TNF-α通過Wnt/β-catenin信號通路促進結(jié)腸癌細胞的增殖

余鈞輝，孫學軍，鄭見寶，王 煒，楊 魁，魏光兵

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院普通外科，陜西西安 710061)

結(jié)直腸癌是目前最為常見的惡性腫瘤之一，其全球范圍的綜合發(fā)病率在惡性腫瘤中男性排名第3，女性排名第2[1]。近年來隨著生活水平的提高、飲食習慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在我國呈逐年增長的趨勢。2013年，我國結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)34.8萬，死亡病例數(shù)16.5萬，分別位居惡性腫瘤發(fā)病率和腫瘤相關(guān)死亡率的第4位和第5位[2]。然而，結(jié)直腸癌的發(fā)病機制仍未完全闡明。目前的研究發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生及進展密切相關(guān)[3]。TNF-α是腫瘤炎癥微環(huán)境中重要的促炎癥細胞因子[4]。目前研究表明，炎癥中升高的TNF-α可促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。關(guān)于TNF-α對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響目前鮮有報道。

高度保守的Wnt/β-catenin信號通路在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其他生理過程中，具有重要的作用，且Wnt/β-catenin信號通路異常地激活及表達對腫瘤的發(fā)生及發(fā)展都起到至關(guān)重要的作用[6]。腸上皮炎癥損傷中，TNF-α與異常激活的Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)[7]。本實驗擬研究TNF-α對結(jié)腸癌細胞增殖的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器TNF-α購自美國R&D Systems公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Corning公司；胎牛血清購自法國Biowest公司；XAV939購自美國Selleck公司；MTT購自美國Sigma公司；β-catenin、c-myc、cyclinD1及GAPDH均購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及TNF-α處理 人結(jié)腸癌細胞株HT-29為本實驗室長期保存，采用RPMI 1640培養(yǎng)基(含100 mL/L胎牛血清)，于37 ℃ 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并更換細胞培養(yǎng)液1次，待細胞長滿約70%～80%時用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞用于實驗。實驗分為實驗組(TNF-α 10 nmol/L)和對照組(Control)。

1.2.2MTT法 將人結(jié)腸癌細胞株HT-29按照5×103個孔接種于96孔板中，實驗分組同上，每組設(shè)4個復孔，未接種細胞的孔中加入RBMI 1640培養(yǎng)基作為調(diào)零孔，接種后24、48、72、96 h各檢測1次，每孔加入MTT 20 μL繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標儀檢測其490 nm處吸光度值(A)。實驗重復3次。

1.2.3細胞生長曲線法 將人結(jié)腸癌細胞株HT-29按照5×103個/孔接種于96孔板中，實驗分組同上，每組設(shè)4個復孔，接種后24、48、72、96 h分別細胞計數(shù)。實驗重復3次。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期 接種前48 h換為無血清培養(yǎng)，24 h后再換成含100 mL/L胎牛血清的RBMI 1640培養(yǎng)基，按2×105個/孔接種人結(jié)腸癌細胞株HT-29于6孔板中，實驗分組同上，用胰酶消化收集各組細胞并用預冷PBS洗滌3次，1 000 r/min，5 min/次，棄上清加入-20 ℃預冷的750 mL/L冰乙醇1 mL，固定細胞置于4 ℃冰箱過夜， 檢測前離心(1 000 r/min，5 min)，PBS洗滌2次，加入100 μL PBS并將細胞吹懸，用含0.1 g/L RNase和5 g/L碘化丙啶PI 4 ℃處理細胞20 min，過300目尼龍網(wǎng)。送流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.2.5Western blot 按2×105個/孔接種人結(jié)腸癌細胞株HT-29于6孔板中，實驗分組同上，48 h后收集各組細胞提取細胞總蛋白并用BCA法檢測總蛋白濃度，每組樣本取10 μL進行SDS-PAG垂直電泳，濕轉(zhuǎn)法將膠中蛋白水平轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂牛奶在37 ℃搖床上封閉1 h，先后分別加入TBST稀釋后的一抗(4 ℃過夜)、二抗，經(jīng)ECL顯影凝膠成像系統(tǒng)掃描采用相關(guān)圖像分析軟件Bio-rad Quantity One, CA)進行條帶灰度分析，GAPDH作為參照蛋白。實驗重復3次。

2 結(jié) 果

2.1TNF-α對結(jié)腸癌細胞增殖的影響本研究采用細胞生長曲線和MTT法，研究TNF-α對結(jié)腸癌細胞HT-29增殖的影響。如圖1A、B所示，相比對照組細胞，實驗組細胞(TNF-α 10 nmol/L)的生長速度在24 h沒有統(tǒng)計學差異(P均>0.05)，而在48、72、96 h明顯增快(P均<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示TNF-α具有促進結(jié)腸癌細胞增殖的作用。

2.2TNF-α對結(jié)腸癌細胞周期的影響為了進一步研究TNF-α促進結(jié)腸癌細胞增殖的作用機制，本實驗采用流式細胞儀檢測TNF-α對結(jié)腸癌細胞周期的影響。如圖2A、B，相比對照組細胞，實驗組細胞(10nmol/L)中G0/G1期細胞明顯減少(P<0.05)，S期細胞明顯增多(P<0.05)，G2/M期細胞比例沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。研究結(jié)果表明TNF-α促進結(jié)腸癌細胞增殖的作用可能通過加速細胞周期G1/S轉(zhuǎn)化有關(guān)。

圖1 TNF-α對結(jié)腸癌細胞增殖的影響Fig.1 Effect of treatment with TNF-α on proliferation of colon cancer cells

2.3TNF-α通過Wnt/β-catenin信號通路促進結(jié)腸癌細胞的增殖本研究采用Western blot檢測對TNF-α對結(jié)腸癌細胞中β-catenin、c-myc及cyclinD1表達的影響。相比對照組，實驗組細胞(TNF-α 10 nmol/L)中β-catenin、c-myc及cyclinD1的蛋白表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05，圖3A、B)。研究結(jié)果表明TNF-α可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路從而促進結(jié)腸癌細胞的增殖。

2.4XAV939通過抑制Wnt/β-catenin信號通路減弱TNF-α對結(jié)腸癌細胞增殖的作用為了進一步研究Wnt/β-catenin信號通路在促進結(jié)腸癌細胞增殖的作用，本研究采用XAV939阻斷Wnt/β-catenin信號通路后，觀察TNF-α對結(jié)腸癌細胞增殖及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的作用。如圖4A、B所示，細胞生長曲線和MTT法顯示相比TNF-α組細胞，TNF-α+XAV939組結(jié)腸癌細胞增殖在24 h均沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而在48、72、96 h明顯增快(P均<0.05)，表明XAV939減弱了TNF-α對結(jié)腸癌細胞增殖的促進作用。與上述功能性研究一致，Western blot結(jié)果顯示，相比TNF-α組細胞，TNF-α+XAV939組結(jié)腸癌細胞中β-catenin、c-myc及cyclinD1的蛋白表達上調(diào)明顯抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05，圖5A、B)，表明XAV939減弱了TNF-α對細胞β-catenin、c-myc及cyclinD1等蛋白的促進作用。上述研究結(jié)果進一步表明TNF-α可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進結(jié)腸癌細胞的增殖。

圖2 TNF-α對結(jié)腸癌細胞HT-29細胞周期的影響Fig.2 Effect of treatment with TNF-α on cell cycle distribution of colon cancer cells

3 討 論

近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率持續(xù)地增長，已經(jīng)成為我國最為嚴重的惡性腫瘤之一。目前研究表明結(jié)直腸癌的發(fā)生是多因素、多步驟相互作用的復雜過程[8]。腫瘤炎癥微環(huán)境在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用受到越來越多的重視。結(jié)腸癌腫瘤中聚集的淋巴細胞及巨噬細胞與血管的形成密切相關(guān)[9]。TNF-α是由巨噬細胞分泌的一種促炎癥細胞因子，是腫瘤炎癥微環(huán)境中關(guān)鍵的介質(zhì)，更是被認為是腫瘤形成的的危險因子[10]。本研究發(fā)現(xiàn)給予結(jié)腸癌細胞10 nmol/L TNF-α處理后，細胞的生長速度明顯快于對照組細胞。進一步的細胞周期分析提示10 nmol/L TNF-α處理后可明顯加速結(jié)腸癌細胞G1/S轉(zhuǎn)化。因此，可以推測TNF-α促進結(jié)腸癌細胞增殖可能與其加速細胞G1/S轉(zhuǎn)化有關(guān)。ZHU等[11]研究表明在膽囊癌中，下調(diào)TNF-α的表達可明顯抑制細胞的增殖。在胰腺導管腺癌中，TNF-α可促進肝素結(jié)合細胞因子(Midkine)的表達，進而促進細胞的增殖[12]。在肝癌中，TNF-α通過ROS/HIF-1/FoxM1信號通路促進肝癌細胞的增殖與侵襲[13]。因此，作為腫瘤炎癥微環(huán)境中關(guān)鍵的促炎因子，TNF-α通過調(diào)控腫瘤細胞增殖，在多種腫瘤的形成及進展中發(fā)揮著重要的作用。

圖3 TNF-α對結(jié)腸癌細胞HT-29中β-catenin、c-myc及cyclinD1蛋白表達的影響Fig.3 Effect of treatment with TNF-α on β-catenin, c-myc and cyclinD1 protein expressions of HT-29 cells

圖4 XAV939阻斷Wnt/β-catenin信號通路對TNF-α促進細胞增殖的影響Fig.4 Effect of blockage of the Wnt/β-catenin pathway by XAV939 on cell proliferation enhanced by TNF-α

圖5 XAV939阻斷Wnt/β-catenin信號通路對TNF-α促進細胞β-catenin、c-myc及cyclinD1蛋白表達的影響Fig.5 Effect of blockage of the Wnt/β-catenin pathway by XAV939 on β-catenin, c-myc and cyclinD1 protein expressions enhanced by TNF-α

Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，引起β-catenin的核轉(zhuǎn)位及靶基因的續(xù)貫激活，是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中最重要的分子事件之一[14]。Wnt/β-catenin信號通路激活與腫瘤細胞的致瘤性、增殖和侵襲等生物學功能密切相關(guān)[15]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α促進結(jié)腸癌細胞中β-catenin、c-myc及cyclinD1蛋白的表達。用XAV939阻斷Wnt/β-catenin信號通路后，逆轉(zhuǎn)了TNF-α對結(jié)腸癌細胞增殖的促進作用。Western blot結(jié)果顯示，XAV939減弱了TNF-α對結(jié)腸癌細胞β-catenin、c-myc及cyclinD1等蛋白的促進作用。上述研究證實TNF-α可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進結(jié)腸癌細胞的增殖。

研究報道，炎癥微環(huán)境中TNF-α可通過多種信號通路或途徑促進細胞增殖。ZHOU等[16]報道在常染色體顯性遺傳的多囊性腎病中，TNF-α可通過ERK/MAPK/Cdk2和PI3K/AKT/mTOR分別引起轉(zhuǎn)錄因子Id2的核轉(zhuǎn)位和表達升高，進而轉(zhuǎn)錄抑制p21的表達，從而促進細胞的增殖。在結(jié)腸癌中，TNF-α可通過促進纖維母細胞分泌COX-2，產(chǎn)生更多的PGE2，進而影響結(jié)腸癌細胞的增殖，且可能通過PKC途徑[17]。

目前，關(guān)于TNF-α激活Wnt/β-catenin信號通路的分子機制尚不清楚。COSKUN等[18]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可下調(diào)CDX2的表達，進而導致β-catenin降解復合物(APC、GSK3β和Axin2)的降低，從而引起β-catenin的核轉(zhuǎn)位和下游靶基因的激活。另外，有研究報道在結(jié)腸癌中，CDX2可與β-catenin直接結(jié)合，抑制β-catenin/TCF復合物的轉(zhuǎn)錄活性，抑制靶基因c-myc和cyclinD1的表達，從而抑制結(jié)腸癌細胞的增殖[19]。然而，TNF-α激活Wnt/β-catenin信號通路的分子機制仍有待于完整的研究，這也是本實驗接下來的研究方向。

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