星型膠質(zhì)細(xì)胞代謝抑制劑氟代檸檬酸對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血的保護(hù)作用及機(jī)制

行治國(guó)，趙君杰，宋錦寧，馬旭東，黃廷欽，郭 丹

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061；2. 渭南市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西渭南 714000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)多由動(dòng)脈瘤破裂引起，盡管目前蛛網(wǎng)膜下腔出血的病理生理研究和治療取得了一定進(jìn)展，但部分SAH患者的預(yù)后仍不理想。既往關(guān)于SAH的研究多集中在腦血管痙攣，但是越來(lái)越多的研究證實(shí)早期腦損傷(early brain injury, EBI)對(duì)SAH患者的預(yù)后起重要作用。EBI的機(jī)制主要包括：微循環(huán)及腦能量代謝、離子失衡、氧化應(yīng)激等，其中免疫炎癥也起重要作用[1]。星型膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞的一種，能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)各種形式的損傷做出反應(yīng)[2]。SAH后，星型膠質(zhì)細(xì)胞逐漸活化，但其在炎癥作用的角色仍未知。本研究擬建立大鼠SAH模型，通過(guò)給予星型膠質(zhì)細(xì)胞代謝抑制劑氟代檸檬酸(fluorocitrate, FC)，檢測(cè)大鼠皮層神經(jīng)損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎性因子-腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素6(interleukin-6, IL-6)的水平、細(xì)胞核內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)的含量及其磷酸化程度、皮層細(xì)胞凋亡的變化，闡明星型膠質(zhì)細(xì)胞的代謝抑制劑FC在SAH后炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料Iba-1抗體(日本W(wǎng)ako公司)、p-NF-κB抗體、NF-κB抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，神經(jīng)元核蛋白(neuronal nuclear protein, NeuN)抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，氟代檸檬酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，細(xì)胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒購(gòu)自上海生工公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組相同遺傳背景的成年健康雄性大鼠36只，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量280～320 g，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(溫度22 ℃，24 h晝夜循環(huán)光照，食水自由)。隨機(jī)分為假手術(shù)組(12只)，SAH 3 d組(給予相同劑量生理鹽水，12只)，SAH 3 d+FC組(12只)。FC濃度為20 nmol/L，造模后30 min內(nèi)側(cè)腦室注射10 μL[3]。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3SAH模型制作所有大鼠術(shù)前常規(guī)禁食水6 h，用100 g/L的水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉。成功后將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，頸部剃毛、消毒。于頸部正中切開皮膚，逐層解剖，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈主干及分叉，繼續(xù)向上分離頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。動(dòng)脈夾臨時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端并離斷，將帶有刻度的直徑約0.265 mm的魚線從頸外動(dòng)脈殘端置入頸內(nèi)動(dòng)脈，去掉頸內(nèi)動(dòng)脈夾，從分叉處插入深度約20 mm，感覺(jué)有阻力時(shí)再進(jìn)線1～2 mm，刺破血管，維持15s后將線抽出，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，去除所有動(dòng)脈夾，縫合切口[4]。

1.4大鼠側(cè)腦室注射造模后30 min內(nèi)行側(cè)腦室注射，大鼠呈俯臥位，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，門齒桿-3.3 mm。頭頂皮膚剃毛，消毒，于頭正中做一長(zhǎng)約1 cm切口，逐層分開肌肉、筋膜等，暴露前囟，以前囟點(diǎn)為0點(diǎn)尋找進(jìn)針點(diǎn)，其坐標(biāo)為AP：1.0 mm，L：1.5 mm，墨水標(biāo)記。用牙科鉆磨開顱骨，暴露硬腦膜，注射針垂直插入約4.5 mm，緩慢注射FC藥物，持續(xù)約10 min，完成后注射針繼續(xù)停留5 min，然后拔出注射針，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮切口。SAH組給予相同劑量的生理鹽水[5]。

1.5取材及組織病理學(xué)染色SAH 3 d后，麻醉大鼠，每組6只大鼠經(jīng)生理鹽水250 mL灌注取腦，分離皮層，腦組織置于液氮中保存。每組另6只大鼠經(jīng)生理鹽水及40 g/L的多聚甲醛各250 mL灌注取腦，并將腦組織放置在40 g/L的多聚甲醛中繼續(xù)固定48 h。常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚5 μm，60 ℃烤切片1 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，標(biāo)準(zhǔn)步驟行HE染色，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.6免疫組化及熒光觀察Iba-1及GFAP的表達(dá)常規(guī)烤片、脫蠟、梯度乙醇水化；30 mL/L的H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，微波中最大火力加熱至沸騰，冷卻5 min，反復(fù)2次，自然冷卻至室溫；50 g/L BSA封閉；滴加一抗Iba-1(1∶400)；4℃過(guò)夜后，滴加二抗孵育，滴加SABC孵育，DAB顯色，自來(lái)水沖洗干凈；蘇木素復(fù)染；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，鏡檢。隨機(jī)選5個(gè)視野用Image-Pro Plus軟件分析測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。免疫熒光染色步驟基本同免疫組化，一抗為GFAP(1∶300)、神經(jīng)元核蛋白(neuronal nuclear protein, NeuN, 1∶400)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE, 1∶200)，4 ℃過(guò)夜后，滴加熒光二抗，DAPI復(fù)染，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察、照相并分析。

1.7TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，2 mL/L的Triton X-100中浸潤(rùn)5 min，室溫下平衡緩沖液中孵育10 min，然后37 ℃環(huán)境中TdT孵育60 min，PBS浸洗，終止反應(yīng)，DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞(綠色熒光)，隨機(jī)5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)[6]。

1.8電鏡制片及觀察將大鼠腦皮層置于電鏡固定液中，按照常規(guī)電鏡標(biāo)本制作步驟，經(jīng)清洗、脫水、浸透、包埋、修塊后制作超薄切片，于透射電鏡下觀察并拍照。

1.9ELISA檢測(cè)FC對(duì)炎性因子的影響將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入到原裝包被的微孔板中，每孔100 μL，再于每孔加入50 μL的酶聯(lián)親和物，混勻后于37 ℃孵育1 h，倒掉孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌5次，每孔依次加入底物Ⅰ和底物Ⅱ各50 μL，混勻后避光反應(yīng)15 min，再加入終止液終止反應(yīng)，立即使用酶標(biāo)儀測(cè)量。

1.10Westernblot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量及磷酸化程度按細(xì)胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒的說(shuō)明書提取大鼠皮層細(xì)胞核的蛋白，按1∶4比例加入loading buffer，蛋白變性后，按每孔40 μg加入蛋白，電泳后轉(zhuǎn)膜，并在50 mL/L脫脂牛奶中封閉1 h，過(guò)夜孵育一抗p-NF-κB(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)，洗膜后孵育二抗，ECL顯影，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，Image J軟件進(jìn)行分析。

1.11大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分SAH大鼠評(píng)分依據(jù)Loeffler的5分制評(píng)分法：抓住大鼠背部，能正常運(yùn)動(dòng)并能5 s內(nèi)翻身，評(píng)5分；自主運(yùn)動(dòng)減少，5 s內(nèi)仍能翻身，評(píng)4分；翻身所需時(shí)間超過(guò)5 s，評(píng)3分；不能翻身，評(píng)2分；不能運(yùn)動(dòng)，評(píng)1分。

2 結(jié) 果

2.1SAH后大體標(biāo)本及組織形態(tài)學(xué)改變大鼠SAH后，在蛛網(wǎng)膜下腔尤其是willis環(huán)附近出血較明顯，但是假手術(shù)組則無(wú)出血，腦表面發(fā)白、干凈。HE染色提示，假手術(shù)組皮層神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，核圓，呈藍(lán)色，胞質(zhì)淡紅。SAH 3 d后皮層的神經(jīng)元腫脹，收縮變性，核變形、固縮、深染(圖1)。

2.2FC改善SAH3d時(shí)的神經(jīng)功能缺損大鼠SAH后均出現(xiàn)嗜睡、精神淡漠、活動(dòng)減少、飲水和進(jìn)食減少。假手術(shù)組活動(dòng)正常，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為(4.99±0.01)；SAH 3 d組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低(1.83±0.41)，而與SAH 3 d組相比，SAH 3 d+FC組的評(píng)分明顯改善(3.45±1.02)。3組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.02，P=0.006)。

2.3FC減輕大鼠SAH3d后的神經(jīng)損傷HE染色顯示：與假手術(shù)組相比，SAH 3 d組皮層存在明顯的神經(jīng)元腫脹，收縮變性，核變形、固縮、深染；與SAH 3 d組相比，SAH 3 d+FC組皮層神經(jīng)元腫脹程度，核變形、固縮、深染的程度均顯著減輕(圖2)。電鏡結(jié)果顯示：假手術(shù)組微血管結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮形態(tài)規(guī)則，基底膜完整；SAH 3 d組微血管結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)皮形態(tài)被破壞，基底膜不完整；與SAH 3 d組相比，SAH 3 d+FC組的微血管結(jié)構(gòu)及內(nèi)皮形態(tài)均趨于假手術(shù)組(圖2)。免疫熒光顯示：假手術(shù)組NSE陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量較少[(26.34±6.89)個(gè)/視野]；SAH 3 d組NSE陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增多[(153.87±20.32)個(gè)/視野]，提示NSE的表達(dá)增加；與SAH 3 d組相比，SAH 3 d+FC組NSE陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量減少[(79.76±12.39)個(gè)/視野]。3組NSE陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.32，P=0.005，圖3)。

2.4FC減少SAH3d后皮層GFAP、Iba-1的表達(dá)免疫組化及Western blot的結(jié)果均表明：假手術(shù)組GFAP及Iba-1表達(dá)較少，SAH 3 d組皮層內(nèi)GFAP及Iba-1的表達(dá)均明顯增加，與SAH 3 d組相比，SAH 3 d+FC組皮層GFAP及Iba-1的表達(dá)均顯著減少。3組的皮層GFAP及Iba-1的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.97，P=0.012，F(xiàn)=52.34，P=0.016，圖4)。

圖1 假手術(shù)組與SAH 3 d組腦組織的大體觀察及皮層的形態(tài)學(xué)改變Fig.1 Gross and microscopic observation of brain tissue in sham and SAH 3 d groups (HE, ×200)

圖2 FC減輕SAH大鼠的神經(jīng)損傷Fig.2 FC attenuated brain damage after SAH (HE, ×200; electroscope, ×8 000)

2.5FC減少大鼠SAH3d后皮層的細(xì)胞凋亡為了闡明FC對(duì)皮層細(xì)胞凋亡的影響，利用TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞(綠色)，并利用DAPI染核(藍(lán)色)，TUNEL與DAPI同時(shí)陽(yáng)性的細(xì)胞定義為凋亡細(xì)胞。假手術(shù)組凋亡細(xì)胞較少[(10.76±5.23)個(gè)/視野]，SAH 3 d組凋亡細(xì)胞明顯增加[(162.76±16.92)個(gè)/視野]，與SAH 3 d組相比，SAH 3 d+FC組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少[(71.27±12.51)個(gè)/視野]。3組凋亡細(xì)胞數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.39，P=0.002，圖5)。

2.6FC通過(guò)NF-κB信號(hào)通路減少炎性因子的釋放為了闡明FC對(duì)大鼠SAH腦保護(hù)作用的機(jī)制，利用Western blot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)變化及其磷酸化程度。與SAH 3 d組相比，SAH 3 d+FC組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)及其磷酸化程度均減少。3組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)及其磷酸化程度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.23，P=0.001，F(xiàn)=63.28，P=0.002，圖6)。ELISA的結(jié)果表明：與假手術(shù)組相比，大鼠SAH后TNF-α、IL-1β、IL-6 3種炎癥因子的水平均升高，與SAH 3 d組相比，SAH 3 d+FC組三種炎性因子的水平均有不同程度下降。3組中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=61.62，P=0.011，F(xiàn)=82.11，P=0.020，F(xiàn)=26.83，P=0.023，圖7)。

圖3 FC減少大鼠SAH后皮層NSE的表達(dá)Fig.3 FC reduced the expression of NSE in rat cortex after SAH (IF, ×400)

圖4 FC減少SAH后皮層GFAP、Iba-1的表達(dá)Fig.4 FC decreased the expressions of GFAP and Iba-1 in rat cortex after SAH (×400)

圖5 FC減少SAH大鼠皮層的細(xì)胞凋亡Fig.5 FC alleviated the number of TUNEL-positive cells in rat cortex after SAH (×200)

圖6 FC抑制大鼠SAH后皮層NF-κB的核轉(zhuǎn)錄及磷酸化水平Fig.6 FC inhibited the nuclear transcription and phosphorylation of NF-κB in rat cortex after SAH

圖7 FC減少SAH后皮層炎性因子的含量Fig.7 FC reduced the levels of inflammatory factors in rat cortex after SAHP

3 討 論

星型膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞，既往認(rèn)為其只對(duì)神經(jīng)元提供結(jié)構(gòu)、代謝及營(yíng)養(yǎng)支持。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)也有重要的調(diào)控作用，星型膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)釋放細(xì)胞因子及趨化因子形成調(diào)控炎癥反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)[7-8]。SAH會(huì)導(dǎo)致星型膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并導(dǎo)致促炎因子的釋放[9]。因此，星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化參與SAH后早期腦損傷、遲發(fā)性腦缺血及功能缺損的整個(gè)過(guò)程?；罨男切湍z質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是SAH后早期腦損傷的重要機(jī)制[2]。

FC是星型膠質(zhì)細(xì)胞的代謝抑制劑，可減少GFAP的表達(dá)，抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化[10]。既往研究證實(shí)，用FC抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞后，可有效減輕神經(jīng)性病理痛[11-12]，也可抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的缺血耐受[13]。本研究對(duì)SAH大鼠側(cè)腦室注射FC，發(fā)現(xiàn)FC可減輕大鼠皮層神經(jīng)元腫脹、核變形、核固縮，并使紊亂的微血管結(jié)構(gòu)及內(nèi)皮形態(tài)得到改善；NSE是神經(jīng)元特異性烯醇化酶，其表達(dá)升高是SAH嚴(yán)重程度及預(yù)后的標(biāo)志，F(xiàn)C也可以減少NSE的表達(dá)。此外，F(xiàn)C還可以改善大鼠SAH后的神經(jīng)功能缺損，并減少凋亡細(xì)胞數(shù)量，提示FC可減輕SAH后的神經(jīng)損傷。

FC的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其抑制NF-κB信號(hào)通路，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平有關(guān)。既往研究證實(shí)，SAH后患者腦脊液中的GFAP存在病理性升高，并且高峰也在出血后的24 h，此后逐漸降低，持續(xù)約兩周。而SAH后沒(méi)有存活的患者腦脊液中，其GFAP含量在腦血管痙攣的高峰期即出血后第6天出現(xiàn)第2個(gè)高峰[14]。SAH后48 h時(shí)，大腦皮層內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-10、MCP-1、MIP2、CINC-1等諸多炎性因子的mRNA升高，并伴隨著外周中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。SAH后的21 d時(shí)腦組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)仍然存在，其特征就是小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并伴隨著腦內(nèi)灰白質(zhì)的損傷[15]。SAH后7 d時(shí)，海馬區(qū)有明顯的星型膠質(zhì)細(xì)胞活化[16]。因此，SAH后腦皮層內(nèi)長(zhǎng)期存在星型膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥狀態(tài)，并且炎癥與SAH的嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。

NF-κB是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，生理狀態(tài)下呈非活化狀態(tài)，在多種刺激因子的作用下可發(fā)生活化，活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)多種基因的表達(dá)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。TNF-α、IL-1β、IL-6是常見(jiàn)的、重要的炎性因子，可由星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放，受到NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控，本研究中FC可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路減少三種炎性因子的產(chǎn)生和釋放。此外，三種炎性因子由星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放后，可以反過(guò)來(lái)激活星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，形成循環(huán)，導(dǎo)致炎性因子過(guò)度釋放，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成損傷[17]。

綜上，星型膠質(zhì)細(xì)胞在SAH后早期腦損傷中發(fā)揮重要作用，其可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子，并激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎性損傷。FC可以抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化，對(duì)SAH后早期腦保護(hù)有重要意義。

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