過表達(dá)長鏈鞘氨醇激酶基因LCB4提高釀酒酵母抑制物耐受性

何艷艷，孜力汗，張寶會(huì)，許建韌，王丹丹，白鳳武

1 大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

2 上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

纖維素燃料乙醇是替代化石資源的可持續(xù)能源之一，與淀粉質(zhì)或糖質(zhì)原料燃料乙醇生產(chǎn)相比，木質(zhì)纖維素作為農(nóng)業(yè)廢棄物原料充足、成本低，因此木質(zhì)纖維素乙醇成為國內(nèi)外生物能源研究的熱點(diǎn)[1]。然而木質(zhì)纖維素原料在預(yù)處理過程中會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)酸類、呋喃類和酚類等副產(chǎn)物[2-3]。這些化合物通過影響酵母細(xì)胞碳代謝過程、增加細(xì)胞膜透性和破壞酶活性等途徑抑制酵母生長和乙醇發(fā)酵[4]?；蚬こ?、隨機(jī)誘變及代謝工程等手段選育高耐受性、高效生產(chǎn)乙醇的工業(yè)釀酒酵母是解決這一問題的主要方法[5-8]。其中DNA重組技術(shù)可以使特定的基因在酵母菌株中過表達(dá)或敲除，是生物育種簡單有效的方法之一。

釀酒酵母中LCB4編碼的長鏈鞘氨醇激酶[9]，位于高爾基體和次級(jí)內(nèi)體[10]，與膜結(jié)構(gòu)相連，調(diào)節(jié)長鏈鞘氨醇-1-磷酸 (Sphingoid long chain base phosphates，LCBPs) 的生物合成[11]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，LCBPs是質(zhì)膜脂類代謝具有生物活性的中間代謝物，可以與G-蛋白受體偶聯(lián)，參與免疫細(xì)胞運(yùn)輸[12]。同時(shí)，LCBPs作為細(xì)胞中的第二信使，參與細(xì)胞增殖、存活、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞骨架形成[13-14]。在酵母中，細(xì)胞受到熱激后，長鏈鞘氨醇 (Sphingolipid long chain bases，LCBs) 作為引起細(xì)胞周期阻滯的信號(hào)分子大量激增，長鏈鞘氨醇激酶通過將LCBs磷酸化為 LCBPs，使處于細(xì)胞周期阻滯狀態(tài)的熱激細(xì)胞恢復(fù)正常[15-16]。然而，目前關(guān)于LCB4基因過表達(dá)與釀酒酵母抑制物耐受性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。因此本文研究了LCB4基因過表達(dá)對(duì)釀酒酵母模式菌株S288C抑制物耐受性的影響，為進(jìn)一步選育高抑制物耐受性乙醇發(fā)酵酵母菌株提供理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌 DH5α，釀酒酵母模式菌株 S288C(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2 培養(yǎng)基

抑制物耐受性檢測固體培養(yǎng)基：YPD固體培養(yǎng)基中分別添加終濃度為10 g/L乙酸、1.5 g/L糠醛和1 g/L香草醛，pH 4.5；抑制物耐受性檢測液體發(fā)酵培養(yǎng)基：在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加終濃度為10 g/L乙酸、3 g/L糠醛和2 g/L香草醛，及其混合添加，pH 4.5。其中LB、YPD、酵母種子培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基詳見文獻(xiàn)[17]。

1.3 構(gòu)建重組菌株S288C-LCB4

利用引物L(fēng)CB4-F和引物L(fēng)CB4-R (引物序列見表 1) 從釀酒酵母 S288C基因組中擴(kuò)增獲得目的基因LCB4，該基因 GenBank登錄號(hào)為NM_001183590.1。將所得LCB4基因片段克隆到pHO整合表達(dá)載體[18]。將驗(yàn)證正確的pHO-LCB4質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶NotⅠ線性化后回收目的條帶，通過電轉(zhuǎn)化法將LCB4基因同源整合到宿主酵母S288C染色體HO位點(diǎn)[19]。通過含G418抗生素 (固體培養(yǎng)基添加300 μg/mL，液體培養(yǎng)基添加100 μg/mL) 的YPD培養(yǎng)基篩選，并經(jīng)富集培養(yǎng)后提取基因組作為模板，利用驗(yàn)證引物L(fēng)CB4-F和PG418-R進(jìn)行PCR初步驗(yàn)證。

1.4 菌種活化、耐受性檢測及乙醇發(fā)酵

1.4.1 菌種活化

將含有空載體的對(duì)照菌株S288C-HO及重組菌株 S288C-LCB4接種至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 重組菌株的耐受性檢測

將活化后的菌液OD620調(diào)至一致 (1.0)，以5倍梯度稀釋為6個(gè)濃度，依次取2 μL菌液點(diǎn)樣于抑制物耐受性檢測平板，30 ℃倒置培養(yǎng)24–36 h，觀察培養(yǎng)過程中菌株生長狀況并拍照，具體方法參見文獻(xiàn)[20]。

1.4.3 抑制物脅迫下的乙醇發(fā)酵

比較對(duì)照菌株S288C-HO和重組菌株S288CLCB4分別在抑制物單一和共同添加下的乙醇發(fā)酵性能。發(fā)酵方法如下：菌株經(jīng)活化后用種子培養(yǎng)基調(diào)節(jié)OD620至1.0，按接種量10% (V/V) 接種到含 90 mL抑制物耐受性檢測發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃、150 r/min條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。每隔6–12 h定時(shí)取樣，測定發(fā)酵液菌體、殘?zhí)呛鸵掖紳舛?，每組進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 發(fā)酵參數(shù)及代謝物的測定

不同抑制物添加下乙醇發(fā)酵過程中發(fā)酵液殘?zhí)菨舛?、乙醇濃度、乙醇得?(YE/CS)、乙醇產(chǎn)率(PE/T) 以及發(fā)酵液代謝物 (甘油、海藻糖和琥珀酸) 測定及分析方法參見文獻(xiàn)[17]。

1.6 RNA提取及實(shí)時(shí)定量分析

利用天根RNAsimple總RNA提取試劑盒分別提取不添加抑制物條件下發(fā)酵過程中對(duì)照菌S288C-HO和重組菌 S288C-LCB4對(duì)數(shù)期細(xì)胞的總RNA。參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄、RT- PCR檢測及基因相對(duì)表達(dá)量的分析。目的基因引物分別為rtLCB4-F和rtLCB4-R；管家基因ALG9作為內(nèi)參，引物分別為rtALG9-F和rtALG9-R[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCB4表達(dá)水平分析及重組菌株抑制物平板耐受性檢測

為研究LCB4基因過表達(dá)能否提高釀酒酵母S288C抑制物耐受性，根據(jù)1.3方法構(gòu)建了LCB4基因過表達(dá)重組菌株 S288C-LCB4。提取酵母轉(zhuǎn)化子基因組 DNA作為模板，用引物 LCB4-F和PG418-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。LCB4全長1 875 bp，PG418-R結(jié)合于其下游G418編碼基因的ORF上，距LCB4的ORF終點(diǎn)500 bp，故驗(yàn)證時(shí)PCR產(chǎn)物理論大小約為2.3 kb，圖1中陽性對(duì)照及目的片段的條帶與該理論值大小相吻合，表明重組菌株S288C-LCB4構(gòu)建成功。

表1 本文所用引物列表Table 1 Primers used in this study

圖1 重組菌株S288C-LCB4的PCR分析驗(yàn)證Fig. 1 Verification of recombinant strain S288C-LCB4 by PCR analysis. M: DNA marker (DL10000); 1: positive control; 2: target fragment (LCB4 + G418); 3: negative control.

取未添加抑制物的發(fā)酵對(duì)數(shù)期重組菌株S288C-LCB4和對(duì)照菌株 S288C-HO細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測，分析LCB4基因在2個(gè)菌株中的表達(dá)量。結(jié)果顯示 (圖2)LCB4基因在S288C-LCB4中的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照菌株的2.9倍，表明LCB4基因在S288C-LCB4中成功過表達(dá)。

進(jìn)一步對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行抑制物耐受性評(píng)價(jià)。檢測了重組菌株與對(duì)照菌株分別在10 g/L乙酸、1.5 g/L糠醛和1 g/L香草醛抑制物平板上的生長狀況，結(jié)果如圖3所示。在添加10 g/L乙酸平板上，對(duì)照菌株在第4個(gè)稀釋梯度基本不生長，重組菌株在第6個(gè)稀釋梯度仍有生長，重組菌株的生長狀況明顯優(yōu)于對(duì)照菌株，乙酸耐受性顯著提高。在1.5 g/L糠醛和1 g/L香草醛單獨(dú)添加下，重組菌株和對(duì)照菌株的生長均受到抑制，但重組菌株生長狀態(tài)較好。

圖2 S2 88C-HO與S288C-LCB4菌株中LCB4基因的表達(dá)量Fig. 2 Comparison of LCB4 expression between recombinant strain S288C-LCB4 and the control strain S288C-HO.

圖3 基因LCB4過表達(dá)對(duì)酵母菌株S288C脅迫耐受性的影響Fig. 3 Effect of LCB4 overexpression on stress tolerance of S. cerevisiae S288C. The yeast cell serial dilutions of 50–5–5 (from left to right) were spotted onto YPD solid medium with 10 g/L acetic acid, 1.5 g/L furfural or 1 g/L vanillin was supplemented and incubated at 30 ℃.

平板耐受性檢測結(jié)果表明，無論添加乙酸、糠醛或香草醛，重組菌株生長的耐受性均高于對(duì)照菌株。因此后續(xù)進(jìn)一步研究了乙酸、糠醛和香草醛單一脅迫下S288C-LCB4的乙醇發(fā)酵性能。

2.2 抑制物脅迫對(duì)重組菌株S288C-LCB4乙醇發(fā)酵過程的影響

2.2.1 重組菌株S288C-LCB4抑制物脅迫下乙醇發(fā)酵性能

乙酸脅迫下重組菌乙醇發(fā)酵性能：從圖 4A看出，在乙醇發(fā)酵過程中，重組菌株S288C-LCB4和對(duì)照菌株S288C-HO于12 h同時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，但重組菌株生長速度更快，菌體濃度高，相比對(duì)照菌株的菌液濃度提高了9.3%。重組菌株葡萄糖消耗速率及乙醇生成速率均高于對(duì)照菌株 (圖4B)，耗糖時(shí)間比對(duì)照菌縮短了12 h，重組菌株乙醇最大濃度為 40.7 g/L (48 h)，比對(duì)照菌株提高了10.5%。表明重組菌株S288C-LCB4在含有10 g/L乙酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長狀態(tài)及乙醇發(fā)酵性能均優(yōu)于S288C-HO。

糠醛脅迫下重組菌乙醇發(fā)酵性能：3 g/L糠醛添加下(圖5A)，重組菌株S288C-LCB4的延遲期比對(duì)照菌株S288C-HO縮短了30 h，且最大菌液濃度比對(duì)照菌株提高了 47.8%。葡萄糖消耗速率及乙醇產(chǎn)率均高于對(duì)照菌株，相比對(duì)照菌株，重組菌株提前42 h消耗完葡萄糖，乙醇最大濃度提高了21.7%，發(fā)酵時(shí)間縮短了30 h (圖5B)。表明在糠醛脅迫下，重組菌株生長及乙醇發(fā)酵性能均明顯優(yōu)于對(duì)照菌株，LCB4基因過表達(dá)提高了酵母細(xì)胞對(duì)糠醛的耐受性。

香草醛脅迫下重組菌乙醇發(fā)酵性能：S288CLCB4與S288C-HO在2 g/L香草醛脅迫下乙醇發(fā)酵情況如圖 6所示。重組菌株比對(duì)照菌株提前24 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，且最大菌體濃度提高了59.3%。重組菌株耗糖速率顯著提高，最大乙醇濃度比對(duì)照菌提高了56.2%，且發(fā)酵時(shí)間縮短了44 h。重組菌株S288C-LCB4香草醛耐受性顯著增強(qiáng)。

圖4 釀酒酵母S288C-HO與S288C-LCB4在10 g/L乙酸添加下的生長 (A)、殘?zhí)羌耙掖紳舛?(B) 的變化Fig. 4 The profiles of cells growth, residual sugar and ethanol during ethanol fermentation by S. cerevisiae S288C-HO and S288C-LCB4 when 10 g/L acetic acid was supplemented. (A) Growth curves. (B) Residual sugar and ethanol production.

圖5 釀酒酵母S288C-HO與S288C-LCB4在3 g/L糠醛添加下的生長 (A)、殘?zhí)羌耙掖紳舛?(B) 的變化Fig. 5 The profiles of cells growth, residual sugar and ethanol during ethanol fermentation by S. cerevisiae S288C-HO and S288C-LCB4 when 3 g/L furfural was supplemented. (A) Growth curves. (B) Residual sugar and ethanol production.

重組菌株在抑制物脅迫下乙醇發(fā)酵性能比較：重組菌株S288C-LCB4與對(duì)照菌株S288C-HO在乙酸、糠醛和香草醛脅迫下乙醇得率和乙醇產(chǎn)率如表2所示。乙酸、糠醛和香草醛脅迫下重組菌株乙醇得率比對(duì)照菌株分別提高 7.7%、22.6%和 87.0%，乙醇產(chǎn)率分別提高 34.9%、85.4%和330.8%，其中2 g/L香草醛脅迫下重組菌株乙醇得率和乙醇產(chǎn)率提高最為明顯。重組菌株提高了菌株在乙酸、糠醛和香草醛脅迫下的乙醇發(fā)酵效率，表明LCB4基因過表達(dá)提高了重組菌的乙酸、糠醛和香草醛的脅迫耐受性。

2.2.2 重組菌株在抑制物脅迫下發(fā)酵液中代謝物的變化

上述研究表明，相比對(duì)照菌株重組菌株S288C-LCB4乙酸、糠醛和香草醛的耐受性顯著提高。為研究重組菌株耐受性提高的機(jī)制對(duì)發(fā)酵液中與抑制物耐受性相關(guān)的代謝物進(jìn)行了檢測(甘油、海藻糖和琥珀酸)，結(jié)果如圖7所示。

在10 g/L乙酸脅迫下，重組菌株發(fā)酵液中甘油、琥珀酸和海藻糖的含量分別比對(duì)照菌株提高了32.7%、39.7%和 6.9%。乙酸的存在會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)環(huán)境酸化，細(xì)胞需要更多的ATP將H+泵出細(xì)胞來維持胞內(nèi)正常的 pH[23-24]。琥珀酸含量的提高，促進(jìn)細(xì)胞TCA循環(huán)產(chǎn)生了更多的 ATP。甘油是乙醇發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物，大部分存在于細(xì)胞膜，具有保護(hù)細(xì)胞的作用[25]。海藻糖不僅對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，并且有助于提高釀酒酵母乙酸耐受性[26-27]。表明細(xì)胞需要更多的ATP和保護(hù)性物質(zhì)來應(yīng)對(duì)乙酸對(duì)細(xì)胞的毒性，因此LCB4過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生更多的甘油、琥珀酸來提高菌株對(duì)乙酸的耐受性。

圖6 釀酒酵母S288C-HO與S288C-LCB4在2 g/L香草醛添加下的生長 (A)、殘?zhí)羌耙掖紳舛?(B) 的變化Fig. 6 The profiles of cells growth, residual sugar and ethanol during ethanol fermentation by S. cerevisiae S288C-HO and S288C-LCB4 when 2 g/L vanillin was supplemented. (A) Growth curves. (B) Residual sugar and ethanol production.

表2 抑制物脅迫下LCB4基因過表達(dá)對(duì)釀酒酵母S288C乙醇得率和產(chǎn)率的影響Table 2 Impact of LCB4 overexpression on ethanol yield and productivity of S. cerevisiae S288C with inhibitors supplemented

重組菌株在3 g/L糠醛脅迫下，其甘油、琥珀酸和海藻糖的含量分別比對(duì)照菌株提高了21.5%、52.6%和 33.2%。糠醛抑制糖酵解途徑和TCA循環(huán)，降低細(xì)胞內(nèi)NAD(P)H濃度，造成細(xì)胞 ROS的積累導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷[6-7]。細(xì)胞通過降低細(xì)胞生長速率將NADPH和ATP用于細(xì)胞修復(fù)而使細(xì)胞進(jìn)入漫長的延遲期[4]。琥珀酸的增加可以促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ATP和NADPH，用于細(xì)胞損傷后修復(fù)和生長消耗，NADPH可以提供還原力將糠醛還原為糠醇，達(dá)到解毒效果，琥珀酸還可以參與到 γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA)途徑，減弱糠醛造成的ROS積累[28]。甘油不僅具有保護(hù)細(xì)胞的作用，還能在糠醛脅迫下維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡[25]。海藻糖的提高能在糠醛脅迫下維持細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的穩(wěn)定性[29]。表明細(xì)胞需要更多的還原力來應(yīng)對(duì)糠醛對(duì)細(xì)胞的毒性，因此LCB4過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生更多的琥珀酸來提高菌株對(duì)糠醛的耐受性。

與對(duì)照菌株相比，在 2 g/L香草醛脅迫下重組菌株的甘油、琥珀酸和海藻糖的含量分別提高了19.1%、64.5%和60.8%。香草醛會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，破壞線粒體，通過抑制核糖體組裝而影響翻譯，細(xì)胞內(nèi)以NAD(P)H為輔因子的還原酶可以將香草醛轉(zhuǎn)化成香草醇，降低香草醛的毒性[30]。香草醛脅迫下，琥珀酸的生成促進(jìn)了TCA循環(huán)產(chǎn)生更多的 NAD(P)H作為香草醛轉(zhuǎn)化成香草醇的還原力，且琥珀酸能夠降低ROS的積累。海藻糖作為酵母細(xì)胞內(nèi)的能量儲(chǔ)藏物質(zhì)，在環(huán)境脅迫下通過水解，為蛋白質(zhì)復(fù)性和香草醛還原提供能量[29]。因此LCB4過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生更多的琥珀酸和海藻糖來提高菌株對(duì)香草醛的耐受性。

圖 7 抑制物對(duì)重組菌株S288C-LCB4乙醇發(fā)酵胞外代謝物的影響Fig. 7 Impact of inhibitors on extracellular metabolites of S. cerevisiae S288C-LCB4 during ethanol fermentation.

綜上所述，基因LCB4過表達(dá)后，使菌株分泌更多的保護(hù)性物質(zhì)甘油和海藻糖，增加代謝中間物琥珀酸的含量，通過維持細(xì)胞pH平衡、維持氧化還原平衡或?qū)⒁种莆镛D(zhuǎn)化為低毒物質(zhì)，從而提高細(xì)胞對(duì)抑制物 (乙酸、糠醛和香草醛) 的耐受性。

2.2.3 抑制物混合添加對(duì)重組菌株乙醇發(fā)酵性能的影響

以上研究結(jié)果表明，重組菌株 S288C-LCB4在乙醇發(fā)酵過程中對(duì)乙酸、糠醛和香草醛耐受性均優(yōu)于對(duì)照菌株 S288C-HO。而實(shí)際纖維素水解液中存在抑制物種類較多且成分復(fù)雜，因此在單一乙酸、糠醛和香草醛添加實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，初步研究了乙酸、糠醛和香草醛混合添加對(duì)重組菌株生長及乙醇生成的影響 (圖 8)。重組菌株在單一抑制物和混合抑制物脅迫下的細(xì)胞生長和乙醇生成均低于對(duì)照空白組。與單一抑制物添加相比，抑制物混合添加后重組菌生長和乙醇生成幾乎完全被抑制，而乙酸、糠醛和香草醛單獨(dú)添加時(shí)達(dá)到最大菌體濃度與對(duì)照組基本接近，乙醇生成分別比對(duì)照組低 6.4%、21.2%和 13.5%。因此相比于對(duì)照組，乙酸、糠醛和香草醛對(duì)重組菌生長的影響基本一致，而 3種抑制物混合添加對(duì)重組菌生長的抑制率接近90%，表明乙酸、糠醛和香草醛3種抑制物混合添加對(duì)重組菌株 S288C-LCB4的生長存在一定的協(xié)同抑制作用。

圖8 10 g/L乙酸、3 g/L糠醛和2 g/L香草醛及其混合添加對(duì)重組菌S288C-LCB4生長及乙醇生成的影響Fig. 8 The profiles of cells growth and ethanol of S. cerevisiae S288C-LCB4 when 10 g/L acetic acid，3 g/L furfural, 2 g/L vanillin and their mixture were supplemented respectively.

3 結(jié)論

釀酒酵母中LCB4編碼長鏈鞘氨醇激酶，參與細(xì)胞周期阻滯狀態(tài)熱激細(xì)胞的恢復(fù)。通過DNA重組技術(shù)將LCB4在釀酒酵母S288C中進(jìn)行過表達(dá)。對(duì)重組菌株S288C-LCB4進(jìn)行了抑制物耐受性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)S288C-LCB4能夠提高釀酒酵母在含10 g/L乙酸、1.5 g/L糠醛和1 g/L香草醛平板的耐受性。在含10 g/L乙酸、3 g/L糠醛和2 g/L香草醛的液體發(fā)酵中，重組菌株S288C-LCB4的乙醇得率比對(duì)照菌株分別提高了 7.7%、22.6%和87.0%，乙醇發(fā)酵產(chǎn)率提高了 34.9%、85.4%和330.8%。研究結(jié)果表明基因LCB4過表達(dá)使重組菌株在3種抑制物脅迫下，通過生成更多的保護(hù)性物質(zhì)，通過維持細(xì)胞pH平衡、氧化還原平衡、生物大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或?qū)⒁种莆镛D(zhuǎn)化為低毒的物質(zhì)，提高重組菌S288C-LCB4對(duì)乙酸、糠醛和香草醛的耐受性。該研究為選育高耐受性、高效生產(chǎn)乙醇的工業(yè)釀酒酵母提供了新的研究方向和參考依據(jù)。

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