馬尾松樹皮提取物對(duì)牙本質(zhì)小管的封閉效果及其耐磨損性能的體外研究

唐成芳，楊黎燕，曾 輝，馬新?lián)P，王 萌，李經(jīng)緯

(1. 西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，陜西西安 710021；2. 西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安 710021；3. 西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，陜西西安 710004)

牙本質(zhì)敏感癥(dentin hypersensitivity, DH)是牙齒遇到溫度、化學(xué)、機(jī)械等刺激時(shí)，出現(xiàn)的一種一過性異常酸痛感覺，是最常見的牙體硬組織疾病之一[1]。DH的發(fā)生主要與牙本質(zhì)小管呈開放狀態(tài)密切相關(guān)，BRAENNSTROEM等[1-2]提出的液體動(dòng)力學(xué)仍然是當(dāng)前普遍接受的發(fā)病機(jī)制。據(jù)此，臨床常通過封閉牙本質(zhì)小管，從而降低牙本質(zhì)通透性，減小牙本質(zhì)小管內(nèi)的液體流動(dòng)治療DH。因蜂膠、五倍子、地骨皮等天然物質(zhì)安全無(wú)毒或低毒，并具有一定的膠原交聯(lián)、凝固蛋白收斂止痛、封閉本質(zhì)小管等功效，使應(yīng)用中醫(yī)藥防治牙本質(zhì)過敏日漸引起學(xué)者重視[3-5]。

馬尾松樹皮提取物(pinus massoniana bark extract, PMBE)是松科植物馬尾松中提取的富含原花青素(procyanidins, PA)的黃酮類天然物質(zhì)，結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，天然無(wú)毒，具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、膠原交聯(lián)等生物活性[6-10]。因而，推測(cè)其可能具備一定的封閉牙本質(zhì)小管和/或鎮(zhèn)痛作用從而防治DH。前期，PMBE已被課題組證實(shí)可抑制牙本質(zhì)脫礦、增強(qiáng)抗酸，從而預(yù)防牙本質(zhì)過敏和防治根面齲[11]。本研究擬進(jìn)一步觀察前期優(yōu)選濃度的PMBE乙醇溶液局部應(yīng)用對(duì)暴露牙本質(zhì)的即刻封閉效果及其耐磨損性，為臨床應(yīng)用其防治DH提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器PMBE(PA>95%，奧賽生物科技有限公司，西安)，無(wú)水乙醇(分析純，西安化學(xué)試劑廠)，37%磷酸凝膠(DenFilTM，韓國(guó))，柯伯脂氟保護(hù)漆(Puldent公司，美國(guó))，氯化鈣(CaCl2)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、疊氮鈉(NaN3，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，上海)，牛血清蛋白(Sigma，美國(guó))，羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Sigma，美國(guó))。慢速切割機(jī)(UNIPOL-830，科晶有限公司，沈陽(yáng))，場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FESEM S-4800，Hitachi，日本)，電子分析天平(塞多利斯斯泰帝公司，德國(guó))，恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械廠，上海)。

1.2試樣制備及溶液配制選取因阻生拔除的新鮮完整、無(wú)病變的第三磨牙于咬合面牙尖下2 mm和4 mm 處垂直于牙長(zhǎng)軸切割，制備厚約2 mm的牙本質(zhì)片，并進(jìn)一步制備成長(zhǎng)4 mm、寬3 mm、厚2 mm的牙本質(zhì)塊(圖1)。每牙制備2塊牙本質(zhì)塊，共制備70塊。流水沖洗下打磨平整，清洗備用。

圖1 試樣制備Fig.1 The sketch of specimen preparation

每日按照以下配方新鮮配制人工唾液：1.5 mmol/L CaCl2、130 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、20 mmol/L HEPES、1 mmol/L NaN3，添加20 g/L的牛血清蛋白，2 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。

無(wú)水乙醇為溶劑，配制80 g/L的PMBE液，靜置過夜，取上清液備用。

1.3分組及處理

1.3.1分組 將70個(gè)試件采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為7組(n=10)：乙醇空白、氟保護(hù)漆/即刻、氟保護(hù)漆/磨損7 d、氟保護(hù)漆/磨損14 d、PMBE/即刻、PMBE/磨損7 d和PMBE/磨損14 d組，乙醇空白組和氟保護(hù)漆各組分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2牙本質(zhì)過敏體外模型的建立 各組試件經(jīng)超聲清洗干凈，用37%磷酸凝膠酸蝕30 s，蒸餾水沖洗3次，10 s/次，使牙本質(zhì)小管呈開放狀態(tài)模擬牙本質(zhì)過敏的牙本質(zhì)暴露和牙本質(zhì)小管開放狀態(tài)。

1.3.3牙本質(zhì)小管封閉及磨損處理 乙醇空白組樣本經(jīng)氣槍輕吹去除牙本質(zhì)表面多余水分后用小毛刷取無(wú)水乙醇涂布2層共約2 min，自然干燥。

氟保護(hù)漆各組樣本用氣槍輕吹去除牙本質(zhì)表面多余水分，用小毛刷均勻涂刷氟保護(hù)漆2層，自然干燥。氟保護(hù)漆/磨損7 d、氟保護(hù)漆/磨損14 d組自然干燥后，各樣本單獨(dú)放入1 mL的人工唾液并置于37 ℃恒溫水浴鍋中，早、晚7∶30取出進(jìn)行刷牙磨損實(shí)驗(yàn)，刷牙時(shí)模擬bass刷牙的手法使刷毛與牙本質(zhì)塊表面呈45度角，并在原位做輕柔的水平顫動(dòng)，水平移動(dòng)距離約1 mm，同時(shí)在牙面涂抹摩擦劑，3 min/次，2次/日。每次刷牙完成后，去離子水徹底沖洗樣本后，放回人工唾液中保存，人工唾液每日更換1次。其中，氟保護(hù)漆/磨損7 d組和氟保護(hù)漆/磨損14 d組樣本分別磨損處理7 d和14 d。

PMBE各組樣本用80 g/L PMBE乙醇溶液涂刷牙本質(zhì)1次/d，2層/次共約2 min。PMBE/即刻組樣本涂刷1次后，自然干燥。PMBE/磨損7 d和PMBE/磨損14 d組樣本每次涂刷處理完成后，再按照氟保護(hù)漆組的方法進(jìn)行刷牙磨耗，且分別處理7 d和14 d。為了保證磨損手法和力度的一致性，磨損實(shí)驗(yàn)均為同一人操作。

1.4表面及剖面形貌觀察乙醇空白組、氟保護(hù)漆/即刻組及PMBE/即刻組樣本涂布處理后均即刻自然干燥；其余各組樣本磨損完成后自然干燥。所有樣本沿制備的引導(dǎo)溝劈開分為兩半，其中一半用于觀察牙本質(zhì)表面特征，另一半用于觀察樣本的縱剖面。樣本噴金，F(xiàn)E-SEM觀察表面牙本質(zhì)小管封堵情況、剖面牙本質(zhì)小管管腔形貌。

1.5牙本質(zhì)小管開口面積、牙本質(zhì)小管開口相對(duì)面積的測(cè)定采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，對(duì)各組牙本質(zhì)表面圖像分別進(jìn)行測(cè)量分析。導(dǎo)入采集圖像，手動(dòng)標(biāo)記牙本質(zhì)小管開口邊界，測(cè)量牙本質(zhì)小管開口面積(area of dentin tubule openings, ADTO)。按照公式計(jì)算牙本質(zhì)小管開口相對(duì)百分面積(percentage area of dentin tubule openings, PADTO)：PADTO=(ADTO/牙本質(zhì)面積)×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)ADTO、PADTO等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析并進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1表面及剖面形貌

2.1.1即刻組形貌觀察 乙醇空白組牙本質(zhì)小管口均開放，呈圓形或類圓形，剖面見牙本質(zhì)小管管腔空虛無(wú)物，管壁較疏松多孔(圖2A、A1)；氟保護(hù)漆/即刻組牙本質(zhì)表面被覆膜狀物，未見牙本質(zhì)小管開口(圖2B、B1)；剖面見管腔明顯減小但未被完全封堵。管壁被覆厚薄不一的膜狀物。

PMBE/即刻組牙本質(zhì)表面牙本質(zhì)小管口基本被完全封閉，僅個(gè)別牙本質(zhì)小管不全封堵，剖面見自管口向下約3～4 μm長(zhǎng)度的管腔被完全封堵，其余管壁致密(圖2C、C1)。

圖2 即刻組牙本質(zhì)表面和剖面掃描電鏡觀察Fig.2 SEM micrograph of dentin surface and dentin profile in immediate groups

2.1.2磨損組形貌觀察 PMBE磨損各組及氟保護(hù)漆磨損各組牙本質(zhì)表面均可見明顯刷痕，牙本質(zhì)小管口部分開口，但開口程度小于乙醇空白組。氟保護(hù)漆/磨損7 d組牙本質(zhì)小管處可見以牙本質(zhì)小管為中心的圓形、類圓形或狹長(zhǎng)的開口與開口外周環(huán)狀致密組織構(gòu)成的“同心圓狀”磨耗(圖3A)，剖面見牙本質(zhì)小管壁的被覆物表面似有較小的致密顆粒形成(圖3A1)；氟保護(hù)漆/磨損14 d組，牙本質(zhì)表面刷痕更明顯，小管開口數(shù)量和程度均明顯增加，部分開口的小管腔內(nèi)開口下方可見多少不一的封堵物(圖3C)，剖面牙本質(zhì)小管內(nèi)見明顯顆粒狀或不規(guī)則團(tuán)塊狀物形成(圖3C1)。

PMBE/磨損7 d組牙本質(zhì)表面呈現(xiàn)明顯的淺凹陷狀刷痕，致密的牙本質(zhì)膠原纖維束清晰可見，牙本質(zhì)小管大部分封閉，但小管開口數(shù)量和管徑較PMBE/即刻組有少量增加，開口度和數(shù)量較氟保護(hù)漆組少(圖3B)；PMBE/磨損14 d組牙本質(zhì)表面淺凹形磨痕更加明顯，小管開口度和數(shù)量增多(圖3D)。PMBE/磨損剖面見牙本質(zhì)管壁致密，部分小管的頂端有封閉物，7 d 組封閉物更致密(圖3B1、D1)。

圖3 磨損各組牙本質(zhì)表面和剖面掃描電鏡觀察Fig.3 SEM micrograph of dentin surface and dentin profile in abrasion groups

2.2ADTO、PADTO結(jié)果如表1所示，ADTO及PADTO乙醇空白組最大，顯著高于其余各組(P<0.05)。PMBE/即刻組ADTO及PADTO顯著高于氟保護(hù)漆/即刻組(P<0.05)；氟保護(hù)漆/磨損14 d組和PMBE/磨損14 d組的ADTO及PADTO高于磨損7 d組，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，且均顯著高于處理后即刻組(P<0.05)。PMBE/磨損7 d組和PMBE/磨損14 d組ADTO及PADTO與氟保護(hù)漆/磨損7 d組和氟保護(hù)漆/磨損14 d組基本相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組ADTO、PADTO變化Tab.1 ADTO and PADTO in each group (n=10,

3 討 論

DH是臨床常見癥狀，其發(fā)病機(jī)制是目前廣為接受的DH液體流動(dòng)發(fā)病機(jī)制。該機(jī)制認(rèn)為，外界刺激通過開放的牙本質(zhì)小管引起牙本質(zhì)小管內(nèi)液體的異常流動(dòng)，導(dǎo)致牙髓神經(jīng)機(jī)械感受器被激惹，繼而產(chǎn)生一過性疼痛，即DH[1-2]。因此，通過增加牙髓及牙本質(zhì)神經(jīng)纖維的疼痛閾值、降低神經(jīng)纖維敏感性或機(jī)械的封閉牙本質(zhì)小管來降低牙本質(zhì)通透性被認(rèn)為可緩解或消除牙本質(zhì)過敏[12]。目前治療DH的常用方法有激光脫敏法和氟化物、鉀鹽藥物、Gluma脫敏劑及戊二醛、酚類等藥物脫敏方法[12-14]。

戊二醛是一種化學(xué)交聯(lián)滅菌劑，被單獨(dú)用作治療DH及作為市售Gluma脫敏劑中的有效成分，能使牙本質(zhì)小管中的液體蛋白質(zhì)變性、凝固，以封閉牙本質(zhì)小管末梢，阻止小管液流動(dòng)，從而達(dá)到有效脫敏作用。然而戊二醛具有一定腐蝕性、致敏性和致畸性[13,15]，因而本實(shí)驗(yàn)觀察了天然、無(wú)毒的富含交聯(lián)劑PA的馬尾松樹皮提取物封閉牙本質(zhì)小管的功效及其耐磨性。

氟保護(hù)漆是以樹脂為基質(zhì)的含氟緩釋劑，能在口腔內(nèi)快速成膜，并持續(xù)釋放氟離子的有機(jī)溶液，可封堵牙本質(zhì)小管，對(duì)牙體組織具有良好保護(hù)作用，被臨床用于齲病和牙本質(zhì)過敏的預(yù)防和早期非手術(shù)治療[15-6]。故本實(shí)驗(yàn)以熱帶樹脂-柯伯脂為基質(zhì)的氟保護(hù)漆為對(duì)照。ADTO及PADTO在本實(shí)驗(yàn)中代表視野中觀察到的牙本質(zhì)開口的實(shí)測(cè)面積和視野相對(duì)面積，可通過其值準(zhǔn)確反映牙本質(zhì)小管的封閉程度，其值越小，表明封堵效果越好，療效越好。本研究結(jié)果表明，PMBE各組和氟保護(hù)漆各組ADTO及PADTO均顯著低于乙醇空白組，80 g/L PMBE乙醇溶液與氟保護(hù)漆一樣可有效封堵暴露牙本質(zhì)的小管開口，從而阻止小管液流動(dòng)。PMBE磨損各組的ADTO及PADTO均與氟保護(hù)漆磨損各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩組的ADTO及PADTO均顯著小于乙醇空白組。提示PMBE能有效封閉牙本質(zhì)小管，每日局部短暫涂布應(yīng)用顯示出良好的耐磨性，且隨時(shí)間變化無(wú)顯著下降。EF-SEM結(jié)果也印證了上述結(jié)果。PMBE及氟保護(hù)漆磨損各組表面均見磨損痕跡，均有一定程度的磨損但牙本質(zhì)表面開口明顯較乙醇空白組小，剖面還可見小管內(nèi)沉積物。有報(bào)道指出，即使牙本質(zhì)小管直徑變化很小，也會(huì)使小管內(nèi)液體流動(dòng)性大大減少，使牙本質(zhì)敏感得到明顯改善[12]。因此，被PMBE或氟保護(hù)漆保護(hù)的牙本質(zhì)因刷牙磨損致使牙本質(zhì)小管封閉效果減弱，但原理上小管內(nèi)液體流動(dòng)依然大大降低，因而還是能很大程度改善牙本質(zhì)敏感的癥狀。

氟保護(hù)漆防治/改善牙本質(zhì)敏感，并具有一定耐磨損性的機(jī)制，經(jīng)分析主要基于以下兩方面原因：一是所含熱帶柯伯樹脂在口腔內(nèi)快速成膜，即刻封堵牙本質(zhì)小管；另外，牙本質(zhì)表面和小管內(nèi)形成的氟涂膜在口腔中緩慢釋放氟，與牙本質(zhì)或人工唾液中的鈣反應(yīng)，形成氟化鈣或氟磷灰石，封堵、縮小牙本質(zhì)小管管徑，從而發(fā)揮隔絕或減弱外界刺激作用[16]。PMBE封閉牙本質(zhì)小管和耐磨損性機(jī)制不同于氟保護(hù)漆，可能主要與其富含天然交聯(lián)劑PA有關(guān)。一是富含PA的馬尾松樹皮提取物可改性脫礦牙本質(zhì)，提高了硬度和彈性模量，從而增強(qiáng)耐磨性。研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松樹皮和葡萄籽來源的分子式含多酚結(jié)構(gòu)的天然交聯(lián)劑PA與化學(xué)交聯(lián)劑戊二醛一樣可增加牙本質(zhì)膠原交聯(lián)度，提高牙本質(zhì)的硬度、彈性模量和極限拉伸強(qiáng)度等機(jī)械性能[17-19]；二是原花青素、五倍子等多酚結(jié)構(gòu)的物質(zhì)可與蛋白質(zhì)反應(yīng)，從而凝固蛋白質(zhì)使其變性[17]，因而從原理上PMBE也可使牙本質(zhì)小管中的蛋白質(zhì)變性、凝固，從而阻止小管內(nèi)液體流動(dòng)達(dá)到脫敏的目的；三是PMBE可因所含PA在人工唾液中促進(jìn)了不全脫礦牙本質(zhì)中的殘余羥基磷灰石生長(zhǎng)而再礦化[20]，進(jìn)一步增強(qiáng)其耐磨性。此外，PMBE中還含有微量的鈣元素和鉬元素，可沉積于脫礦牙本質(zhì)表面，從而增強(qiáng)牙本質(zhì)[11]。

實(shí)驗(yàn)中PMBE溶液以乙醇作為溶劑，主要是因?yàn)橐掖紵o(wú)毒且具有較好的揮發(fā)性和滲透效果；PMBE采用局部每日1次涂布短暫處理，旨在后期能以漱口水或涂布劑的形式應(yīng)用于臨床，患者及醫(yī)師簡(jiǎn)便易行；磨損實(shí)驗(yàn)中，由同一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員每天對(duì)牙本質(zhì)樣本用bass刷牙手法進(jìn)行2次為時(shí)3 min的磨損，避免了人為誤差又模擬了口腔實(shí)際應(yīng)用方式。因此，PMBE具有一定的臨床應(yīng)用潛力，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也具有一定的指導(dǎo)意義。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，80 g/L PMBE短暫涂布處理牙本質(zhì)可獲得良好的牙本質(zhì)小管即刻封閉效果和一定的耐磨性，從而治療/緩解牙本質(zhì)過敏。然而，本實(shí)驗(yàn)?zāi)p時(shí)間僅僅2周，其封閉的長(zhǎng)期持久性尚不明確；此外，具有鎮(zhèn)痛功效的PMBE能否降低牙髓神經(jīng)纖維敏感性還有待研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chinese Stomatological Association Expert Committee On Dentin Hypersensitivity. Guideline for the diagnosis and management of dentin hypersensitivity[J]. Chin J Dent Res, 2015, 18(1):13-16.

[2] YOSHIYAMA M, MASADA J, UCHIDA A, et al. Scanning electron microscopic characterization of sensitive vs. insensitive human radicular dentin[J]. J Dent Res, 1989, 68(11):1498-1502.

[3] 朱立芬，林居紅，蔣琳，等. 蜂膠治療牙本質(zhì)過敏癥的掃描電鏡觀察及臨床療效研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2008, 37(5):464-466.

[4] 劉承德，常桂欣，趙文龍，等. 中藥地骨皮治療基牙預(yù)備后牙本質(zhì)過敏的臨床觀察[J]. 中國(guó)醫(yī)療前沿, 2010, 5(12):63.

[5] 黃曉燕，黃光偉，覃青云，等. 中草藥抗牙本質(zhì)敏感牙膏的研究[J]. 口腔護(hù)理用品工業(yè), 2015, 25(4):17-19.

[6] ZHANG JH, FENG DR, MA HL, et al. Antitumor effects of Pinus massoniana bark extract in murine sarcoma S180 bothinvitroandinvivo[J]. Am J Chin Med, 2012, 40(4):861-875.

[7] 伍春蓮. 馬尾松樹皮提取物生物活性物質(zhì)的檢測(cè)及抗炎癥機(jī)制的初步研究[D]. 中山大學(xué), 2006.

[8] CUI Y, XIE H, WANG J. Potential biomedical properties of Pinus massoniana bark extract[J]. Phytother Res, 2005, 19(1):34-38.

[9] SUZUKI N, UEBABA K, KOHAMA T, et al. French maritime pine bark extract significantly lowers the requirement for analgesic medication in dysmenorrhea: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study[J]. J Reprod Med, 2008, 53(5):338-346.

[10] MAIMOONA A, NAEEM I, SADDIQE Z, et al. A review on biological, nutraceutical and clinical aspects of French maritime pine bark extract[J]. J Ethnopharmacol, 2011, 133(2):261-277.

[11] 唐成芳，朱勇，阮建平，等. 馬尾松樹皮提取物預(yù)處理對(duì)根面牙本質(zhì)耐酸蝕和脫礦能力的影響[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 47(8):732-736.

[12] 李雪英，林敏，從叢，等. Nd：YAG激光作用下牙本質(zhì)脫敏機(jī)制的研究[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2015, (2):275-279.

[13] 孔亞閣，宋永青，胥光輝，等. 2%戊二醛液治療牙本質(zhì)過敏癥的臨床應(yīng)用[J]. 實(shí)用診斷與治療雜志, 2005, 19(1):46-47.

[14] 熊筱艷，吳方麗，郭芮，等. 極固寧TM、Gluma與NaF治療牙本質(zhì)過敏癥的臨床療效觀察[J]. 中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 3(4):196-198.

[15] DING YJ, YAO H, WANG GH, et al. A randomized double-blind placebo-controlled study of the efficacy of Clinpro XT varnish and Gluma dentin desensitizer on dentin hypersensitivity[J]. Am J Dent, 2014, 27(2):79-83

[16] 朱虹倩，喻潔，劉興容，等. 三種脫敏劑治療牙本質(zhì)過敏的臨床觀察[J]. 川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, (1):97-100.

[17] AGUIAR TR, VIDAL CM, PHANSALKAR RS, et al. Dentin biomodification potential depends on polyphenol source[J]. J Dent Res, 2014, 93(4):417-422.

[18] LIU R, FANG M, XIAO Y, et al. The effect of transient proanthocyanidins preconditioning on the cross-linking and mechanical properties of demineralized dentin[J]. J Mater Sci Mater Med, 2011, 22(11):2403-2411.

[19] BEDRAN-RUSSO AK, PASHLEY DH, AGEE K, et al. Changes in stiffness of demineralized dentin following application of collagen crosslinkers[J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2008, 86(2):330-334.

[20] TANG CF, FANG M, LIU RR, et al. The role of grape seed extract in the remineralization of demineralized dentine: Micromorphological and physical analyses[J]. Arch Oral Biol, 2013, 58(12):1769-1776.