(jié)構(gòu)而且在β-折疊中肽主鏈都處于最伸展的構(gòu)象，其通常較α-螺旋結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，一般β-折疊含量高的蛋白質(zhì)具有較高的變性溫度。β-轉(zhuǎn)角則不同，它是一種非重復(fù)性結(jié)構(gòu)，主要與多肽鏈的彎曲、回折和重新定向有關(guān)，β-轉(zhuǎn)角大多處在蛋白質(zhì)分子的表面，因?yàn)樵谶@里改變多肽鏈方向的阻力比較小，β-轉(zhuǎn)角的存在更有利于蛋白質(zhì)生成結(jié)實(shí)、球狀的結(jié)構(gòu)[36]。目前，由于對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與其宏觀功能性質(zhì)關(guān)系的研究尚存不足，并且蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)本身就很復(fù)雜，加上測定時(shí)較多的影響因素及酰胺I帶各子峰的準(zhǔn)確歸屬上存有的一些爭議[37]，因此僅靠紅外光譜完全解釋二級(jí)結(jié)構(gòu)與宏觀功能性的關(guān)系仍有很大難度。

3 結(jié) 論

本課題組采用Osborne分級(jí)法提取荔枝蛋白并用凱氏定氮法進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)谷蛋白所占比例最高，超過72%。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究荔枝谷蛋白的結(jié)構(gòu)及特性，發(fā)現(xiàn)荔枝谷蛋白分子質(zhì)量較大，主要集中在50 kDa左右，非還原狀態(tài)下主要有10 個(gè)條帶，成分復(fù)雜，經(jīng)還原后，少量大分子條帶消失，小分子條帶增加；谷蛋白等電點(diǎn)pI值為3.5左右；用蛋白樣品結(jié)合SDS的能力表征蛋白質(zhì)的表面疏水特性，得出1 mg的荔枝谷蛋白樣品結(jié)合（74.25±5.26）μg SDS；游離巰基含量為（29.83±1.72）μmol/g，總巰基含量為（40.59±2.04）μmol/g，二硫鍵含量為（5.38±0.18）μmol/g；變性溫度為105.24 ℃。荔枝汁體系偏酸，谷蛋白分子質(zhì)量較大，且谷蛋白在pH 3～5時(shí)溶解性較差，故在制作酸性荔枝飲料時(shí)體系不穩(wěn)定。研究表明，荔枝谷蛋白表面疏水性較大，二硫鍵較少，而其變性溫度高達(dá)105.24 ℃，比其他植物蛋白變性溫度（通常低于100 ℃）高[19]，Kudre等[38]認(rèn)為熱穩(wěn)定性取決于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及相關(guān)結(jié)合力，且一般β-折疊含量高的蛋白質(zhì)具有較高的變性溫度。本研究采用紅外光譜對(duì)荔枝汁谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得出β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為其主要結(jié)構(gòu)，分別占33.92%和64.7%，可知荔枝谷蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)所占比例較低，但谷蛋白變性溫度高達(dá)105.24 ℃，說明僅僅通過紅外光譜解釋蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與其宏觀功能性的關(guān)系仍有較大難度。

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