鹽酸小檗堿與牛血清蛋白結合率的測定

邦華

成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 611137

藥物的血清蛋白結合率是藥代動力學的重要參數(shù)之一，影響著藥物在體內的分布、代謝和排泄，從而影響藥物的作用強度和時間，與藥物的相互作用及作用機制等密切相關。鹽酸小檗堿(Berberine Hydrochloride)是小檗科植物甘肅小檗(Berberis kansuensis Schneid.)及其同屬植物中分離得到的生物堿成分之一[1-3]，臨床上用于敏感菌所致的腸道感染，口服途徑給藥，每次0.1～0.3 g，每日3次。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿具有治療糖尿病[4]及其并發(fā)癥等作用[5-7]，對有脂肪肝的2 型糖尿病患者口服鹽酸小檗堿每次0.5g，每日3次[8]。由于鹽酸小檗堿口服吸收差[9]，這是否與鹽酸小檗堿的蛋白結合率有關?文獻采用平衡透析法、對鹽酸小檗堿與血蛋白結合率及其藥代動力學進行了研究[10-16]，認為鹽酸小檗堿具有中等強度的蛋白結合率，但不同濃度的鹽酸小檗堿與牛血清蛋白結合率研究尚未見報道，導致與之相關的生物利用度難以明確，筆者采用平衡透析法研究不同濃度的鹽酸小檗堿在牛血清中的蛋白結合率。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC2030高效液相色譜儀(日本島津公司)；BSA124S型電子天平(北京賽多利斯科學儀器公司)；CT15RT臺式高速冷凍離心機(上海天美生化儀器設備工程有限公司)；pHS-3C型酸度計(成都世紀方舟科技有限公司)；XW-80A型旋渦混合器(上海馳唐電子有限公司)；DZKW-4型電恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；MD34透析袋(8000-12000)(SCIENTIFIC RESEARCH SPECIAL美國)；ULUP-I-10T型超純水機(成都超純科技有限公司)。

1.2 材料 鹽酸小檗堿對照品(批號：MUST-16111115，中國科學院成都生物研究所)；鹽酸小檗堿原料藥(批號：111101，成都龍泉高科天然藥業(yè)有限公司)；新生牛血清(批號：20161021，浙江天杭生物科技股份有限公司)；乙腈、甲醇為色譜純；純凈水由超純水機制備系統(tǒng)制備；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉，磷酸均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的配置

2.1.1 空白透析液的配制 配制0.067 mol/L NaHPO4和0.067 mol/L NaH2PO4溶液；按4∶1比例混合成1 000 mL，加入氯化鈉8.776 g，并用磷酸調節(jié)其pH值為7.4，即得磷酸鹽緩沖液[17]。

2.1.2 鹽酸小檗堿系列溶液Ⅰ 精密稱定鹽酸小檗堿對照品5 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈∶甲醇(1∶2)定容，即得質量濃度為500 μg/mL的鹽酸小檗堿溶液。

2.1.3 鹽酸小檗堿系列溶液Ⅱ 取鹽酸小檗堿系列溶液Ⅰ適量，置于10 mL量瓶中，加乙腈∶甲醇(1∶2)稀釋成1、2、5、10、15、20 μg/mL的系列溶液，用于標準曲線的繪制。

2.1.4 鹽酸小檗堿系列溶液Ⅲ 精密稱定鹽酸小檗堿原料藥80.0 mg，分別置于1000 mL量瓶中，各取適量用空白透析液稀釋成10、20、40、60、80 μg/mL的系列溶液，用于蛋白結合率的研究。

2.2 色譜條件 色譜柱：Swell Chromplus C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀(pH=2.8)；梯度洗脫(0～32 min，20%～28% A)；柱溫：30℃；檢測波長：345 nm；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

2.3 透析液樣品預處理 精密量取透析內液或透析外液樣品0.2 mL，置10 mL具塞離心管中，加入1 mL乙腈∶甲醇(1∶2)，渦旋混勻3 min，靜置1 min，于12000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm濾頭，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 分別取空白牛血清、鹽酸小檗堿原料藥及空白透析液，按照“2.3”項下方法處理，在“2.2”項下的色譜條件下測定，色譜圖如圖1所示?？瞻着Ｑ濉⒖瞻淄肝鲆涸诖藯l件下對鹽酸小檗堿的測定無干擾。

圖1 鹽酸小檗堿的色譜圖

2.4.2 標準曲線制備 取鹽酸小檗堿系列溶液Ⅱ適量，在“2.2”項下的色譜條件下測定，以峰面積為縱坐標，藥物濃度濃度為橫坐標，得回歸方程y=39325x-7031，r=0.9993(n=6);線性范圍1～20 μg/mL。

2.4.3 精密度 在空白牛血清或空白透析液中加入鹽酸小檗堿系列溶液Ⅰ，配制成低、中、高(10，40，80 μg/mL)3個質量濃度的樣品，按“2.3”項下處理后進樣，1 d內連續(xù)測定6次，連續(xù)測定3 d。結果見表1。

表1 透析內、外液中鹽酸小檗堿濃度測定方法的精密度考察 (n=6)

2.4.4 提取回收率 在空白牛血清或空白透析液中加入鹽酸小檗堿系列溶液Ⅰ，配制成低、中、高(10，40，80 μg/mL)3個質量濃度的樣品，按“2.3”項下處理后進樣，計算鹽酸小檗堿的透析內液提取回收率分別為(102.55±1.06)%，(101.71±1.53)%，(103.67±1.66)%，透析袋外液提取回收率分別為(102.81±2.14)%，(100.77±1.27)%，(103.09±1.08)%。

2.4.5 穩(wěn)定性 在空白牛血清中加入鹽酸小檗堿系列溶液Ⅰ，配制成低、中、高(10，40，80 μg/mL)3個質量濃度的樣品，考察血清樣品預處理后室溫放置4 h和-70℃放置1周的穩(wěn)定性，計算在室溫下放置4 h的RSD分別為1.16%、1.54%和1.62%，-70℃放置1周的RSD分別為2.02%、2.07%和1.25%，結果表明血清樣品的穩(wěn)定性良好。

2.5 平衡時間的考察 在透析袋內以空白透析液代替牛血清，透析外液中鹽酸小檗堿的質量濃度分別為10、40、80 μg/mL，進行平衡透析試驗，分別于6、8、10 h結束試驗，按“2.3”項下方法處理，按“2.2”項下色譜條件測定透析袋內、外鹽酸小檗堿質量濃度，結果顯示鹽酸小檗堿透析達平衡時間約8 h。見表2。

表2 透析袋內外鹽酸小檗堿的平衡考察時間(n=5)

2.6 透析膜物理吸附考察 透析膜物理吸附考察平衡透析試驗時考察透析膜對藥物的吸附作用，計算低、中、高(10、40、80 μg/mL)3個質量濃度的樣品。透析膜對鹽酸小檗堿的吸附率為(2.09±0.37)%，(3.45±0.28)%，(4.63±0.35)%。結果表明透析膜存在微量吸附作用，但對測定結果無顯著影響，提示透析膜對藥物的物理吸附作用可忽略不計。

2.7 透析袋的預處理 將透析袋剪成10 cm長度的小段，在500 mL 2%的碳酸氫鈉和EDTA溶液中將透析袋煮沸10 min，用蒸餾水清洗3次，然后再在500 mL的1 mmol/L EDTA(pH8.0)溶液中煮10 min。冷卻后，用蒸餾水清洗3次，置于30%乙醇中，放于4℃冰箱備用[18]。

2.8 蛋白結合率測定 試驗前先將預處理后的透析袋用蒸餾水漂洗干凈，取一端用透析袋夾夾緊的透析袋，擠壓除去袋內外水分，精密吸取2 mL空白牛血清加至透析袋中，夾緊袋口，懸浮于盛有45 mL含鹽酸小檗堿分別10、20、40、60、80 μg/mL的透析液的燒杯中，每種濃度平行試驗5份。調整透析袋位置，使透析袋內外液面應保持同一水平，并避免貼壁，密封，置于37℃水浴鍋中放置8h。到達平衡透析時間后，吸出袋外透析液少許，加等量3%三氯醋酸試劑，在黑色背景下立即觀察，如見濃厚的白色云霧狀沉淀快速下降，而且形成較多的沉淀物，此為陽性。如袋外透析液蛋白檢查陽性，則該樣本作廢。如無血清蛋白漏出者，分別取透析袋內外樣品按照“2.3”項處理，測定袋內藥物的鹽酸小檗堿峰面積，再根據(jù)“2.5”項標準曲線計算平衡后袋內外藥物濃度，分別記為C內、C外。根據(jù)公式(C內-C外)/ C內×100%計算血清蛋白結合率。結果見表3。

藥物質量濃度/μg/mL10 20 40 60 80 血清蛋白結合率/%30.50±0.0524.69±0.0123.54±0.0224.77±0.0225.60±0.03

3 討論

實驗在前期色譜條件的選擇時，參考2015版《中國藥典》二部“鹽酸小檗堿”的HPLC的檢查方法，并參考相關文獻，考察了乙腈-0.02 moL/L磷酸二氫鉀溶液、甲醇-0.2%磷酸-0.1%三乙胺等溶液為流動相，最終確定乙腈-0.02 moL/L磷酸二氫鉀溶液，并優(yōu)化流動相比例進行梯度洗脫。在該條件下，透析內、外液中的內源性物質不干擾樣品中的鹽酸小檗堿的測定，峰形良好，保留時間為26.5 min，空白血清圖譜中對應基線波動小，無雜峰出現(xiàn)。本方法具有較高的專屬性。

采用平衡透析法考察了在新生牛血清中鹽酸小檗堿的濃度與蛋白結合率的關系。參照文獻方法[18]，采用截留相對分子質量為8000～12 000的透析膜進行實驗，與空白透析液的樣品相比，透析外液的樣品圖譜基線較平穩(wěn)，無明顯雜質峰，表明清中并無大量內源性物質從透析袋中滲出。此外，考察透析膜對藥物的物理吸附作用，結果表明存在微量的吸附作用，對實驗結果無較大影響。

實驗結果表明，當藥物濃度在10～80 μg/mL時，血清蛋白結合率在20%～30%之間，屬于中等程度的蛋白結合率。藥物與血清蛋白的結合一般分為濃度依賴性和非濃度依賴性。當藥物濃度在10～20 μg/mL時，血清蛋白結合率隨著濃度升高而降低，具有濃度依賴性；當藥物濃度在20～80 μg/mL時，血清蛋白結合率隨著藥物濃度升高不明顯，為非濃度依賴性。在臨床用藥中，對于糖尿病等慢性疾病可以在保證一定血藥濃度的情況下使用較低濃度的藥物，使與蛋白結合的鹽酸小檗堿逐漸釋放以達到穩(wěn)定的治療效果。

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