1α,25(OH)2D3對大鼠關節(jié)軟骨細胞蛋白聚糖和蛋白聚糖酶代謝的調節(jié)作用

官劍，譚啟釗，趙振達，劉忠軍，宋純理，冷慧杰

(北京大學第三醫(yī)院骨科，北京　100191)

骨性關節(jié)炎是一種慢性發(fā)展的炎癥性疾病，雖然在過去十幾年里，人們對骨性關節(jié)炎的了解越來越深，但其精確的病理機制仍然不是很清楚。蛋白聚糖損耗引起的關節(jié)軟骨侵蝕是導致骨性關節(jié)炎的重要病理機制之一[1]。蛋白聚糖廣泛分布于所有結締組織中，其通過形成糖胺聚糖與核心蛋白共價結合。聚蛋白聚糖(aggrecan)是一種主要的蛋白聚糖，其核心蛋白包含三個球形結構域和一個大擴展區(qū)組成。經硫酸軟骨素和硫酸角質素修飾后的蛋白聚糖通過與軟骨組織水合，為軟骨提供抗壓縮和彈性性能[2]。蛋白聚糖酶和基質金屬蛋白酶能降解關節(jié)軟骨基質中的蛋白聚糖及二型膠原。ADAMTS-4/5分別為aggrecan的兩種水解酶aggrecanase-1/2，aggrecanase-1/2在蛋白聚糖的降解中發(fā)揮至關重要的作用[3]。骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨一旦磨損，幾乎不可修復。但有文獻表明，在骨關節(jié)炎早期，蛋白聚糖水解是可逆的，而且保持蛋白聚糖的完整性可以防止膠原纖維被水解，選擇性的蛋白聚糖酶抑制劑將發(fā)揮全面的保護軟骨作用通過抑制蛋白聚糖和膠原破壞[4]。因此，蛋白聚糖的保護對于抑制甚至修復骨性關節(jié)炎至關重要。此外，蛋白聚糖的代謝與炎癥因子密切相關。據研究顯示，將TNF-α、IL-1α和IL-1β注射至小鼠關節(jié)處能抑制軟骨細胞蛋白聚糖的合成[5]。在大鼠顳下頜關節(jié)滑膜成纖維細胞中，TNF-α刺激能抑制蛋白聚糖的合成[6]。在培養(yǎng)的軟骨移植組織中，IL-1β刺激能抑制蛋白聚糖的水解[7]。

維生素D(VD)是一種類固醇激素，在許多靶組織中發(fā)揮多種生物學功能，VD最終活性形式是1α,25(OH)2D3。VD的基礎功能是調節(jié)鈣磷穩(wěn)態(tài)和骨代謝[8]。此外，VD能影響軟骨、軟骨下骨、以及關節(jié)周圍的肌肉的成分與結構狀態(tài)[9]?？赡苡捎诹餍胁W對人群的篩選困難很大，目前流行病學尚沒有確切的證據證實VD對關節(jié)炎的治療作用。但有一系列研究證據表明VD對關節(jié)的保護作用。VD對骨關節(jié)炎軟骨中的軟骨細胞具有直接影響，而血清VD水平與骨關節(jié)炎軟骨的損失有重要相互關系[10]。VD缺乏可能促進膝骨關節(jié)炎的發(fā)展[11]。VD通過與其受體結合誘導一系列下游信號級聯反應，VD缺乏加大骨關節(jié)炎的誘發(fā)風險，可能導致軟骨厚度的降低[12]。最近證據表明VD在介導炎癥降低的過程中，發(fā)揮關鍵的免疫調節(jié)作用，其在T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞中均有表達[13]。我們的前期實驗研究表明，1α,25(OH)2D3可以影響軟骨細胞基質金屬蛋白酶和潤滑素的分泌[14]，并可以通過作用于TGF-β1，調節(jié)關節(jié)軟骨Ⅱ型膠原的表達和降解[15]。因此，本研究旨在探討1α,25(OH)2D3是否能夠調節(jié)蛋白聚糖的代謝平衡來保護軟骨細胞抵抗炎癥損傷。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物

實驗所用軟骨細胞取自2～3周的SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠(n=10，45～50 g)，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供【SCXK(京)2016-0041】。

1.1.2試劑和設備

1α,25(OH)2D3(Selleck，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Procell，中國)雙抗(Gibco，美國)。甲苯胺藍試劑(中國醫(yī)藥集團，中國)；CCK-8試劑盒(Biosharp，中國)；II型膠原抗體(Abcam，英國)；Trizol(Aidlab，中國)；HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)(Vazyme，中國)；ADAMTS4抗體(Abcam，英國)；ADAMTS5抗體(Abcam，英國)；Aggrecan抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，中國)；GAPDH抗體(杭州賢至生物有限公司，中國)；流式細胞儀(BD Biosciences，美國)；倒置顯微鏡(Thermo，美國)；實時熒光定量PCR儀(Thermo，美國)；酶標儀(Thermo，美國)。

1.1.3實驗分組

將軟骨細胞分為12組，進行組間比較。分組具體包括(表1)：無任何處理的對照組，正常低VD(10 nmol/L)組，正常高VD(100 nmol/L)組，IL-1α誘導組，IL-1α誘導+VD(10 nmol/L)組，IL-1α誘導+VD(100 nmol/L)組，IL-1β誘導組，IL-1β誘導+VD(10 nmol/L)組，IL-1β誘導+VD(100 nmol/L)組，TNF-α誘導組，TNF-α誘導+VD(10 nmol/L)組，TNF-α誘導+VD(100 nmol/L)組。實驗進行前，先用無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h(過夜)，再進行藥物干預24 h，所有實驗至少重復3次。

表1　軟骨細胞實驗分組Tab.1　Groups of chondrocytes in the study

1.2　方法

1.2.1軟骨細胞分離、培養(yǎng)與鑒定

取SD大鼠安樂死，用75%乙醇浸泡5 min，移至超凈工作臺內。仰臥固定大鼠，剪開腿部皮膚，打開膝蓋，無菌切取雙側膝關節(jié)軟骨，放入含雙抗的PBS緩沖液中，將組織切成1 mm3小塊。PBS清洗組織2遍，加入0.2% II型膠原酶，37℃水浴搖床消化4～6 h。隨后加入大鼠關節(jié)軟骨細胞完全培養(yǎng)基稀釋消化液，吸管輕輕吹打至液體中無大塊組織；300 g離心5 min后棄上清，保留細胞與組織沉淀。用大鼠關節(jié)軟骨細胞完全培養(yǎng)基重懸細胞與組織，接種于多聚賴氨酸預先包被的培養(yǎng)皿中，于37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，3天后首次換液，以后每3 d換液一次。利用甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫熒光實驗進行軟骨細胞鑒定。具體方法細節(jié)請參考我們已發(fā)表的研究[16]。原代軟骨細胞會隨著代數增加發(fā)生去分化現象，失去正常表型，本實驗所用細胞為前3代軟骨細胞。

1.2.2軟骨細胞增殖活性測定

取處于對數生長期、生長狀態(tài)良好的大鼠軟骨細胞，用DMEM/F12培養(yǎng)基調整細胞密度至6.0×104/mL接種于96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，37℃培養(yǎng)過夜(在細胞孔周圍孔內加入100 μL無菌PBS)。用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進行饑餓處理12 h。每組3個復孔，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃恒溫培養(yǎng)4 h。在450 nm波長處使用酶標儀測定各組軟骨細胞的吸光度值，來反映軟骨細胞的增殖活性。

1.2.3軟骨細胞凋亡水平的測定

使用annexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測軟骨細胞凋亡水平。收集細胞，0.5 mL binding buffer重懸細胞，再用5 μL annexinV-FITC混勻后加入5 μL PI染色液混勻。室溫避光反應5～10 min(同時設陰性對照，即正常細胞不加annexin和PI；陽性對照1，只加5 μL Annexin V；陽性對照2，只加5 μL PI，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，)。使用流式細胞儀上機檢測，激發(fā)波長為488 nm，由630 nm的帶通濾光片接收，通過FSC/SSC散點圖收集細胞，分析PI熒光直方圖上凋亡細胞百分率。

1.2.4軟骨細胞中aggrecan、ADAMTS-4、ADAMTS-5 mRNA表達水平的檢測

取1 mL Trizol裂解液加入到細胞沉淀中，反復輕柔吹打，裂解細胞。再將細胞裂解液移至新的無RNase的1.5 mL EP管中，室溫放置5 min。加入0.2 mL氯仿，搖勻15 s，4℃、12 000 r/min離心15 min，將上層水相(約400 μL)轉移入另一EP管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10 min。4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入1 mL預冷的75%乙醇洗滌沉淀，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清。重復此步驟一次?？諝庵懈稍颮NA沉淀5～10 min，將沉淀溶于20 μL DEPC水中。取2 μL RNA溶液，使用核酸微量測定儀檢測A260、A280以及A260/A280值，計算RNA的純度和濃度。根據A260/A280比值，估測RNA質量，比值在1.8～2.0之間滿足實驗要求。根據吸光光度值按下列公式計算樣品RNA的濃度：總RNA濃度(μg/μL)=A260×40×10-3。按照逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作，對aggrecan、ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA水平進行檢測。aggrecan、ADAMTS-4、ADAMTS-5的引物由天一輝遠生物科技有限公司(武漢，中國)合成，GAPDH為內參，2-ΔΔCT用于計算相對表達量。反應體系為20 μL,每組實驗設置3個復孔。引物序列如表2。

表2　引物序列Tab.2　Primer sequences

1.2.5軟骨細胞中aggrecan、ADAMTS-4、ADAMTS-5蛋白表達水平的檢測

使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白樣品濃度用于western blot分析。分別制備10%的分離膠和5%的濃縮膠，測完蛋白含量后，根據計算好的上樣量上樣。以80 V恒壓進行電泳，待樣品進入分離膠后，增加電壓至120 V恒壓電泳，大約2 h，電泳至溴酚藍抵達分離膠底部，斷開電源。以240 mA電流，4℃進行電轉膜120 min。洗凈的硝酸纖維素膜在5%的BSA/TBST封閉液中室溫封閉1 h。分別添加一抗aggrecan、ADAMTS-4、ADAMTS-5和GAPDH，搖床上4℃過夜。室溫TBST洗膜3次，每次10 min。添加相應二抗，搖床上室溫孵育60 min。室溫TBST洗膜3次，每次10 min。雙紅外激光掃描成像系統(tǒng)進行熒光顯色，分析。

1.3　統(tǒng)計學分析

使用Graphpad 6.0軟件進行數據處理，所有數據以平均數±標準差進行表述。組與組之間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA followed by the LSD post hoc test)，以P<0.05表示差異有顯著性。

2　結果

2.1　關節(jié)軟骨細胞鑒定

通過甲苯胺藍染色和免疫熒光染色，分別觀察到蛋白聚糖(圖1A)和二型膠原表達(圖1B)。如圖1A所示，軟骨細胞核呈現藍色。如圖1B所示，二型膠原陽性細胞呈現綠色熒光。

2.2　1α,25(OH)2D3對關節(jié)軟骨細胞增殖活性的影響

如圖2所示，IL-1α、IL-1β及TNF-α刺激均能降低軟骨細胞活性(P< 0.001)，與對照組軟骨細胞相比，1α,25(OH)2D3干預不影響正常軟骨細胞的活性水平。在IL-1α、IL-1β及TNF-α誘導的軟骨細胞中，不同濃度的1α,25(OH)2D3(10 nmol/L和100 nmol/L)干預均能一定程度提高促炎癥因子誘導后的軟骨細胞活性(P< 0.01)，其中100 nmol/L 1α,25(OH)2D3效果更顯著(P< 0.001)。

注： A. 軟骨細胞甲苯胺藍染色；B. 軟骨細胞II型膠原免疫熒光染色。圖1　軟骨細胞染色(×200)Note. A. Chondrocytes stained with toluidine blue; B. Chondrocytes with immunofluorescence staining of type II collagen.Fig.1　Microscopic appearance of the chondrocytes (×200)

注:**P < 0.01, ***P < 0.001。圖2　1α,25(OH)2D3對IL-1α、IL-1β及TNF-α誘導后軟骨細胞活性的影響Note. **P < 0.01, ***P < 0. 001.Fig.2　Effects of 1α,25(OH)2D3 on viability of chondrocytes after IL-1α, IL-1β and TNF-α treatment

2.3　1α,25(OH)2D3對關節(jié)軟骨細胞凋亡水平的影響

如圖3所示，IL-1α、IL-1β及TNF-α誘導均能增加軟骨細胞凋亡水平(P< 0.001)，且TNF-α的作用強于IL-1β，IL-1β的作用強于IL-1α。與對照組軟骨細胞相比，1α,25(OH)2D3干預不影響正常軟骨細胞的凋亡水平。在IL-1α、IL-1β及TNF-α誘導的軟骨細胞中，不同濃度的1α,25(OH)2D3(10 nmol/L和100 nmol/L)干預均能一定程度降低促炎癥因子誘導后的軟骨細胞凋亡水平(P< 0.001)，其中100 nmol/L 1α,25(OH)2D3效果更顯著，且在不同的炎癥刺激強度下均具有較好效果。

2.4　1α,25(OH)2D3對關節(jié)軟骨細胞中aggrecan、ADAMTS-4、ADAMTS-5 mRNA表達水平的影響

如圖4 A所示，1α,25(OH)2D3不影響正常軟骨細胞aggrecan的mRNA表達水平。IL-1α、IL-1β及TNF-α誘導均能下調軟骨細胞中aggrecan的mRNA表達水平(P< 0.001)，且TNF-α的作用強于IL-1β，IL-1β的作用強于IL-1α。不同濃度的1α,25(OH)2D3(10 nmol/L和100 nmol/L)干預均能增加促炎癥因子誘導后的軟骨細胞中aggrecan的mRNA水平(P< 0.001)。ADAMTS-4和ADAMTS-5是最主要蛋白聚糖酶。如圖4B-C所示，IL-1α、IL-1β及TNF-α誘導均能上調軟骨細胞中ADAMTS-4(圖4B)和ADAMTS-5(圖4C)的mRNA表達水平。在IL-1α、IL-1β、及TNF-α誘導的軟骨細胞中，不同濃度的1α,25(OH)2D3(10 nmol/L和100 nmol/L)干預均能下調促炎癥因子誘導后的軟骨細胞中ADAMTS-4(圖4B)和ADAMTS-5(圖4C)的mRNA表達水平(P< 0.001)，其中100 nmol/L 1α,25(OH)2D3效果更顯著，且在不同炎癥刺激強度下，其作用效果相似。

注：A. 流式細胞術測量。B.軟骨細胞凋亡水平的量化分析。*P< 0.05, ***P< 0.001。圖3　1α,25(OH)2D3對IL-1α、IL-1β、及TNF-α誘導后軟骨細胞凋亡水平的影響Note. A. results from low cytometry. B. Quantification analysis. *P< 0.05, ***P < 0.001.Fig.3　Effects of 1α,25(OH)2D3 on apoptosis rate of chondrocytes after IL-1α, IL-1β, and TNF-α treatment

注：(A)aggrecan，(B)ADAMTS-4，(C)ADAMTS-5。 *P< 0.05, **P< 0.01,***P<0.001。圖4　1α,25(OH)2D3對IL-1α、IL-1β、及TNF-α誘導后軟骨細胞中mRNA表達水平的影響。Note.(A)aggrecan,(B)ADAMTS-4,(C)ADAMTS-5. *P< 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.Fig.4　Effects of 1α,25(OH)2D3 on the mRNA levels after IL-1α, IL-1β, and TNF-α treatment

2.5　1α,25(OH)2D3對關節(jié)軟骨細胞中aggrecan、ADAMTS-4、ADAMTS-5蛋白表達的影響

如圖5 A所示，1α,25(OH)2D3不影響正常軟骨細胞aggrecan、ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白表達。IL-1α、IL-1β及TNF-α誘導均能下調軟骨細胞中aggrecan的蛋白表達(P< 0.001)，在此過程中，TNF-α的作用強于IL-1β，IL-1β的作用強于IL-1α。1α,25(OH)2D3(100 nmol/L)干預能增加IL-1β和TNF-α誘導后的軟骨細胞中aggrecan的蛋白合成(P< 0.001)，而對IL-1α誘導組差異無顯著性。IL-1α、IL-1β及TNF-α誘導均能上調軟骨細胞中ADAMTS-4(圖5C)和ADAMTS-5(圖5D)的蛋白表達水平。在IL-1α、IL-1β及TNF-α刺激的軟骨細胞中，1α,25(OH)2D3(10 nmol/L和100 nmol/L)干預均能下調促炎癥因子誘導后的軟骨細胞中ADAMTS-4(圖5C)和ADAMTS-5(圖5D)的蛋白表達水平(P< 0.001)，呈劑量依賴性，且在不同炎癥刺激強度下，其作用效果相似。

注：(A)1α,25(OH)2D3對IL-1α、IL-1β及TNF-α誘導后軟骨細胞中aggrecan、ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白表達的影響。(B-D)Aggrecan、ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白表達的量化圖。*P< 0.05, **P< 0.01, ***P<0.001。圖5　1α,25(OH)2D3對關節(jié)軟骨細胞中aggrecan、ADAMTS-4、ADAMTS-5蛋白表達的影響Note. (A) Effects of 1α,25(OH)2D3 on the expressions of aggrecan, ADAMTS-4 and ADAMTS-5 after IL-1α, IL-1β and TNF-α treatment at protein level. (B-D) Quantification of the expressions of aggrecan, ADAMTS-4 and ADAMTS-5. *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001.Fig.5　Effects of 1α,25(OH)2D3 on the expressions of aggrecan, ADAMTS-4 and ADAMTS-5 in the chondrocytes

3　討論

在骨性關節(jié)炎發(fā)展的早期階段，通常會特征性地出現蛋白聚糖和膠原水平的降低等軟骨特性的改變，同時也會出現一些酶的活化及蛋白聚糖容量的減少[17]。生物化學，形態(tài)學和結構上的改變最終導致軟骨被侵蝕至軟骨下骨的水平[18]。蛋白聚糖是關節(jié)軟骨細胞外基質中的一種主要的大分子，與II型膠原類似，能引起膠原誘導的DBA/1小鼠關節(jié)炎，在遺傳易感的BALB/c小鼠中，與蛋白聚糖發(fā)生免疫反應能誘導慢性關節(jié)炎[19]。因此蛋白聚糖在關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不可忽視的關鍵作用。同時，在骨性關節(jié)炎發(fā)生期間，軟骨細胞暴露于促炎癥細胞因子如IL-1β和TNF-α下，也是促進關節(jié)炎發(fā)展的重要原因，IL-1β和TNF-α會刺激軟骨細胞，從而促進蛋白聚糖和II型膠原的分解代謝，進而破壞軟骨細胞外基質完整性和組織穩(wěn)態(tài)[20]。

促炎癥細胞因子白細胞介素-1(interleukin-1, IL-1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)都能促進關節(jié)軟骨的破壞[21]，但軟骨對這兩類促炎癥因子的應答機制卻不同，如一氧化氮能增強TNF-α誘導的軟骨蛋白聚糖的降解，而不影響IL-1β誘導的軟骨aggrecan的降解[22]。因此，當前實驗分別使用了促炎癥因子IL-1α、IL-1β和TNF-α對大鼠軟骨細胞進行刺激，誘導關節(jié)軟骨細胞炎癥反應，模擬體內骨性關節(jié)炎發(fā)生時軟骨細胞的改變。之前的研究顯示，IL-1β能通過增加降低細胞活力及增加細胞凋亡水平誘導軟骨細胞損傷[23]，TNF-α能通過增加凋亡水平誘導軟骨細胞損傷[24]。當前研究結果顯示，與對照組軟骨細胞相比，IL-1α、IL-1β和TNF-α誘導顯著降低了大鼠軟骨細胞的活性水平，同時顯著誘導了軟骨細胞的凋亡。表明IL-1α、IL-1β和TNF-α刺激成功誘導了軟骨細胞的炎性損傷。VD作為一種類固醇激素，其主要通過作用于VD受體來改變腎臟重吸收，從而調節(jié)鈣循環(huán)和磷酸鹽平衡[25]。VD在骨形成，體內礦物質平衡及免疫穩(wěn)態(tài)的調節(jié)中也發(fā)揮重要作用[26]。據調查顯示，VD缺乏與骨性關節(jié)炎發(fā)生風險相關[27]，單一的VD缺乏可能增加膝骨關節(jié)炎的發(fā)生風險[28]。但也有研究提示，VD缺乏與關節(jié)炎發(fā)生之間的關系仍存在爭議[12]。因此，VD在關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。當前研究結果顯示，在IL-1α、IL-1β和TNF-α刺激的軟骨細胞中，1α,25(OH)2D3干預顯著增強了軟骨細胞的活性，同時降低了軟骨細胞的凋亡水平，表明體外補充1α,25(OH)2D3具有保護軟骨細胞抵抗炎性損傷的作用，其效果與1α,25(OH)2D3的濃度呈正相關性。然而，其作用的分子機制尚不清楚。

當前研究進一步從mRNA和蛋白表達水平調查了蛋白聚糖的代謝情況。結果顯示，IL-1α，IL-1β和TNF-α刺激顯著下調了軟骨細胞蛋白聚糖的表達水平，且TNF-α的作用強于IL-1α和IL-1β。然而，在IL-1α、IL-1β和TNF-α誘導的軟骨細胞中，1α,25(OH)2D3干預顯著上調了軟骨細胞蛋白聚糖的表達水平，且在不同炎癥強度條件下對蛋白聚糖的合成促進作用無顯著差異。表明1α,25(OH)2D3可能在不同炎癥強度條件下均能促進蛋白聚糖的合成，但其促進作用不隨炎癥強度變化而變化。此外，單獨的1α,25(OH)2D3干預能顯著上調軟骨細胞aggrecan的表達。而有實驗表明，1α,25(OH)2D3能通過一種轉錄后機制下調IRC細胞系aggrecan的表達[29]，并能抑制成骨細胞蛋白聚糖的合成，增強成骨細胞蛋白聚糖的分解[30]。表明1α,25(OH)2D3對蛋白聚糖的代謝調節(jié)作用可能與細胞種類和培養(yǎng)條件有關。

體內和體外的軟骨移植實驗揭示，在關節(jié)軟骨破壞期間，蛋白聚糖酶是蛋白聚糖降解最主要的蛋白水解酶[31]。ADAMTS-4和ADAMTS-5作為蛋白聚糖的2類水解酶，其在骨關節(jié)炎發(fā)生期間，對軟骨損傷的作用尚未調查清楚[3]。因此，我們進一步從mRNA和蛋白表達水平調查了軟骨細胞ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達情況。研究結果顯示，IL-1α、IL-1β和TNF-α刺激顯著增加了軟骨細胞ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達。然而，在IL-1α、IL-1β和TNF-α誘導的軟骨細胞中，1α,25(OH)2D3干預顯著降低了軟骨細胞ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達水平，并呈一定劑量依賴性。1α,25(OH)2D3單獨干預則不影響ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達水平，無顯著差異。以上結果表明IL-1α、IL-1β和TNF-α誘導不僅降低了軟骨細胞蛋白聚糖的表達，同時也增加了蛋白聚糖酶的表達，提示IL-1α、IL-1β和TNF-α刺激抑制軟骨細胞蛋白聚糖的合成代謝，促進其分解代謝。相反，1α,25(OH)2D3干預則抑制了促炎癥因子所致的蛋白聚糖下調和蛋白聚糖酶上調，進而發(fā)揮軟骨保護作用。

雖然已經有諸多研究關于VD對骨性關節(jié)炎的作用，但較少有研究VD在關節(jié)軟骨的退變和再生中的具體作用。在我們的研究中，初步證明了1α,25(OH)2D3干預對不同促炎癥因子刺激的大鼠關節(jié)軟骨細胞具有保護作用，并提出這一作用可能是通過增加軟骨細胞蛋白聚糖的合成并抑制蛋白聚糖酶活性所介導的，因此，維持血清正常1α,25(OH)2D3水平有益于保護軟骨細胞抵抗炎癥刺激。這將為骨關節(jié)炎的預防和治療提供新的思路。