下調(diào)MLAA-22基因對U937細胞增殖與分化的影響

崔 鶴，張王剛

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059；2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西西安 710004)

急性單核細胞白血病是急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)中的一個亞型，按照法、美、英(France-America-Britain, FAB)協(xié)作組分型標準，該亞型被稱為M5型。在西方國家，M5型約占AML的8%；在我國，M5型占AML的20%～30%，僅次于M2型[1]。M5型患者可經(jīng)常出現(xiàn)高白細胞血癥、髓外浸潤、彌漫性血管內(nèi)凝血等臨床表現(xiàn)[2]，白血病細胞表面常有CD11b及CD56表達[1]，還可伴有t(9;11) (p22;q24)、t(9;11) (p22;q23)、t(9;11) (q33;q23)、t(11;17) (q23;q21)、t(11;17) (q23;q25)、t(11;17) (q23;q12)、t(11;17) (q24;q21)、t(11;17) (123;q11-21)、t(11;20) (p15;q11.2)、t(11;20) (p15;q11)、t(1;11) (p31;q23)、t(1;11;4) (q21;q23;p16)、t(8;16) (p11;p13)、t(8;22) (p11;q13)等多種染色體核型異常[3-15]。隨著聯(lián)合化療方案的優(yōu)化、支持治療方案和造血干細胞移植方法的改進，使M5型患者的療效較前有所提高，但如何有效清除微小殘留病變以預防復發(fā)，以及如何改善復發(fā)/難治性患者的療效仍是目前難以解決的兩大問題。

目前，越來越多的生物治療方法應用到腫瘤的治療當中，該方法已成為唯一有希望完全消滅腫瘤細胞的治療方法，其中免疫治療方法倍受人們關注。為了研究急性單核細胞白血病的免疫治療方法，我們實驗組在2005年采用重組cDNA表達文庫血清學分析法篩選出了一系列急性單核細胞白血病相關抗原(monocytic leukemia-associated antigen, MLAA)基因，MLAA-22基因是其中之一[16]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，該基因是一個抗凋亡基因[17-19]，在初診急性單核細胞白血病患者中的表達高于正常人[20]。為了進一步明確該基因的生物學功能，我們采用規(guī)律成簇間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相關核酸酶9(CRISPR-associated 9, Cas9)系統(tǒng)下調(diào)U937細胞中MLAA-22基因的表達，初步研究了該基因下調(diào)后對U937細胞增殖和分化的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與細胞系胎牛血清購自美國Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒和化學發(fā)光檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自瑞士Roche公司；感染增強液購自上海吉凱基因化學技術有限公司；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；基因敲除和突變檢測試劑盒購自上海吉盛醫(yī)學科技有限公司；感染增強液、lenti-Cas9-puro、lenti-sgRNA-EGFP及陰性對照病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司，pMD19-T載體克隆試劑盒、大腸桿菌TOP10、5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-Gal)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)購自日本TaKaRa公司；U937細胞由西安交通大學第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科保存；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2細胞培養(yǎng)使用含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)U937細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、飽和濕度、50 mL/L的CO2。

1.3采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)下調(diào)U937細胞MLAA-22基因CRISPR/Cas9系統(tǒng)由2種慢病毒組成(lenti-Cas9-puro及l(fā)enti-sgRNA-EGFP)，它們分別向U937細胞中導入核酸內(nèi)切酶Cas9基因和sgRNA，從而實現(xiàn)對目的基因的下調(diào)。其中l(wèi)enti-cas9-puro攜帶嘌呤霉素標記，lenti-sgRNA-EGFP攜帶綠色熒光標記，其中sgRNA的序列為：5′-GGAGTTTGCTGGAAATCCAC-3′。

1.3.1Lenti-Cas9-puro-U937細胞株的建立 收集處于對數(shù)生長期的U937細胞，1 000 r/min，離心5 min，使用感染增強液重懸細胞，制成細胞密度為5×104個/mL的細胞懸液，接種到48孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，在每孔加入一定體積的聚凝胺(終濃度5 μg/mL)，加入適量Lenti-Cas9-puro感染U937細胞(感染復數(shù)：20)；感染后16 h，將各孔中細胞收集到1.5 mL EP管中，2 000 r/min，離心2 min，去掉上清液，更換為500 μL完全培養(yǎng)基，輕輕混勻后在24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；感染后72 h，每孔加入終濃度為4 μg/mL的嘌呤霉素,繼續(xù)培養(yǎng)48 h；將各孔中細胞收集到1.5 mL EP管中，2 000 r/min，離心2 min，去掉上清液，更換為500 μL完全培養(yǎng)基，每孔加入終濃度為2 μg/mL的嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)良好時進行下游實驗，同時凍存一部分細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2采用Lenti-sgRNA-EGFP感染Lenti-Cas9-puro-U937細胞 實驗分組情況：MLAA基因下調(diào)組(即感染Lenti-sgRNA-EGFP后的Lenti-Cas9-puro-U937細胞，簡稱KD組)、陰性對照組(即感染陰性對照病毒的U937細胞，簡稱NC組)、空白對照組(即U937細胞，簡稱CON組)。收集處于對數(shù)生長期的Lenti-Cas9-puro-U937細胞，1 000 r/min，離心5 min，使用感染增強劑重懸細胞(細胞密度5×104個/mL)，接種到48孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，在每孔加入一定體積的聚凝胺(終濃度5 μg/mL)，加入適量Lenti-sgRNA-EGFP(感染復數(shù)：20)；感染后16 h，將各孔中細胞收集到1.5 mL EP管中，2 000 r/min，離心2 min，去掉上清液，更換為500 μL完全培養(yǎng)基，輕輕混勻后在24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；感染后96 h，使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況，計算感染效率。

1.3.3CruiserTM酶切法檢測sgRNA的活性 在感染Lenti-sgRNA-EGFP后的120 h收集細胞，按照基因組DNA提取試劑盒操作說明抽提樣品的基因組DNA，以抽提的基因組DNA為模板對MLAA-22基因突變區(qū)進行PCR擴增(反應條件：預變性，94 ℃ 90 s；變性，94 ℃ 30 s；退火，60 ℃ 30 s；延伸，72 ℃ 30 s；共30個循環(huán)，終止延伸，72 ℃ 30 s)。PCR擴增所需引物為：5′-TTCAGGAACGACCTTTTGCAAGG-3′(上游)；5′-GGCAGACAGGTCAGAAACTTT-3′(下游)。將獲得的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，接著按照瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒的操作說明回收及純化PCR產(chǎn)物，隨后按照基因敲除和突變檢測試劑盒操作說明配制CruiserTM酶切反應體系，45 ℃ 反應20 min后，立即加入2 μL終止液，最后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.4基因突變區(qū)PCR產(chǎn)物的TA克隆及測序 在無菌PCR管中加入TA克隆反應體系(pMD19-T載體：1.0 μL，PCR產(chǎn)物1.0 μL，雙蒸水3.0 μL)；在TA克隆反應體系中加入5 μL溶液1；16 ℃反應30 min；將產(chǎn)物加入到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞(100 μL)中，放置于冰上30 min；在42 ℃金屬浴中放置90 s，然后放置于冰上2 min；加入含氨芐青霉素(終濃度100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基(500 μL)中，置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h；取適量菌液均勻涂布在含X-Gal(終濃度0.4 mmol/L)、IPTG(終濃度0.5 mmol/L)、氨芐青霉素(終濃度100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h，隨機挑取31個白色單克隆菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，運用BLAST軟件對測序結果進行分析，計算MLAA-22基因的突變率。

1.4下調(diào)MLAA-22基因對U937細胞增殖的影響使用Lenti-sgRNA-EGFP感染Lenti-Cas9-puro-U937細胞，96 h后收集待測細胞，使用完全培養(yǎng)基重懸細胞，并進行細胞計數(shù)；將細胞均勻鋪于96孔板中(細胞密度2×103個/孔)，每孔100 μL，每組均設立3個重復孔；鋪好細胞后，待細胞完全沉淀下來，放入37 ℃、50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96、120 h時終止培養(yǎng)，在培養(yǎng)終止前4 h時加入10 μL CCK-8于待測孔中；將待測細胞重新放入37 ℃、飽和濕度、50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后將96孔板置于振蕩器上振蕩5 min，使用酶標儀在450 nm波長檢測待測樣品的吸光度值。以上實驗重復3次。

1.5下調(diào)MLAA-22基因對U937細胞分化的影響使用Lenti-sgRNA-EGFP感染Lenti-Cas9-puro-U937細胞，感染120 h后收集待測細胞，1 000 r/min、離心3 min，棄去上清；PBS洗滌細胞沉淀1次，1 000 r/min，離心3 min，棄去上清；使用1×結合緩沖液洗滌細胞沉淀1次，1 000 r/min，離心3 min，棄去上清；加入PBS重懸細胞沉淀(細胞密度5×105個/mL)；加入20 μL抗CD11b抗體，室溫、避光孵育30 min；1 000 r/min，離心3 min，收集細胞，使用1 mL PBS洗滌細胞沉淀3次，1 000 r/min，離心3 min，收集細胞；使用800 μL 1×細胞染色緩沖液重懸細胞并混勻，轉移至96孔板中，每孔200 μL，使用流式細胞儀檢測CD11b陽性細胞率。

1.6統(tǒng)計學分析使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，所有實驗數(shù)值描述為均值±標準差，采用t檢驗進行樣本之間的比較，當P<0.05時，認為兩樣本之間存在統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1感染Lenti-sgRNA-EGFP細胞的綠色熒光蛋白表達率感染Lenti-sgRNA-EGFP后96 h，使用熒光顯微鏡下觀察各組細胞綠色熒光蛋白的表達情況。結果顯示，NC組和KD組的綠色熒光表達率均>90%(圖1)，說明Lenti-sgRNA-EGFP的感染效率高，可以繼續(xù)進行下游實驗。

圖1 感染Lenti-sgRNA-EGFP后細胞的綠色熒光蛋白表達情況Fig.1 Expression of green fluorescent protein in the cells transfected with lentivirus-sgRNA-EGFP (×200)

2.2CruiserTM酶切法檢測sgRNA的活性感染Lenti-sgRNA-EGFP后120 h，收集細胞，抽提樣品的基因組DNA，基因組DNA經(jīng)PCR擴增后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小，結果如圖2A所示：PCR產(chǎn)物大小為1 050 bp，與預測值一致；PCR產(chǎn)物經(jīng)CruiserTM酶切，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2B所示：PCR產(chǎn)物被CruiserTM酶切割為大小分別為645 bp和405 bp的2條片段，條帶大小與預測值一致，這說明本文中所采用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的sgRNA序列能夠高效、準確地識別基因編輯靶點。

圖2 CruiserTM酶切檢測sgRNA的活性Fig.2 Detection of sgRNA’s activity by CruiserTM enzyme digestion

2.3PCR產(chǎn)物的TA克隆及測序將經(jīng)膠回收試劑盒回收、純化后獲得的KD組細胞的MLAA-22基因突變區(qū)的PCR產(chǎn)物與T載體連接，并將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞中，經(jīng)藍白斑篩選，隨機送31個陽性單克隆菌落生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，采用BLAST軟件對測序結果進行分析，分析結果(圖3)顯示：在31個單克隆菌落中，有19個單克隆菌落發(fā)生了基因突變，MLAA-22基因突變率為61.3%(其中第1～13號單克隆菌落發(fā)生了堿基缺失；第14號及第16號單克隆菌落同時發(fā)生了堿基置換和堿基缺失；第17～19號單克隆菌落同時發(fā)生了堿基置換和堿基插入)。說明本研究中所采用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于后續(xù)的實驗研究。

圖3 PCR產(chǎn)物的TA克隆及測序結果Fig.3 TA cloning and sequencing of PCR products

2.4下調(diào)MLAA-22基因對U937細胞增殖的影響為了研究MLAA-22基因的下調(diào)對U937細胞增殖的影響，本實驗使用CCK-8試劑盒分別檢測CON、NC及KD組的U937細胞的增殖情況，繪制生長曲線，比較各組細胞的增殖能力。結果顯示：與CON和NC組相比，KD組細胞的增殖速度明顯小于CON和NC組(P<0.01)；CON和NC組細胞的增殖速度無明顯差異(P>0.05，圖4)。這說明MLAA-22基因的下調(diào)明顯抑制了U937細胞的增殖。

2.5下調(diào)MLAA-22基因對U937細胞分化的影響下調(diào)U937細胞MLAA-22基因表達后，使用流式細胞儀檢測細胞表面分化抗原CD11b的表達情況。結果如圖5所示：KD組CD11b陽性細胞率高于NC組和CON組(P<0.01)，NC組CD11b陽性細胞率和CON組無明顯差別(P>0.05)。這說明，下調(diào)MLAA-22基因的表達可增加細胞表面分化抗原CD11b的表達，促進了U937細胞向成熟方向分化。

圖4 下調(diào)MLAA-22基因對U937細胞增殖的影響Fig.4 Cell proliferation in MLAA-22-knockdown U937 cells

圖5 下調(diào)MLAA-22基因對U937細胞分化的影響Fig.5 Cell differentiation in MLAA-22-knockdown U937 cells

3 討 論

基因編輯技術是常用于基因功能和基因治療研究的、對基因組進行定點修飾的技術[21]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種最新的、高效的基因編輯技術。它由1條能夠與靶基因序列堿基互補配對結合的sgRNA序列和1種能夠切割靶基因DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶(Cas9蛋白)組成[22]，sgRNA負責識別靶基因的DNA序列。需要注意的是，被sgRNA識別的DNA序列的上游必須存在一PAM序列，通常為5′-NGG，它的作用是引導Cas9蛋白與靶基因結合[23]。靶基因的DNA序列被CRISPR/Cas9系統(tǒng)切斷后，將會立即通過機體細胞內(nèi)存在的非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源定向修復(homology directed repair, HDR)2種修復途徑進行自我修復[24]：NHEJ是不依賴于同源DNA序列的修復方式，修復的結果是在DNA切割位點上產(chǎn)生短的插入和缺失突變，能夠引起靶基因的開放閱讀框發(fā)生移位突變，是處于G0和G1期的細胞基因修復的主要途徑；HDR是依賴于同源DNA序列的修復方式，可以對靶基因進行精確的編輯或引入特定的基因序列改變，是處于S和G2期的細胞基因修復的主要途徑[25-26]。最終CRISPR/Cas9系統(tǒng)借助于這2種機體細胞內(nèi)部固有的基因修復途徑實現(xiàn)對目的基因重新編輯。

細胞增殖失控、凋亡受阻、分化障礙是白血病細胞的重要特征，其中細胞凋亡受阻和分化障礙是引起白血病細胞增殖失控的2個重要因素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MLAA-22基因具有抗凋亡的生物學功能。為了明確該基因是否還具有調(diào)控細胞分化的生物學功能，本研究應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在U937細胞中下調(diào)了MLAA-22基因的表達，TA克隆及測序結果顯示，MLAA-22基因突變率為61.3%，這說明本文所使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)可有效引起MLAA-22基因突變，可用于后續(xù)的實驗研究。此外，細胞增殖檢測結果顯示，MLAA-22基因的表達下調(diào)后，U937細胞增殖速度明顯減慢；而且細胞分化檢測結果顯示，MLAA-22基因的表達下調(diào)后，U937細胞表面分化抗原CD11b陽性細胞率增加，促進了U937細胞向成熟方向分化。這說明MLAA-22基因可能通過調(diào)控U937細胞分化而引起細胞增殖失控，從而促進急性單核細胞白血病的發(fā)生與發(fā)展。本研究結果為將來深入研究該基因的生物學功能的分子作用機制以及靶向治療藥物奠定了基礎。

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