一種體外皮膚腐蝕性試驗(yàn)替代方法的建立

羅飛亞，張露勇，邢書霞，王鋼力

(中國食品藥品檢定研究院，北京　100050)

近年，隨著動(dòng)物福利和動(dòng)物保護(hù)的“3R”(減少Reduction、優(yōu)化Refinement、替代Replacement)原則的提出，以及世界范圍內(nèi)化妝品及化學(xué)品動(dòng)物試驗(yàn)禁令的推行[1-5]，在毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)領(lǐng)域中，動(dòng)物替代檢測(cè)技術(shù)受到特別的關(guān)注[6-10]。大鼠經(jīng)皮電阻試驗(yàn)(transcutaneous electrical resistance test，TER)是利用大鼠背部離體皮膚檢測(cè)腐蝕性，與傳統(tǒng)的家兔試驗(yàn)相比，TER減少動(dòng)物數(shù)量、減輕動(dòng)物痛苦，符合“3R”原則[11-12]。目前國內(nèi)對(duì)該方法的建立和使用報(bào)道還較少[13-14]，本研究在參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD) 化學(xué)品安全性檢測(cè)指南的基礎(chǔ)上，對(duì)TER結(jié)果判定的程序進(jìn)行改良和驗(yàn)證。該方法在2017年8月被國家食品藥品監(jiān)督管理總局納入《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)[15]，作為化妝品用化學(xué)原料皮膚腐蝕性的替代檢測(cè)方法[16]。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar種大鼠，鼠齡18～21 d，體重60～80 g，由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心提供【SCXK(京)2014-0013】。動(dòng)物試驗(yàn)環(huán)境條件為屏障環(huán)境【SYXK(京)2016-0004】，溫度22～24℃，相對(duì)濕度50%～70%，動(dòng)物自由飲食，日光燈12 h照明。大鼠皮膚應(yīng)健康無破損，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境中至少適應(yīng)3 d。

1.1.2試劑

從OECD推薦的參考物質(zhì)及實(shí)驗(yàn)室常用皮膚腐蝕性化妝品原料中選擇了16種已知皮膚腐蝕性的化學(xué)物質(zhì)作為受試物，包括：4-氨基-1,2,4-三氮唑(TCI)、丁子香酚(國藥集團(tuán)北京分公司)、溴乙基苯(Alorich)、四氯乙烯(國藥集團(tuán)北京分公司)、異硬脂酸(Adamas)、4-甲硫基-苯甲醛(TIC)、異丙醇(國藥集團(tuán)北京分公司)、月桂酸(國藥集團(tuán)北京分公司)、十二烷基硫酸鈉(SDS, 20% w/v, Sigma)、N,N-二甲基亞二丙基三胺(Adamas)、鄰叔丁基苯酚(TCI)、氫氧化鉀(10% w/v，國藥集團(tuán)北京分公司)、硫酸(10% w/v，國藥集團(tuán)北京分公司)、辛酸(國藥集團(tuán)北京分公司)、1,2-丙二胺(國藥集團(tuán)北京分公司)、丙烯酸(國藥集團(tuán)北京分公司)。以鹽酸(10 mol/L、8 mol/L)作為陽性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照。同時(shí)，去離子水作為溶劑，配制電解液(154 nmol/L MgSO4)、羅丹明B染料(10% w/v SRB)、染料萃取液(30% w/v SDS)。

1.1.3儀器

大鼠經(jīng)皮電阻儀委托北京華清天禧醫(yī)藥科技有限公司研制，儀器參數(shù)符合OECD指南要求(工作電壓220 V，50 Hz，交流電，工作電極為2根216惰性銀電極)，皮膚固定裝置選用聚四氟乙烯參照OECD指南裝置示意圖及尺寸要求制作[11]。

1.2　方法

1.2.1大鼠經(jīng)皮電阻儀24 h穩(wěn)定性

選取同一只Wistar大鼠(29 d)背部靠近脊柱兩側(cè)的皮膚，將皮膚固定于蠟板上，剃除被毛及多余的脂肪組織，制成直徑約20 mm的小皮片5～6塊，將小皮片表皮面向上固定在聚四氟乙烯管末端，剪去多余皮膚。在24 h內(nèi)分別選取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、20、22、23和24 h的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)大鼠皮片進(jìn)行電阻值(TER)讀數(shù)，該過程重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.2大鼠經(jīng)皮電阻試驗(yàn)[11-12]

選用22 d齡的Wistar雄性大鼠，剃去背部和兩側(cè)被毛，間隔3 d以含抗生素溶液浸洗去毛區(qū)2次，第29天時(shí)犧牲大鼠(大鼠犧牲時(shí)間必須在第28～30天內(nèi))，剪取去毛區(qū)皮膚，小心剔除皮下脂肪，表皮面向上以膠圈固定于大鼠經(jīng)皮電阻儀的皮膚固定裝置上(聚四氟乙烯管)，剪去多余皮膚。試驗(yàn)前向管內(nèi)加入1 mL硫酸鎂溶液(154 mmol/L)，接上電極測(cè)定TER值，大于20 kΩ者可用。

液體受試物150 μL直接加入管內(nèi)皮片的表皮面，固體受試物先研磨成細(xì)粉，取足量(約100 mg)撒在皮片上，再加150 μL去離子水潤濕。加樣的皮片室溫靜置24 h后以流水輕柔地沖洗以去除受試物，用洗瓶向皮片表面滴加足量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，5 s后去除乙醇，再以流水清洗。盡量去除凈受試物后，向管內(nèi)加入1 mL硫酸鎂溶液，接上電極測(cè)定TER值。記錄TER值后，去除管中的硫酸鎂溶液，肉眼檢查并紀(jì)錄皮片的損傷情況。

1.2.3羅丹明B(SRB)染料滲透量測(cè)定

向管內(nèi)皮片表面滴加150 μL 10% SRB水溶液，室溫靜置2 h，以流水輕柔的沖洗皮片，去除多余的SRB，小心的將皮片取下，放入含8 mL雙蒸水的離心管中輕柔震搖5 min，換干凈的雙蒸水重復(fù)清洗1次，將皮片放入5 mL 30%的SDS水溶液中，60℃水浴提取過夜，去除皮片，剩余提取液以1900 r/min離心8 min(相對(duì)離心力175g)，取上清液1 mL加4 mL30% SDS溶液至5 mL，測(cè)吸光值(λ= 565 nm)。

1.2.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)方案

標(biāo)準(zhǔn)方案S：按OECD TG430的判定程序，TER > 5 kΩ為非腐蝕性(NC)；對(duì)于TER ≤ 5 kΩ且肉眼觀察皮片有明顯損傷判為腐蝕性(C)；TER ≤ 5 kΩ且肉眼觀察皮片沒有明顯損傷的進(jìn)行染料滲透量測(cè)定；染料滲透量大于或等于10 mol/L鹽酸的為C，染料滲透量小于10 mol/L鹽酸的為NC。

調(diào)整方案A：程序同方案S，而判定界值改為15 kΩ。

調(diào)整方案B：TER>15 kΩ為NC，TER<5 kΩ且肉眼觀察皮片有明顯損傷判定為C；TER為5 ～15 kΩ且肉眼觀察皮片未見明顯損傷的，或3個(gè)平行樣的TER值在界值(5、15 kΩ)上下波動(dòng)的或肉眼可見皮片明顯破損、變色、變硬等可疑情況，需進(jìn)行染料滲透量測(cè)定，染料滲透量大于或等于10 mol/L鹽酸的為C，染料滲透量小于10 mol/L鹽酸的為NC。

調(diào)整方案C：程序同方案S，而染料滲透量判定標(biāo)準(zhǔn)為8 mol/L鹽酸。

調(diào)整方案D：程序同方案A，而染料滲透量判定標(biāo)準(zhǔn)為8 mol/L鹽酸。

關(guān)于“名從主人”原則在實(shí)施時(shí)遇到的問題，李捷、何自然有專文談到五點(diǎn)對(duì)策：一、音從主人；二、音、義從主（即音意結(jié)合的翻譯）；三、音、形從主（即不譯照搬）；四、形從主人（原文照搬，但發(fā)音按目的語讀）；五、重命名（例如北京航空航天大學(xué)譯為Beihang University）。[2]這番討論說明“名從主人”不止和音譯相關(guān)。

調(diào)整方案E：程序同方案B，而染料滲透量判定標(biāo)準(zhǔn)為8 mol/L鹽酸。

1.2.5實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)

在實(shí)驗(yàn)室建立TER試驗(yàn)方案后，選取11種參考物質(zhì)發(fā)送至另外4家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行TER檢測(cè)，其中3家實(shí)驗(yàn)室使用本實(shí)驗(yàn)室相同的大鼠經(jīng)皮電阻儀，1家實(shí)驗(yàn)室使用自主研發(fā)的大鼠經(jīng)皮電阻儀[17]。收集4家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)并統(tǒng)一以方案B的判定標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果，對(duì)比各實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1　大鼠經(jīng)皮電阻儀24 h儀器穩(wěn)定性結(jié)果

正常大鼠皮片TER值變化如圖1所示，在皮片置于皮膚固定裝置后2～10 h內(nèi)，TER值明顯降低，24 h后穩(wěn)定在15～30 kΩ。3次重復(fù)試驗(yàn)TER值變化趨勢(shì)一致。

2.2　TER各方案腐蝕性結(jié)果判定及真實(shí)性分析

依據(jù)不同的判斷方案，采用TER方法對(duì)16種參考物質(zhì)進(jìn)行腐蝕性判斷，結(jié)果如表1所示，參考物質(zhì)的腐蝕性強(qiáng)弱與TER值存在一定關(guān)聯(lián)性。TER值越高，其腐蝕性越弱。陰性對(duì)照(雙蒸水)TER平均值為18.36 kΩ，符合OECD操作指南的參考數(shù)據(jù)(10～25 kΩ)，陽性對(duì)照10 mol/L鹽酸的TER平均值3.93 kΩ，8 mol/L鹽酸的TER平均值3.35 kΩ，略高于OECD的參考數(shù)據(jù)(0.5～1.0 kΩ)。OECD操作指南的標(biāo)準(zhǔn)判定方案規(guī)定當(dāng)TER > 5 kΩ時(shí)，且皮片肉眼觀察無明顯損傷，受試物直接判定為非腐蝕性。在本研究中，大鼠經(jīng)皮電阻儀的讀數(shù)均偏高，很多腐蝕性參考物質(zhì)的TER值大于5 kΩ且肉眼觀察皮片無損傷，但是通過羅丹明B染色后，染料滲透量大于陽性對(duì)照組的染料滲透量，符合OECD對(duì)羅丹明B染色結(jié)果腐蝕性的判定。此外，OECD指南中指出如采用新的儀器檢測(cè)，可能會(huì)改變判定界值，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，基于本研究所使用的大鼠經(jīng)皮電阻儀，對(duì)判定程序進(jìn)行了調(diào)整，設(shè)定了方案A-E，通過比較不同方案的真實(shí)性指標(biāo)(表2所示)，并將幾種方案的判定結(jié)果經(jīng)過配對(duì)x2檢驗(yàn)與這16種參考物質(zhì)的實(shí)際皮膚腐蝕性數(shù)據(jù)相比，方案B和C差異均無顯著性(P> 0.05)。以B方案的效能最高，特異性為66.7%，敏感性為100%，具有一致性(Kappa=0.64)。綜上，僅以TER值是否小于5 kΩ判斷受試物的腐蝕性是不夠的，進(jìn)行第二步羅丹明B染色是必要的；除非肉眼觀察到皮片損傷，否則應(yīng)結(jié)合羅丹明B染色結(jié)果判定受試物的腐蝕性。

綜上所述，經(jīng)額下入路手術(shù)切除鞍結(jié)節(jié)腦膜瘤的總體療效較好，術(shù)后復(fù)發(fā)率較低。對(duì)于腫瘤直徑較大、手術(shù)切除程度低的患者應(yīng)警惕復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。

表1　參考物質(zhì)腐蝕性結(jié)果的對(duì)比Tab.1　Comparison of the results of reference chemical skin corrosiveness

注：C：腐蝕性；NC：非腐蝕性；各受試物經(jīng)皮腐蝕性為UN GHS目錄中基于體內(nèi)數(shù)據(jù)判定的結(jié)果；No：未觀察到皮片損傷；Yes：觀察到皮片損傷；-：未測(cè)定。

Note.C: Corrosive. NC: None corrosive. The corrosions were obtained from UN GHS catalog based oninvivoresults.[18]No：There is no obvious damage on skin slice. Yes：There is obvious damage on skin slice.-:Untested.

表2　各判定方案對(duì)大鼠經(jīng)皮電阻試驗(yàn)結(jié)果判定的真實(shí)性指標(biāo)分析(%)Tab.2　The authenticity characteristics analysis for TER results by using different program interpretations(%)

注:*: 所有結(jié)果與各受試物參考腐蝕性數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。

Note.*. All results compared with the reference corrosive parameters of the tested substance.

2.3　實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果

收集各實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，統(tǒng)一采用方案B對(duì)各11種參考物質(zhì)的腐蝕性進(jìn)行判定，結(jié)果如表3所示。其中實(shí)驗(yàn)室1～4采用的大鼠經(jīng)皮電阻儀均為北京華清天禧公司提供的儀器，實(shí)驗(yàn)室5為自主研發(fā)的大鼠經(jīng)皮電阻儀[17]。實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果顯示，丁子香酚、異丙醇和20% SDS均有假陽性結(jié)果出現(xiàn)，鄰叔丁基苯酚有假陰性結(jié)果出現(xiàn)，其余參考物質(zhì)的皮膚腐蝕性判定一致并與參考物質(zhì)本身的腐蝕性相符，所有參考物質(zhì)在5個(gè)實(shí)驗(yàn)室中的判定一致率為72.7%。其中20% SDS在所有實(shí)驗(yàn)室中均檢測(cè)為假陽性，可能是TER方法對(duì)該表面活性劑類物質(zhì)過度判斷。對(duì)各實(shí)驗(yàn)室判定結(jié)果進(jìn)行一致率兩兩對(duì)比(表4)，各實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一種參考物質(zhì)的腐蝕性判定一致率在72.7%～90.9%，說明實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性較好。各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與參考物質(zhì)的腐蝕性數(shù)據(jù)經(jīng)過配對(duì)x2檢驗(yàn)差異均無顯著性(P> 0.05)，說明各實(shí)驗(yàn)室對(duì)參考物質(zhì)的腐蝕性判定結(jié)果可靠。

表3　皮膚腐蝕性實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果Tab.3　The skin corrosiveness results of different laboratories

注：C：皮膚腐蝕性；NC：非皮膚腐蝕性。*: 各受試物經(jīng)皮腐蝕性為UN GHS目錄中基于體內(nèi)數(shù)據(jù)判定的結(jié)果。

Note. C. corrosive to skin; NC. non-corrosive to skin.*.The results were obtained from UN GHS catalog based oninvivoresults. (UN GHS 2007)[18]

表4　實(shí)驗(yàn)室間一致率比對(duì)結(jié)果分析(%)Tab.4　The reproducibility analysis for TER results between different laboratories

3　討論

皮膚腐蝕性/刺激性是化妝品安全性評(píng)價(jià)中較為重要的毒理學(xué)終點(diǎn)之一，OECD操作指南中皮膚刺激性/腐蝕性的替代試驗(yàn)只有3類：大鼠經(jīng)皮電阻試驗(yàn)(OECD TG 430)[11]、體外皮膚腐蝕性/刺激性的重組人表皮模型試驗(yàn)(OECD TG 431/439)[19-20]和體外皮膚腐蝕性膜屏障試驗(yàn)(OECD TG 435)[21]。與傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)[14、22]相比，TER方法減少動(dòng)物用量，減輕動(dòng)物痛苦，符合動(dòng)物倫理3R原則；與其他OECD認(rèn)可的替代試驗(yàn)相比，TER方法具有操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)成本低、試驗(yàn)材料容易獲取等優(yōu)點(diǎn)。TER方法更適宜用于大量粗篩腐蝕性強(qiáng)的物質(zhì)，但對(duì)腐蝕性強(qiáng)弱無法量化評(píng)級(jí)。

根據(jù)OECD TG430的標(biāo)準(zhǔn)，判定受試物是否為非腐蝕性的標(biāo)準(zhǔn)為電阻值(TER)大于5 kΩ，然而在實(shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，使用本課題研發(fā)的大鼠經(jīng)皮電阻儀，檢測(cè)陽性物質(zhì)的電阻值往往大于5 kΩ，且肉眼很難分辨皮片是否需要進(jìn)行染料滲透量測(cè)定，該結(jié)果與大鼠經(jīng)皮電阻儀讀數(shù)范圍相關(guān)。在OECD操作指南中[11]，對(duì)大鼠經(jīng)皮電阻儀的參數(shù)要求為惠斯通電橋，使用正弦或方波交流電頻率為50～1 000 Hz，但實(shí)際在儀器研發(fā)中發(fā)現(xiàn)，交流電頻率會(huì)影響讀數(shù)的穩(wěn)定及讀數(shù)范圍[17]，而OECD規(guī)定的電流頻率較廣，雖然本實(shí)驗(yàn)中所使用的經(jīng)皮電阻儀各項(xiàng)參數(shù)均符合OECD的指南要求，但檢測(cè)出的電阻值讀數(shù)仍會(huì)出現(xiàn)偏高的情況。另一方面，OECD指南內(nèi)也指出可根據(jù)儀器適當(dāng)調(diào)整判斷界值，因此建議在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立TER試驗(yàn)方法時(shí)，應(yīng)通過檢測(cè)參考物質(zhì)的電阻值，并分析實(shí)驗(yàn)室內(nèi)參考物質(zhì)和對(duì)照組的數(shù)據(jù)，適當(dāng)調(diào)整判斷基準(zhǔn)。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)研制的大鼠經(jīng)皮電阻儀，經(jīng)過現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析，認(rèn)為應(yīng)在TER讀數(shù)為5～15 kΩ且肉眼未觀察到明顯破損時(shí)，不省略羅丹明B染色的步驟，應(yīng)結(jié)合染料滲透量的結(jié)果進(jìn)一步確證受試物的腐蝕性，如有必要還可進(jìn)行病理研究，觀察皮膚被腐蝕的程度，以支持腐蝕性的結(jié)果判斷。但目前只能說對(duì)于本研究使用的16種參考物質(zhì)有效，對(duì)于其他化學(xué)物質(zhì)的腐蝕性判斷是否合適，或是否有更合理的判定標(biāo)準(zhǔn)，仍需擴(kuò)大研究范圍。在選取參考物質(zhì)時(shí)，應(yīng)同時(shí)考慮化學(xué)物質(zhì)的理化性質(zhì)(有機(jī)酸、無機(jī)酸、液體、固定、表面活性劑等)、是否具有明確的腐蝕性數(shù)據(jù)、是否是可購買到的常規(guī)試劑，力求盡可能具有代表性。

OECD推薦的陽性對(duì)照物為10 mol/L鹽酸，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)10 mol/L鹽酸容易造成皮片破裂而無法進(jìn)行陽性對(duì)照組的染色，影響受試物染料滲透量的判定，因此可增加不會(huì)蝕穿皮膚的最高鹽酸濃度(如本研究的8 mol/L鹽酸組)作為陽性對(duì)照組。此外，大鼠皮片的質(zhì)量控制及其在染毒的24 h內(nèi)所處環(huán)境的濕度可能影響皮片狀態(tài)，從而影響TER值的讀數(shù)，這些方面仍有待進(jìn)一步研究。

(致謝：感謝北京市藥檢所[23]、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院、廣東省疾病控制中心、中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心參與協(xié)助進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)檢測(cè)。感謝國家食品藥品監(jiān)督管理總局對(duì)本研究的支持。)