水溶性輔酶Q10對(duì)魚(yú)藤酮致PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制

江毓敏，李海寧，林邵青，陳燕燕，安 靜，馬春換，宦楠楠，成 江

(1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧夏銀川 750003)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)，又名震顫麻痹(paralysis agitans)，是一種常見(jiàn)于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床上以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)平衡障礙為主要特征。遺傳與環(huán)境的共同作用在PD的發(fā)病中起了重要作用，其主要病理改變是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性。盡管其具體發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，但一系列的研究顯示，PD的發(fā)病主要與細(xì)胞凋亡途徑被激活、氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙等有關(guān)[1-2]。輔酶Q10(Coenzyme Q10, CoQ10)在線粒體呼吸鏈中作為移動(dòng)電子轉(zhuǎn)運(yùn)和輔助因子的解偶聯(lián)蛋白，是人體內(nèi)強(qiáng)大的抗氧化劑，能夠防止自由基的氧化損傷，包括線粒體膜內(nèi)脂質(zhì)的氧化。有學(xué)者認(rèn)為PD的發(fā)生可能與CoQ10的減少有關(guān)[3-4]。但傳統(tǒng)的CoQ10為脂溶性，生物利用度較低，難以被人體吸收利用，新近研發(fā)出的水溶性CoQ10細(xì)胞攝取度和線粒體攝取度分別是傳統(tǒng)CoQ10的60倍和20倍[5]。魚(yú)藤酮(rotenone, Rot)是生活中常見(jiàn)的殺蟲(chóng)劑，其作用方式與親帕金森毒素1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)相同，可特異性抑制細(xì)胞呼吸鏈的NADH脫氫酶(線粒體復(fù)合物I，complex I)[6]。大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(pheochromocytoma cell, PC12)株的性質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)含有的酶類(lèi)、合成的遞質(zhì)等都與中腦多巴胺神經(jīng)元相似[7-8]，因此，本課題組以PC12細(xì)胞作為多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞模型，研究水溶性CoQ10對(duì)神經(jīng)元凋亡的抑制作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum)、PBS磷酸鹽緩沖液購(gòu)于Hyclone公司；青鏈霉素、胰蛋白酶(trypsin)購(gòu)于索萊寶公司；Rot、高純度(>98%)CoQ10、聚氧乙基-α-生育酚癸二酸酯(polyoxyethanyl-α-tocopheryl sebacate, PTS)購(gòu)于Sigma公司；活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；凋亡誘導(dǎo)因子(anti-apoptosis-inducing factor antibody, anti-AIF antibody)、anti-active Caspase3 antibody、anti-Caspase9 antibody、anti-beta actin antibody(anti-β-actin antibody)、Anti-Lamin B1 antibody、Goat Anti-rabbit antibody購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；漿蛋白核蛋白提取試劑盒購(gòu)于凱基生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞株大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞(已經(jīng)由神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分化)，購(gòu)于上海生命科學(xué)院。

1.3主要儀器二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma Scientific公司)；普通倒置顯微鏡(Olympus CKX41，日本Olympus公司)；帶攝像功能熒光顯微鏡(Nikon eclipse，日本Nikon公司)；熒光分光光度計(jì)(Olympus，日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(日本Olympus公司)；多波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.4方法

1.4.1試劑準(zhǔn)備 將Rot溶解于DMSO中，制成儲(chǔ)存液，備用；將PTS與CoQ10按照2∶1摩爾比例在50 ℃下混勻，制成水溶性CoQ10[9]。

1.4.2細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞置于含100 mL/L胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，50 mL/L CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，24 h換液，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4.3Rot建立PD模型 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到96孔板，于37 ℃孵育箱過(guò)夜，用不同濃度Rot(0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L)作用24 h，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(control)組、溶劑對(duì)照(vehicle)組(1 mL/L DMSO)，使用CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，選擇細(xì)胞存活率50%左右的Rot濃度建立PD模型，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.4.4水溶性CoQ10對(duì)正常細(xì)胞以及PD模型細(xì)胞存活率的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到96孔板，于37 ℃孵育箱過(guò)夜，用不同濃度水溶性CoQ10(25、50、100 μmol/L)對(duì)細(xì)胞預(yù)處理3 h后加入魚(yú)藤酮處理24 h，CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4.5實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為vehicle組(加入1 mL/L的DMSO)、Rot組(1 μmol/L Rot)、CoQ10組(50 μmol/L CoQ10)、CoQ10治療組(1 μmol/L Rot+50 μmol/L CoQ10)。

1.4.6細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 使用南京建成ROS檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。收集vehicle組、Rot組、CoQ10組、CoQ10治療組和陽(yáng)性對(duì)照組(Rosup，50 mg/L，試劑盒提供)的細(xì)胞各1×106個(gè)，重懸于含10 μmol/L 2′，7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)的PBS中，CO2孵箱內(nèi)孵育30 min，PBS洗滌3次，用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，使各組細(xì)胞濃度一致。陽(yáng)性對(duì)照組按照試劑盒要求，使用終質(zhì)量濃度50 mg/L的Rosup，作用時(shí)間30 min，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，以各處理組/對(duì)照組的比值作為ROS的數(shù)值。

1.4.7Western blot檢測(cè)CoQ10對(duì)凋亡信號(hào)蛋白AIF、Bcl-2、Bax、Caspase-9及active Caspase-3表達(dá)的影響 收集處理好的細(xì)胞，按照試劑盒要求提取漿蛋白與核蛋白(凱基核蛋白漿蛋白提取試劑盒)，Bradford法測(cè)定蛋白含量，SDS-PAGE電泳分離并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，TBST洗膜3次，每次10 min，50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1 h。以LaminB1作為AIF的內(nèi)參，β-actin作為Bcl-2、Bax、Caspase-9、active Casepase-3的內(nèi)參，4 ℃孵育(AIF、Bcl-2、Bax、Caspase-9、active Casepase-3、β-actin及LaminB1的稀釋濃度均為1∶2 000)過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗(均使用Goat Anti-rabbit antibody)室溫孵育2 h，顯影，凝膠成像儀照相并分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度Rot對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響本實(shí)驗(yàn)采用梯度濃度Rot處理細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率如圖1。單因素方差分析顯示，不同濃度Rot細(xì)胞存活率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且細(xì)胞存活率與Rot濃度呈負(fù)相關(guān)，Rot濃度越高，細(xì)胞存活率越低。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，正常對(duì)照組和溶劑對(duì)照組細(xì)胞突起明顯、呈梭形，給予不同濃度的Rot處理后，細(xì)胞大部分胞體皺縮，突起縮短甚至消失，細(xì)胞呈類(lèi)似圓形，且數(shù)量減少。在Rot濃度為1 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率約為50%，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用1 μmol/L的Rot建立細(xì)胞模型。control組與vehicle組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可忽略DMSO對(duì)細(xì)胞的影響。

圖1 不同濃度Rot對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of Rot of different concentration on survival rate of PC12 cells

2.2水溶性CoQ10對(duì)Rot致PC12細(xì)胞形態(tài)及存活率的影響選用25、50、100 μmol/L CoQ10對(duì)模型組PC12細(xì)胞進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，與Rot組比，50、100 μmol/L CoQ10均可提高Rot組細(xì)胞存活率(P<0.05)，但是50 μmol/L與100 μmol/L的CoQ10對(duì)PC12細(xì)胞存活率改變無(wú)明顯差異(圖2)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將選擇50 μmol/L CoQ10作為治療濃度。

圖2 CoQ10對(duì)Rot致PC12細(xì)胞形態(tài)及存活率的影響Fig.2 Effects of CoQ10 on morphology and survival rate of PC12 cells

2.3細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)如圖3所示，模型組Rot處理細(xì)胞24 h后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，提示細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高；治療組CoQ10預(yù)處理3 h后熒光強(qiáng)度減弱，提示細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低(P<0.01)，CoQ10組熒光強(qiáng)度與vehicle組相比稍有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4水溶性CoQ10對(duì)凋亡誘導(dǎo)蛋白AIF及凋亡信號(hào)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9、active-Caspase-3表達(dá)的影響Rot處理24 h，PC12細(xì)胞核內(nèi)AIF表達(dá)升高顯著，凋亡信號(hào)蛋白的表達(dá)也發(fā)生明顯改變，主要表現(xiàn)為Bcl-2表達(dá)降低(P<0.01)，Bax、Caspase-9表達(dá)增多(P<0.01)，active-Caspase-3表達(dá)也顯著增多(P<0.05)。水溶性CoQ10可逆轉(zhuǎn)上述凋亡信號(hào)蛋白的表達(dá)(圖4)。

圖3 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的測(cè)定Fig.3 Determination of active oxygen level in cells

3 討 論

PD的發(fā)病機(jī)制目前仍存在爭(zhēng)議，線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡都是引起PD的重要原因[10-11]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的重要細(xì)胞器，在能量代謝及細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其能量的產(chǎn)生依賴(lài)于由5個(gè)酶復(fù)合體(復(fù)合體Ⅰ～Ⅴ)組成的線粒體呼吸鏈的電子傳遞，線粒體呼吸鏈不僅能夠產(chǎn)生能量，還是體內(nèi)自由基產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，其任何部位受到損傷都會(huì)導(dǎo)致自由基生成增多。復(fù)合體Ⅰ(NADH-CoQ還原酶)是最大的一個(gè)，也是最易受損傷的一個(gè)。CoQ10是復(fù)合體Ⅰ的重要組成部分，是Ⅰ/Ⅱ的電子受體，同時(shí)還是重要的天然抗氧化劑，能夠清除自由基，促進(jìn)線粒體生成ATP。Rot作為生活中常見(jiàn)的殺蟲(chóng)劑，是線粒體復(fù)合體Ⅰ的選擇性抑制劑，可抑制線粒體呼吸鏈生成ATP，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性損傷的重要因素，它能啟動(dòng)環(huán)境因素誘發(fā)PD，同時(shí)可在細(xì)胞其他因素參與下得以不斷加強(qiáng)。本研究觀察到PC12細(xì)胞經(jīng)過(guò)Rot處理24 h后細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著增多，給予CoQ10治療后細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，提示CoQ10可以降低Rot誘導(dǎo)的ROS水平升高，表明CoQ10可通過(guò)清除胞質(zhì)中過(guò)多的氧自由基發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

圖4 CoQ10對(duì)AIF、Bcl-2、Bax、Caspase-9及active Caspase-3表達(dá)的影響Fig.4 Effects of CoQ10 on AIF，Bcl-2，Bax，Caspase-9 and active Caspase-3 expressions

本研究發(fā)現(xiàn)，Rot對(duì)PC12細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，隨著Rot濃度升高，細(xì)胞損傷越明顯，突觸明顯縮短甚至消失，細(xì)胞存活率也降低，CoQ10可以改善Rot導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷和凋亡。PD是病理性細(xì)胞凋亡所導(dǎo)致的一系列病理過(guò)程，內(nèi)源性及外源性途徑均能誘發(fā)細(xì)胞凋亡，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)至少有3條通路參與細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)生，即線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，其中以線粒體通路最為經(jīng)典[12-13]。位于線粒體膜上的Bcl-2蛋白家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，Bcl-2蛋白家族分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，前者包括Bcl-2、Bcl-xl等，后者包括Bax、Bad等。有研究表明，Bcl-2可通過(guò)抵抗細(xì)胞內(nèi)ROS的毒性阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡[14]。Bcl-2/Bax表達(dá)比率的升高可使細(xì)胞免于凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白，包括無(wú)活性的前體procaspase-3和活化的active Caspase-3，在正常細(xì)胞中含量很低。生理狀態(tài)下，AIF存在于線粒體內(nèi)外膜之間，是線粒體氧化還原酶，當(dāng)受到凋亡刺激后，將會(huì)在通過(guò)核定位序列轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，引起染色體的凝集和DNA的損傷，啟動(dòng)不依賴(lài)于Caspase的細(xì)胞凋亡[15-16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Rot處理后的PC12細(xì)胞Bcl-2/Bax的表達(dá)比率下調(diào)，原本低表達(dá)的active Caspase-3也大量表達(dá)。CoQ10可使Bcl-2/Bax的表達(dá)比率升高，即上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax，同時(shí)降低active Caspase-3的表達(dá)。

綜上所述，水溶性CoQ10對(duì)Rot致PC12細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，以及上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax，同時(shí)降低active Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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