新型扁桃酸消旋酶的基因挖掘和性能表征

周茂志，唐存多，許建和，郁惠蕾

1 華東理工大學 生物工程學院 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237

2 南陽師范學院 昆蟲生物反應器河南省工程實驗室，河南 南陽 473061

光學純化合物可廣泛應用于醫(yī)藥、香精香料和特殊化學品等制造行業(yè)，其合成需求日益增加。在現(xiàn)代有機化學制造過程中，部分單一構型化學品的合成仍然具有挑戰(zhàn)性[1]。近年來有機催化、金屬催化與生物催化技術的進步推動了光學純化合物的制備，其中外消旋體的催化動力學拆分仍然是工業(yè)制備手性化學品的主要方式之一[2]。然而，此類傳統(tǒng)的動力學拆分方法存在明顯的缺陷，即單個對映體的理論得率最高為50%。研究人員從過程經(jīng)濟性和綠色環(huán)保的角度考慮，提出了一種理論得率可達到100%的拆分途徑，即動態(tài)動力學拆分或稱作去消旋化。動態(tài)動力學拆分結合傳統(tǒng)動力學拆分和原位消旋化兩種方法將外消旋形式的底物完全轉化成單一構型的目標產(chǎn)物，理論得率可達到100%，同時省去反應中間體的分離步驟[3-5]。相比于化學法原位消旋化過程，酶促消旋化反應的條件更加溫和，往往在常溫常壓及中性pH環(huán)境下完成，可以避免縮合、重排等副反應發(fā)生，在工業(yè)應用中可能更具優(yōu)勢[6-7]。消旋酶(Racemase) 是催化互為對映異構體的兩種化合物之間相互轉化的酶類，屬于異構酶家族，酶學分類號為EC 5.1.X.X。盡管目前所報道的消旋酶種類非常有限，但其在合成中的應用前景不可忽視。

扁桃酸消旋酶 (EC 5.1.2.2) 可催化扁桃酸對映異構體之間的相互轉化[8-11]。2012年奧地利生物有機化學家Faber K.教授報道了由扁桃酸脫氫酶、氨基酸脫氫酶與扁桃酸消旋酶級聯(lián)催化的一鍋煮反應，從外消旋扁桃酸出發(fā)直接制備獲得光學純L-苯甘氨酸，最終產(chǎn)物得率高達 94%，ee值大于97%[12]。該級聯(lián)反應條件溫和、選擇性高，成為L-苯甘氨酸及其衍生物合成的一條新途徑[13]。所得產(chǎn)物可用于合成β-內酰胺類抗生素及抗血小板類藥物，在醫(yī)藥工業(yè)有著重要價值。因此進一步挖掘和研究新的扁桃酸消旋酶資源，對于拓寬上述多酶級聯(lián)反應的催化效率和應用范圍具有重要意義。文中以文獻報道的唯一扁桃酸消旋酶序列[4]為探針，通過基因數(shù)據(jù)挖掘方法尋找新型的扁桃酸消旋酶，并研究其酶學性質和催化動力學。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器

扁桃酸(Mandelic acid，MA) 與鄰氯扁桃酸(2-chloromandelic acid，2-Cl MA) 由江西科苑生物藥業(yè)有限公司提供，分析純；間氯扁桃酸與對氯扁桃酸由本實驗室制備，純度>97%；異丙醇購自迪馬科技有限公司，色譜純。如非特殊說明，實驗用其他試劑和材料均來源于市售，試劑純度均為分析純；消旋酶催化反應的進度通過島津LC-2100A高效液相色譜分析檢測；蛋白濃度通過BCA試劑盒與BioTek Power Wave XS2酶標儀結合測定；核酸濃度定量使用ThermoFisher紫外分光光度計NanoDrop ND-2000測定。

1.1.2 菌株與質粒

所用的菌種和質粒由本實驗室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉 10 g/L；調節(jié) pH至 7.0，在 121 ℃滅菌20 min。在液體 LB培養(yǎng)基中加入 1.5%-2%的瓊脂配成固體培養(yǎng)基，相同條件滅菌使用。

1.2 方法

1.2.1 扁桃酸消旋酶的基因挖掘與篩選

本文以扁桃酸為目標底物，尋找對其有活力的消旋酶。文獻調研發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)報道的對此類底物有消旋活力的只有來源于惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaATCC 12633扁桃酸消旋酶PpMR (Uniprot登錄號P11444)。本研究以該酶作為探針，將其蛋白序列在 NCBI數(shù)據(jù)庫中進行 BLASTp。為保證序列多樣性，挑選與探針序列相似性在20%-60%左右的候選序列作為待克隆蛋白，這些序列功能上并沒有經(jīng)過詳細注釋和驗證。對虛擬篩選得到的序列分別進行克隆和誘導表達。

考察粗酶催化底物轉化的情況，1 mL反應體系(2 mL圓底離心管) 如下：1 mmol/L單一構型的扁桃酸或鄰氯扁桃酸，100 μL上清酶液，3.3 mmol/L MgCl2·6H2O，840 μL Tris-HCl 緩沖液 (pH 7.5，100 mmol/L)?；靹蛑髮? mL離心管置于振蕩器上，30 ℃、1 000 r/min反應12 h，加入適量2 mol/L硫酸終止反應，然后再用等體積的乙酸乙酯萃取處理后的反應液，14 000 r/min離心2 min吸取上層有機相液體，加入少許無水硫酸鈉干燥8 h以上，干燥結束后樣品經(jīng)離心過濾處理，通過液相色譜法檢測底物轉化情況。綜合比較目標蛋白的催化效率和表達情況，選擇最優(yōu)的消旋酶進行進一步實驗。

1.2.2 重組消旋酶的純化

本實驗選擇pET28a作為原核表達載體，該質粒在表達目的蛋白過程中可在蛋白 C端或 N端引入多聚組氨酸純化標簽，基于親和層析原理利用HisTrap預裝柱 (GE Healthcare) 可直接一步捕獲重組菌體破碎上清的目標蛋白。因為該酶在活性中心含有金屬離子，純化時選擇Tris-HCl緩沖體系。純化過程主要由4個步驟組成：漂洗、平衡、上樣和洗脫；洗脫收集的樣品經(jīng)過SDS-PAGE分析選擇電泳純度較高的樣品進行透析換液，獲得的純酶低溫儲存用于該酶的性質表征。

1.2.3 分析方法及扁桃酸消旋酶純酶活力的測定

扁桃酸消旋酶純酶活力的測定是通過反應檢測產(chǎn)物的生成速率計算其活力。1 mL反應體系應包括100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液 (pH 7.5)、2 mmol/L底物、3.3 mmol/L鎂離子、適量純酶。30 ℃、1 000 r/min離心，反應特定的時間，終止反應分析產(chǎn)物的生成量，計算其比活力。

采用液相色譜法分析反應過程中底物的轉化和產(chǎn)物的生成量。所用檢測條件：色譜柱為CHIRALCEL?OJ-H (4.6 mm×250 mm)，檢測波長228 nm，柱溫 30 ℃；流動相為正己烷/異丙醇(92∶8，V/V)，添加1‰三氟乙酸；流速為1 mL/min。(R)-扁桃酸出峰時間為21.5 min，(S)-扁桃酸出峰時間為 24.9 min，(R)-鄰氯扁桃酸出峰時間為21.4 min，(S)-鄰氯扁桃酸出峰時間為26.4 min。

1.2.4 扁桃酸消旋酶最適溫度及溫度穩(wěn)定性

測定不同溫度下該酶的催化效率，反應體系如下 (1 mL)：2 mmol/L (R)-扁桃酸、3.3 mmol/L MgCl2·6H2O和適量純酶，HEPES緩沖體系；在1 000 r/min、不同溫度 (20、30、40、50、60 ℃)下反應15 min后，加硫酸酸化終止反應，等體積乙酸乙酯萃取，離心后吸取上層置于通風廚中揮干，加入異丙醇溶解并干燥處理樣品，液相分析反應結果，從而計算不同溫度下該酶的催化活力。

將純酶液用 HEPES緩沖液稀釋成合適的濃度，在30 ℃、40 ℃、50 ℃下分別保溫，不同的時間點取樣，按1.2.3所述方法進行殘余活力的測定。研究其相對活力與時間的進程關系，以未保溫前的活力為基準點100%。對相對活力取對數(shù)與時間關系進行擬合，計算不同溫度下扁桃酸消旋酶催化活性的半衰期。

1.2.5 扁桃酸消旋酶最適pH的研究

配置不同pH的緩沖液，包括pH 4.0-6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、pH 6.0-7.0磷酸鹽緩沖液、pH 7.5-9.0 Tris-HCl緩沖液、pH 9.0-11.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液等?？疾觳煌?pH環(huán)境中該酶的催化活力，按如下反應體系 (1 mL)∶2 mmol/L(R)-扁桃酸、3.3 mmol/L MgCl2·6H2O 和適量純酶，不同pH緩沖液補足至1 mL，置于30 ℃、1 000 r/min反應 15 min后加 2 mol/L硫酸終止反應，按照1.2.3所述方法，分析該酶在不同pH緩沖條件中的活力。

1.2.6 添加劑對扁桃酸消旋酶活力的影響

反應體系中加入數(shù)種不同的添加劑進行該酶的催化反應，體系內組分如下：2 mmol/L (R)-扁桃酸、適量純酶，添加劑1 mmol/L，Tris-HCl緩沖體系；30 ℃反應10 min，終止反應，處理和分析樣品；計算不同添加劑環(huán)境下的催化活力，考察添加劑對該酶活力的影響。

1.2.7 扁桃酸消旋酶對其他底物的活力

考察該酶對不同底物的活性，反應底物濃度同為2 mmol/L，測活及分析方法參見1.2.3。

1.2.8 扁桃酸消旋酶催化動力學研究

對4種不同的底物[(R)-扁桃酸、(S)-扁桃酸、(S)-鄰氯扁桃酸、(R)-鄰氯扁桃酸]進行動力學的研究，按照酶動力學研究標準方法，設定不同的底物濃度值，測定反應速率和時間的關系。采用Origin擬合動力學曲線，得到所對應的催化動力學常數(shù)，包括表征酶與底物親和力的米氏常數(shù)Km與最大反應速率Vmax，從而計算出酶針對不同分子的催化轉換速率常數(shù)kcat值。

2 結果與分析

2.1 扁桃酸消旋酶的克隆表達與功能篩選

目前唯一報道的扁桃酸消旋酶是來源于惡臭假單胞菌的PpMR，經(jīng)數(shù)十年的研究其分子結構和催化機理已經(jīng)得到充分的解析[11-15]。PpMR催化扁桃酸消旋反應的轉換頻率 (kcat值) 約為500 s-1，其米氏常數(shù)(Km值) 約為1 mmol/L，是目前研究高pKa值羥基羧酸酶促去質子化作用的經(jīng)典催化劑范本[16-18]。

通過基因挖掘的手段[19]，成功克隆得到28個目標蛋白 (表 1)。SDS-PAGE分析所表達的蛋白大小都在 40 kDa左右，與數(shù)據(jù)庫預測的大小一致。對目標蛋白的功能篩選發(fā)現(xiàn)其中存在9個蛋白 (Bj2、Ar、Eb2、Tf2、Ar2、Eb1、St3、Bj7、Cl) 可催化扁桃酸的消旋反應，但當以單一構型的鄰氯扁桃酸為底物時，只有兩個酶蛋白 (Ar、Bj2)可檢測到催化活性，但Bj2只轉化很少量的底物，而且表達量低、可溶性很差。與探針PpMR酶的綜合性能相比，來源于Agrobacterium radiobacter的扁桃酸消旋酶ArMR具有更好的可溶性表達和催化活力 (表2)，因此我們選擇ArMR酶作為進步一研究的對象。其他8個扁桃酸消旋酶也增加了該類酶資源的有用文獻信息，為今后深入考察此類扁桃酸消旋酶打下了一定基礎。

2.2 扁桃酸消旋酶ArMR的純化

基于親和層析的原理，通過Ni-NTA對ArMR進行純化，獲得純度較高的純化酶用于該酶的酶學性質表征。如圖1所示，SDS-PAGE清楚地展示了該酶的表達與純化效果，可見大腸桿菌異源表達的ArMR酶部分可溶 (泳道1、3)，但沉淀部分仍有可觀量的包涵體蛋白有待進一步復性利用。純化所得到的酶 (泳道 5) 條帶足夠清晰單一，符合酶學特性表征的要求。測定純酶活力，對 (R)-扁桃酸的比活為320 U/mg。

2.3 扁桃酸消旋酶ArMR的表征

2.3.1ArMR的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

在本實驗中，研究最適溫度和溫度穩(wěn)定性所選用的是pH 7.5的HEPES緩沖液，因為Tris-HCl緩沖液的pH受溫度影響較大。溫度對ArMR酶活力的影響如圖2所示。隨著溫度的上升，該酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最適宜溫度是50 ℃。在30 ℃和40 ℃時，相對活力約為50%和70%，但當溫度降到20 ℃時只有20%左右的相對活力。在高溫如60 ℃情況下，仍然能有70%的相對活力。

表1 扁桃酸消旋酶的基因克隆與表達Table 1 Cloning and expression of mandelate racemase

表2 ArMR與PpMR粗酶催化鄰氯扁桃酸消旋化的性能比較Table 2 Comparison between ArMR and PpMR cell-free extracts for racemization of (S)-2-chloromandelate

圖1 扁桃酸消旋酶ArMR蛋白純化SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of purified ArMR. lane M:low molecular weight protein marker; lanes 1 & 3: cell lysate supernatant of recombinant ArMR; lanes 2 & 4:cell lysate precipitate of recombinant ArMR; lane 5: the purified ArMR.

圖2 溫度對酶ArMR活力的影響Fig. 2 Effects of temperature on the activity of purified ArMR.

不同溫度下熱穩(wěn)定性考察結果表明，ArMR純酶在 30 ℃、40 ℃與 50 ℃下的半衰期分別為70.7、27.2和 0.17 h。最適溫度研究表明該酶在50 ℃時催化反應的效果最佳，可其半衰期僅為12 min，可能會限制未來該酶的實際應用，因此ArMR的熱穩(wěn)定性還存著較大的提升空間。

2.3.2ArMR催化消旋化的最適pH

如圖3所示，pH對該酶的活力有明顯影響，整體趨勢呈現(xiàn)鐘罩狀。在pH 6以下的酸性環(huán)境中基本沒有消旋活力，因為該酶催化機理符合雙堿機制，由典型的兩個堿性氨基酸殘基催化質子的得失[14]，推測較酸性的環(huán)境不利于質子轉移，明顯降低催化活性。在堿性 pH范圍內該酶活力有較好的接納范圍，甚至在pH為10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中仍然保留著10%以上的相對活力。ArMR在pH 8左右的Tris-HCl緩沖液中表現(xiàn)出最大的活力。

2.3.3 金屬離子及EDTA對ArMR活性的影響

考察了 11種不同添加劑，主要是考察二價金屬離子對ArMR催化活力的影響。添加劑濃度設定為1 mmol/L，結果如表3所示。除了Zn2+對該酶有完全的失活作用，其他添加劑的影響較小。二價鎂離子和錳離子對酶有部分的激活作用，其他金屬離子包括二價鐵離子、銅離子和鈷離子等對酶活基本無影響。在體系中添加1 mmol/L的EDTA進行保溫，結果發(fā)現(xiàn)仍保留86%的相對活力。

圖3 pH對酶ArMR活力的影響Fig. 3 Effects of pH on the activity of purified ArMR.

表3 添加劑對ArMR活力的影響Table 3 Effects of metal ions and EDTA on ArMR activity

2.3.4ArMR對其他底物的相對活性

測定ArMR純酶對不同底物的相對活力結果，比較其對不同底物的活力與PpMR的差異。結果如表4所示，可見這兩個扁桃酸消旋酶在底物的偏好性上有明顯的差異。PpMR對對氯扁桃酸活力要好于間氯扁桃酸[20]；相比于扁桃酸，該酶對間氯扁桃酸的相對活力有所下降。而ArMR對間氯和對氯底物的活力都比扁桃酸要好，同時對間氯底物的活性要高于對氯扁桃酸。兩者的共同之處在于它們對鄰氯扁桃酸的消旋化活力仍然嚴重偏低，不及扁桃酸的千分之一，未來需要通過定點突變[21]等技術加以改造。由于這兩個酶的蛋白序列一致性只有57%，因此在催化的底物專一性上出現(xiàn)一定差異也就不難理解。

2.3.5ArMR的催化動力學常數(shù)

選擇 4種不同的底物進行動力學考察，即(R)-扁桃酸、(S)-扁桃酸、(R)-鄰氯扁桃酸和 (S)-鄰氯扁桃酸。反應體系如下：不同濃度的該底物，3.3 mmol/L鎂離子，添加適量的ArMR純酶，緩沖液濃度為Tris-HCl緩沖液 (100 mmol/L，pH 7.8)，在30 ℃、1 000 r/min振蕩器上反應若干時間，測定該酶催化不同濃度底物的反應初速度。利用Origin軟件對不同底物濃度的反應初速度進行非線性擬合，求得Km和Vmax值，根據(jù)所添加的純酶濃度計算酶的轉化頻率 (kcat值)，如表5所示。

表4 PpMR與ArMR對不同底物的相對活力Table 4 Relative activities of Ar MR and PpMR toward different substrates

表5列出ArMR催化4種不同底物的動力學參數(shù)，ArMR對扁桃酸的Km值在1 mmol/L左右，對R型底物的kcat為 410 s–1，對S型底物的kcat為218 s–1。催化R/S兩種不同構型扁桃酸的最大反應速度分別為 582、310 μmol/(min?mg)。同時該酶對鄰氯扁桃酸的Km值約為6 mmol/L，對R型鄰氯扁桃酸的kcat值為0.22 s–1，對S型鄰氯扁桃酸的kcat為0.23 s–1。催化R/S兩種不同構型鄰氯扁桃酸的最大反應速度分別為 0.31、0.33 μmol/(min?mg)，kcat/Km值分別為 0.034 L/(mmol·s) 和 0.036 L/(mmol·s)。而PpMR純酶催化兩種不同構型鄰氯扁桃酸的kcat/Km分別為 0.060 L/(mmol·s) 和 0.056 L/(mmol·s)，PpMR純酶的催化效率稍稍高于ArMR[22]。

表5 ArMR對不同底物的動力學參數(shù)測定Table 5 Kinetic constants of ArMR towards different substrates

3 討論

計算機信息技術的進步使生物科學同樣步入了大數(shù)據(jù)時代，這大大加速了生物信息學的發(fā)展，基因和蛋白數(shù)據(jù)庫容量得到飛速提高。如何在浩瀚的生物信息海洋中快速定位獲得所需要的信息，是目前生物資源更充分利用所遇到的難題。針對類似問題，新的數(shù)據(jù)挖掘技術應運而生?；蚪M挖掘 (Genome mining) 利用已知的探針在基因和蛋白質數(shù)據(jù)庫中進行序列比對和分析，能夠快速挖掘到研究所需的目的序列。NCBI數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)已存儲數(shù)萬條完整的微生物基因組序列，其中含有大量未被發(fā)現(xiàn)的新酶。在生物信息學工具的輔助下，如多序列比對與同源序列查找等，本研究利用文獻報道的來自于惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaATCC 12633中的扁桃酸消旋酶PpMR為探針，在數(shù)據(jù)庫中進行目標序列的虛擬篩選，利用分子生物學手段進行異源克隆表達，以目標底物扁桃酸和鄰氯扁桃酸進行功能篩選，成功克隆得到9個新型的扁桃酸消旋酶，豐富了 α-羥基酸類手性化合物消旋酶的品種數(shù)目，為未來深入研究此類手性合成工具酶提供了便利和參考。針對底物扁桃酸和鄰氯扁桃酸，對催化性能較好的消旋酶ArMR進行了表征，并測定了動力學和熱力學等理化特征參數(shù)。結合新型的酶促外消旋化和傳統(tǒng)合成技術的去消旋化過程，可望滿足化學工業(yè)發(fā)展的綠色化需求，而該酶對非天然底物的催化活力，顯示其可用于拓展合成L-苯甘氨酸及其衍生物的酶促級聯(lián)反應，有望發(fā)展成為合成重要非天然氨基酸類化合物的新途徑。

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