慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓M2型巨噬細(xì)胞與白血病干細(xì)胞的相關(guān)性研究

蘇瓊　宋建新

【摘要】 目的：探討慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）患者骨髓M2型巨噬細(xì)胞與白血病干細(xì)胞（leukemic stem cells，LSC）的相關(guān)性，并明確其意義。方法：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CML慢性期（CML-CP）30例、加速期（CML-AP）21例、急變期（CML-BP）15例、經(jīng)治療后緩解患者44例（緩解組）、未緩解患者7例（未緩解組）及30例缺鐵性貧血患者（對(duì)照組）骨髓組織中CD163+的表達(dá)變化，比較M2型巨噬細(xì)胞在CML患者不同時(shí)期骨髓組織中的表達(dá)差異；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相應(yīng)CML各期CD34+CD38-CD123+ LSC的表達(dá)，并與正常對(duì)照組進(jìn)行比較。結(jié)果：CML各組患者骨髓中CD163+巨噬細(xì)胞有不同程度的表達(dá)，與對(duì)照組相比明顯增高（P<0.05）。隨著病情的進(jìn)展，CD163+巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)密度逐漸增高，CML-BP高于CML-AP（P<0.05），CML-AP高于CML-CP（P<0.05），緩解組CD163+均有所降低，但仍高于對(duì)照組（P<0.05），未緩解組與CML-BP相比有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在CML-CP患者中，CD34+CD38-CD123+細(xì)胞明顯高于對(duì)照組（P<0.05），隨著病情進(jìn)展，表達(dá)逐漸增高，即CML-BP>CML-AP>CML-CP，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；患者經(jīng)治療完全緩解后，CD34+CD38-CD123+細(xì)胞表達(dá)有所降低，但仍高于對(duì)照組（P<0.05）；未緩解組CD34+CD38-CD123+細(xì)胞有增高趨勢(shì)，但與CML-BP相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；經(jīng)相關(guān)性分析，CD163+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度與LSC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈明顯正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：M2巨噬細(xì)胞在CML患者骨髓中具有較高的浸潤(rùn)密度，且在CML不同時(shí)期浸潤(rùn)密度不同；CD34+CD38-CD123+細(xì)胞在不同時(shí)期的CML中均有不同程度表達(dá)。M2型巨噬細(xì)胞與LSC可能通過(guò)直接或間接作用，參與CML的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。有望為CML的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制、治療及預(yù)后判斷提供新的思路和理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 慢性粒細(xì)胞白血?。?巨噬細(xì)胞； CD163+； LSC

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.6.001 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 1674-6805（2018）06-0001-04

Correlation Study of M2 Macrophages and Leukemic Stem Cells in Bone Marrow of Patients with Chronic Myeloid Leukemia/SU Qiong，SONG Jianxin.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（6）：1-4

【Abstract】 Objective：To discuss the correlation between bone marrow M2 macrophages in chronic myelogenous leukemia（CML） patients and leukemic stem cells（leukemic stem cells，LSC） and to clarify bone marrow macrophages role in CML patients.Method：The expression of CD163+ in bone marrow was detected by immunohistochemical staining in chronic phase（CML-CP） 30 cases，accelerated phase（CML-AP） 21 cases，blastic phase（CML-BP） 15 cases，remission patients 44 cases after treatment，no remission patients with 7 cases and 30 cases of iron deficiency anemia patients.Flow cytometry was used to detect CD34+CD38-CD123+ LSC.Result：There were different expression levels of CD163+ in CML patient bone marrow.Compared with normal control，the expressions in CML patients were significantly high.With the patient progress，CD163+ infiltration density gradually increased.The infiltration density in CML-BP group was higher than that in CML-AP group（P<0.05），the density in CML-AP group was higher than that in CML-CP group（P<0.05），the density in remission patients was low，and was still higher compared with normal control（P<0.05）.There was increase trend in without remission group compared with CML-BP group（P>0.05）.The number of CD34+CD38-CD123+ positive cells in CML-CP patients was significantly higher than in normal control（P<0.05）.With the progress of the disease，the expression gradually increased，the CML-BP> CML-AP> CML-CP，and there were statistical significance between groups（P<0.05）.CD34+CD38-CD123+ cells in completed remission group were decreased and were still higher than normal control（P<0.05）.There was no statistical significance in without remission group compared to AP.After correlation analysis，CD163+ macrophage infiltration density was positively correlated with LSC-positive cells（P<0.05）.Conclusion：Macrophages have higher infiltration density in CML different phases and gradually polarized to M2 macrophages.Infiltration density is different in different CML phages.CD34+CD38-CD123+ are different expression levels in CML different phases.M2 macrophages closely relate to CML occurrence，development and prognosis.It can supply new ideas and theoretical basis for CML treatment and prognosis judgment.

【Key words】 Chronic myelogenous leukemia； Macrophages； CD163+； LSC

First-authors address：The Peoples Hospital of Chuxiong，Chuxiong 675000，China

骨髓微環(huán)境是一個(gè)有序的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，不僅提供造血細(xì)胞賴以生存、發(fā)育及分化的場(chǎng)所，同時(shí)其改變也為血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供了一個(gè)合適的生存空間。巨噬細(xì)胞（macrophages）作為骨髓微環(huán)境的一重要成分，在炎性組織中主要參與組織重建、炎癥和免疫，保護(hù)機(jī)體對(duì)抗感染及損傷；而在某些特定的細(xì)胞因子作用下可活化為具有不同表型和功能的巨噬細(xì)胞，參與腫瘤的生存、增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移并與預(yù)后不良相關(guān)[1]。白血病干細(xì)胞（leukemic stem cells，LSC）是白血病患者體內(nèi)持續(xù)存在的一群微量、相對(duì)惰性、具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，其在白血病的發(fā)生、發(fā)展、化療耐藥和復(fù)發(fā)中起著重要的作用。研究表明，經(jīng)治療達(dá)完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解的CML患者體內(nèi)仍殘留有107個(gè)左右包括LSC在內(nèi)的白血病細(xì)胞，這些微小殘留LSC是CML不能被最終治愈和復(fù)發(fā)的根本原因[2]。因此如何恢復(fù)患者機(jī)體乃至骨髓微環(huán)境的免疫功能，可能是抑制LSC增殖，清除白血病微小殘留，最終治愈白血病的有效方法之一。本文通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，觀察初診CML慢性期（CML-CP）、加速期（CML-AP）、急變期（CML-BP）、緩解及未緩解患者骨髓微環(huán)境中CD163+（M2）型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度；以CD34+CD38-CD123+作為識(shí)別LSC的免疫表型，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)期CML患者骨髓中是否存在免疫表型為CD34+CD38-CD123+的LSC，探討骨髓微環(huán)境中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞類型變化、浸潤(rùn)密度與LSC的相互關(guān)系及在CML發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

66病例均來(lái)自筆者所在醫(yī)院血液科門診及住院患者，男42例，女24例，中位年齡56歲（18～78歲），經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢查，符合文獻(xiàn)[3]CML各期的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，CML-CP 30例，CML-AP 21例，CML-BP 15例（6例為急淋變，其余為急髓變）。經(jīng)治療后完全緩解44例，未緩解7例，其中，CML-CP除7例失訪外全部完全緩解，21例CML-AP患者中，完全緩解13例，未緩解3例，5例轉(zhuǎn)外院治療而失訪；CML-BP完全緩解8例，未緩解4例，治療中1例死亡，2例轉(zhuǎn)外院失訪。30例缺鐵性貧血患者作為對(duì)照組，其中，男18例，女12例；中位年齡54.5歲（18～76歲）。本研究獲筆者所在醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得所有受試者知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

鼠抗人CD163單克隆抗體，SP免疫組化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；CD45-ECD、CD34-PE-Cy5、CD123-PE、CD38-FITC及同型對(duì)照購(gòu)自BD公司。流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司 FC500。

1.3 免疫組化檢測(cè)CD163+在骨髓組織中的表達(dá)

常規(guī)骨髓穿刺取骨髓組織，置于10%福爾馬林液固定液中交筆者所在醫(yī)院病理科進(jìn)行脫水、石蠟包埋處理。取骨髓活檢組織的石蠟塊，切3～4 μm厚的切片；采用S-P免疫組化染色檢測(cè)CD163+的表達(dá)。染色步驟為：二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶，PBS緩沖液輕洗3次，進(jìn)行抗原微爐熱修復(fù)，正常山羊血清封閉、滴加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS緩沖液輕洗3次，滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS緩沖液輕洗3次；滴加DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間在10～15 min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染胞核，脫水透明，中性樹膠封片。對(duì)照組用PBS替代一抗，其余步驟相同。

1.4 免疫組化染色結(jié)果判定

巨噬細(xì)胞體積較大，形態(tài)多樣，呈類圓形或不規(guī)則形，偶見有多核細(xì)胞；經(jīng)染色CD163+主要在細(xì)胞膜著色，有黃褐色或棕黃色沉著物為陽(yáng)性。先在低倍鏡（×100）下選取5個(gè)染色較好的視野，后在高倍鏡下（×400）計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)[4]，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 LSC表型檢測(cè)

采用細(xì)胞直接標(biāo)記方法，取初診CML患者骨髓2 ml，EDTA抗凝備用。調(diào)整待測(cè)樣品白細(xì)胞計(jì)數(shù)在（1.0～2.0）×105/L，用微量移液器吸取EDTA抗凝的新鮮骨髓各100 μl于2支流式細(xì)胞儀專用試管中，一管是同型對(duì)照管，另一管是測(cè)定管；于對(duì)照管中加入IgG1-PE、IgG2a-FITC、IgG1PE-Cy5、CD45-APC四個(gè)抗體各20 μl。測(cè)定管加入CD34-PE-Cy5、CD123-PE、CD38FITC、CD45-APC四種個(gè)抗體各20 μl，搖勻，室溫下避光孵育30 min。每管加入1×溶血素2 000 μl，搖勻，避光10～15 min至完全溶血。溶血后，每管加入1×PBS 1 000 μl混勻，1 500 r/min離心8 min，棄上清液；加入500 μl PBS搖勻上機(jī)測(cè)定，每管收集10 000個(gè)細(xì)胞。

1.6 白血病干細(xì)胞的確認(rèn)

用側(cè)向角散射光SSC/CD45設(shè)門，將細(xì)胞分出淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞、幼稚細(xì)胞群，再以SSC/CD34設(shè)門后分析CD34+細(xì)胞中CD38-CD123+抗原的表達(dá)百分比。所得的百分比數(shù)值乘以之前所測(cè)得的CD34+細(xì)胞的百分比值即為CD34+CD38-CD123+占所有有核細(xì)胞的百分比[5]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以（x±s）表示，各組中CD68、CDl63浸潤(rùn)密度及LSC陽(yáng)性表達(dá)率用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Pearson分析CD163+與LSC的相關(guān)關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD163+在對(duì)照組及CML中的表達(dá)

本組所有病例的骨髓組織中均可見M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，在骨髓組織中均可見細(xì)胞膜或/和細(xì)胞漿著色的CD163+的M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組骨髓中可見巨噬細(xì)胞稀疏散在浸潤(rùn)，數(shù)量少，見圖1。

2.2 CD163+在各組中的表達(dá)

CD163+在對(duì)照組、CML-CP組、CML-AP組、CML-BP組、緩解組、未緩解組中均有不同程度的浸潤(rùn)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CD163+CML各期中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組（t=17.20、34.54、57.26、6.01、11.27、57.40，P<0.05），CML-BP組患者表達(dá)高于CML-AP組，CML-AP組明顯高于CML-CP組（t=22.50，17.71，P<0.05），緩解組明顯高于對(duì)照組（t=46.12，P<0.05），未緩解組與CML-BP相比有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.19，P>0.05），見表1。

2.3 CD34+CD38-CD123+在各組中的表達(dá)

CD34+CD38-CD123+在對(duì)照組、CML-CP組、CML-AP組、CML-BP組、緩解組和未緩解組中均有不同程度表達(dá)，見圖2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CML-CP明顯高于對(duì)照組（t=21.45，P<0.05），隨著病情進(jìn)展，CD34+CD38-CD123+細(xì)胞表達(dá)逐漸增高，即CML-BP>CML-AP>CML-CP，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.46，20.54，P<0.05）?；颊呓?jīng)治療完全緩解后，CD34+CD38-CD123+細(xì)胞表達(dá)有所降低，但仍高于對(duì)照組（t=2.86，P<0.05）；未緩解組CD34+CD38-CD123+細(xì)胞有增高趨勢(shì)，但與CML-BP組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.57，P>0.05），見表1。

2.4 CD163+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度與LSC相關(guān)性

在CML-CP、CML-AP、CML-BP、緩解組、未緩解組中，LSC與CD163+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.863、0.938、0.905、0.916、0.914，P<0.01）。

3 討論

巨噬細(xì)胞是一類廣泛分布于體內(nèi)動(dòng)態(tài)的、非均質(zhì)的、具有遷移性的細(xì)胞群體，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分；在不同微環(huán)境作用下，巨噬細(xì)胞可極化為具有不同分子特征和功能特征的亞群，即M1型或M2型，對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起著截然相反的作用[6-7]。M1型巨噬細(xì)胞具有抗原提呈和吞噬腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞毒性效應(yīng)，而M2型巨噬細(xì)胞可通過(guò)自分泌、旁分泌途徑參與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、抵抗凋亡及侵襲和轉(zhuǎn)移，又被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAMs）。已有研究表明CD163+是識(shí)別M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物[8]。

LSC是指存在于白血病患者體內(nèi)的一群極微量的細(xì)胞，這些微量的細(xì)胞通常處于相對(duì)靜止的非增殖狀態(tài)（G0期）。但因其具有強(qiáng)大的自我更新和分化能力，對(duì)白血病的發(fā)生、發(fā)展、不能被治愈及易復(fù)發(fā)起至關(guān)重要的作用[2]。對(duì)于LSC的標(biāo)志研究已證明，CD123是目前公認(rèn)的可以從正常造血干細(xì)胞（HSC）中識(shí)別LSC的一個(gè)標(biāo)記，即CD34+CD38-CD123+僅表達(dá)于LSC的表面而HSC不表達(dá)[9-10]。本研究應(yīng)用CD34+CD38-CD123+作為慢性粒細(xì)胞白血病患者LSC的標(biāo)記，檢測(cè)CML不同時(shí)期LSC的表達(dá)情況。

已有研究表明，在慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓微環(huán)境中均有M2型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，其在數(shù)量和功能上均占據(jù)優(yōu)勢(shì)，且隨著疾病的進(jìn)展陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增高[11]。本文通過(guò)對(duì)CML患者不同時(shí)期骨髓巨噬細(xì)胞及LSC的研究發(fā)現(xiàn)，在CML各組患者骨髓組織中CD163+均高表達(dá)，且隨著疾病的進(jìn)展陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增高。LSC在對(duì)照組中幾乎檢測(cè)不到，而在CML各組中均檢測(cè)到有LSC的存在，而且隨著病情的進(jìn)展逐漸增高，即CML-BP>CML-AP>CML-CP>對(duì)照組。通過(guò)對(duì)CD163+與LSC的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，隨著M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度的不同，LSC也發(fā)生相應(yīng)的變化；M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度越高，LSC表達(dá)越高，即M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度與LSC的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。提示CML患者骨髓微環(huán)境中M2型巨噬細(xì)胞的增多，可能是LSC為逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用，分泌大量細(xì)胞因子如CCL2、VEGF、TGF-β等，將外周血單核細(xì)胞大量招募進(jìn)入骨髓后分化為巨噬細(xì)胞，并“迫使”巨噬細(xì)胞活化表型及功能朝著有利于LSC發(fā)展的M2型轉(zhuǎn)化，從而進(jìn)一步增強(qiáng)了LSC的惡性生物學(xué)行；而M2型巨噬細(xì)胞本身也能分泌大量的CCL2、IL-10、TGF-β和VEGF，通過(guò)正向反饋進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞的招募與極化[12-13]；M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)自分泌、旁分泌途徑參與LSC的惡性增殖、抵抗凋亡及侵襲，導(dǎo)致CML的發(fā)生、發(fā)展。但鑒于CML發(fā)病的多因素性和巨噬細(xì)胞及LSC調(diào)節(jié)機(jī)制的復(fù)雜性，對(duì)于CML患者骨髓中的巨噬細(xì)胞是來(lái)源于外周血、其他組織還是骨髓源性的或幾者兼有及對(duì)LSC的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。結(jié)果還顯示，CML經(jīng)治療完全緩解后CD163+及LSC表達(dá)水平較有所降低，但仍高于對(duì)照組，說(shuō)明CML經(jīng)治療后雖達(dá)到了形態(tài)學(xué)及基因水平的緩解，骨髓微環(huán)境仍未恢復(fù)正常，還存在復(fù)發(fā)的因素。所以在CML緩解后，如何恢復(fù)患者機(jī)體乃至骨髓微環(huán)境的平衡，可能是最終清除白血病微小殘留的途徑之一。例如，如何阻止CML患者骨髓微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的招募、如何阻止巨噬細(xì)胞被極化為M2型，或者如何將M2型巨噬細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為M1型等都是今后值得研究的課題。

總之，在CML患者骨髓微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的大量浸潤(rùn)且被極化為M2型，M2型巨噬細(xì)胞與LSC數(shù)具有明顯的正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明M2型巨噬細(xì)胞在CML患者骨髓中可以促進(jìn)LSC的增殖、分化；有望為CML的發(fā)生，發(fā)展機(jī)制、治療及預(yù)后判斷提供新的思路和理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Cortez-Retamozo V，Etzrodt M，Newton A，et al.Angiotensin II drives the production of tumor-promoting macrophages[J].Immunity，2013，38（2）：296-308.

[2] Goldman J，Gordon M.Why do chronic myelogenous leukemia stem cells survive allogeneic stem cell transplantation or imatinib：does it really matter[J].Leukemia Lymphoma，2006，47：1-7.

[3]張之南，沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第2版.北京：科學(xué)出版社，1997：134-136.

[4] Kim D W，Min H S，Lee K H，et al.High tumour islet macrophage infiltration correlates with improved patient survival but not with EGFR mutations，gene copy number or protein expression in resected non-small cell lung cancer[J].Br J Cancer，2008，98（6）：1118-1124.

[5]朱海波，趙明峰，謝芳，等.白血病干/祖細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)在急性白血病中的臨床意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜，2011，19（5）：1150-1155.

[6] Sica A，Mantovani A.Macrophage plasticity and polarization：in vivo veritas[J].J Clin Invest，2012，122（3）：787-795.

[7] Biswas S K，Mantovani A.Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subset： cancer as a paradigm[J].Nat Immunology，2010，11（10）：889-896.

[8] Shabo I，Svanvik J.Experssion of macrophage antigens by tumor cells[J].Adv Exp Med Biol，2011，714：141-150.

[9] Hauswirth A W S，F(xiàn)lorian D，Printz，et al.Expression of the target receptor CD33 in CD34+/CD38-/CD123+AML stem cell[J].Eur J Clin Invest，2007，37（1）：73-82.

[10] Misaghian N，Ligresti G，Steelman L S，et al.Targeting the leukemic stem cell：the Holy Grail of leukemia therapy[J].Leukemia，2009，23：25-42.

[11] Jian-Xin S，Zi-Jin D，Yan W，et al.Assessment of the Number and Phenotype of Macrophages in the Human BMB Samples of CML[J].Bio Med Research International，2016，2016：8086398.

[12] Chen L，Yuan W，Chen Z，Wu S，et al.Vasoactive intestinal peptide represses activation of tumor-associated macrophages in gastric cancer via regulation of TNFα，IL-6，IL-12 and iNOS[J].Int J Oncol，2015，47（4）：1361-1370.

[13]趙陽(yáng)，趙勇.單核-巨噬細(xì)胞起源及發(fā)育分化的特征與分子調(diào)控[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014，30（1）：126-132.

（收稿日期：2017-07-31）