激活或阻斷內(nèi)側(cè)隔斜角帶復(fù)合體中5-HT1A受體對(duì)帕金森病模型大鼠認(rèn)知功能的影響

李立博，李坤穎，郭方圓，李文娟，席 悅，喬鴻飛，楊 峰，張巧俊

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，陜西西安 710004)

認(rèn)知功能障礙是帕金森病(Parkinson’s disease, PD)常見的非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀，在PD患者中發(fā)病率高達(dá)40%，導(dǎo)致患者的執(zhí)行能力和記憶力下降[1]。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)遞質(zhì)系統(tǒng)與高級(jí)認(rèn)知功能密切相關(guān)[2]。5-HT1A受體在與認(rèn)知功能密切相關(guān)的核團(tuán)中分布廣泛。體循環(huán)給予5-HT1A受體激動(dòng)劑，損害了大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶、目標(biāo)識(shí)別和被動(dòng)回避能力，阻斷5-HT1A受體可以改善記憶損害[3]。這些研究說明5-HT1A受體與認(rèn)知功能密切相關(guān)。

內(nèi)側(cè)隔斜角帶復(fù)合體(medial septum-diagonal band of Broca complex, MS-DB)在認(rèn)知過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MS-DB通過調(diào)節(jié)海馬theta節(jié)律影響認(rèn)知功能，theta節(jié)律是海馬神經(jīng)元同步化活動(dòng)形成的局部場電位，與記憶有關(guān)[4]。MS-DB是theta節(jié)律形成的關(guān)鍵核團(tuán)[5]，該核團(tuán)接受來自中縫中核(median raphe nucleus, MRN)的5-HT能纖維投射，表達(dá)多種5-HT受體亞型，以5-HT1A受體最為豐富[6]。因此，激活或阻斷MS-DB中的5-HT1A受體可能是通過調(diào)節(jié)海馬theta節(jié)律影響PD認(rèn)知功能，而目前并未見研究探討MS-DB中5-HT1A受體對(duì)PD認(rèn)知障礙的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。因此，本研究以6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)損毀的PD模型大鼠為研究對(duì)象，采用行為學(xué)和電生理學(xué)方法，觀察激活或阻斷MS-DB中5-HT1A受體對(duì)PD認(rèn)知功能和海馬theta節(jié)律的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑用健康、雄性Sprague-Dawley大鼠(270～320 g)，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，12 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水。嚴(yán)格執(zhí)行西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的相關(guān)規(guī)定，盡量減輕痛苦并減少大鼠的使用數(shù)量。

6-OHDA、阿樸嗎啡(apomorphine, APO)、8-OH-DPAT及WAY100635均購自美國Sigma公司。2 mg 6-OHDA溶于1 mL含0.2 g/L抗壞血酸的生理鹽水，0.05 g APO溶于100 mL含0.2 g/L抗壞血酸的生理鹽水、8-OH-DPAT及WAY100635均溶解于生理鹽水。所有溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及大鼠PD模型的建立隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組。模型組大鼠又隨機(jī)分為4個(gè)亞組，分別為生理鹽水組、8-OH-DPAT組、WAY-100635組和WAY-100635+8-OH-DPAT組。建立PD模型的方法[7]應(yīng)用6-OHDA損毀單側(cè)(左側(cè))內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle, MFB)。水合氯醛(400 mg/kg, i.p.)麻醉大鼠并將其頭部固定于腦立體定位儀上。依據(jù)Paxinos-Watson大鼠腦立體定位圖譜確定左側(cè)MFB的位置(AP -4.4 mm，L 1.2 mm，D 7.8～7.9 mm)，利用微電極推進(jìn)器將玻璃微電極推送至目標(biāo)位置后，緩慢注射6-OHDA(術(shù)前4 ℃避光保存)。假手術(shù)組大鼠注射等量含0.2 g/L抗壞血酸的生理鹽水，手術(shù)方法同模型組大鼠。

采用APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為實(shí)驗(yàn)檢測是否成功建立PD模型。造模后第3周，大鼠頸部皮下注射APO(0.05 mg/kg，s.c.)，若大鼠在注藥后1～15 min出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，且旋轉(zhuǎn)速度超過6圈/min，并且在5 min內(nèi)大于20圈者，則視為成功的PD模型[8]。本實(shí)驗(yàn)中，皮下注射APO使大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)均大于30圈/5 min。

1.3導(dǎo)向套管埋置造模后第3周，模型組大鼠行導(dǎo)向套管埋置術(shù)。依據(jù)腦立體定位圖譜確定左側(cè)MS-DB的位置(AP 0.3 mm, L 1.1 mm, D 5.5 mm)[9]，將不銹鋼套管(長2.0 mm，直徑0.6 mm)在冠狀面與中線成10°角進(jìn)針以免損傷矢狀竇，推進(jìn)至左側(cè)MS-DB上方1.0 mm的位置。然后用牙托粉將套管固定，等待牙托粉完全凝固后向套管內(nèi)插入長約2.0 mm的不銹鋼內(nèi)芯防止套管堵塞。術(shù)后大鼠恢復(fù)1周。

1.4核團(tuán)內(nèi)藥物注射行為學(xué)檢測前5 min，按照1.2實(shí)驗(yàn)分組，分別經(jīng)套管在左側(cè)MS-DB內(nèi)分別注射生理鹽水(溶媒)、8-OH-DPAT(高親和力5-HT1A受體激動(dòng)劑，0.25 μg/只)、WAY-100635(選擇性5-HT1A受體拮抗劑，1.5 μg/只)或WAY-100635(1.5 μg/只)+8-OH-DPAT(0.25 μg/只)。對(duì)于注射WAY-100635+8-OH-DPAT的大鼠，先后注射兩種藥物，間隔時(shí)間為5 min。

1.5T-迷宮實(shí)驗(yàn)T-迷宮實(shí)驗(yàn)用來檢測大鼠的工作記憶，參照DEACON和RAMOS-MORENO等[10]的方法，大鼠先進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后進(jìn)行18次連續(xù)選擇試驗(yàn)，具體方法如下：T-迷宮具有兩側(cè)目標(biāo)臂，每次試驗(yàn)均將巧克力置于一側(cè)目標(biāo)臂，隨后將大鼠置于起始區(qū)，讓其自由選擇，若大鼠進(jìn)入放置巧克力的目標(biāo)臂并進(jìn)食巧克力，則認(rèn)為選擇正確，下次試驗(yàn)將巧克力置于另一側(cè)目標(biāo)臂；若大鼠進(jìn)入未放置巧克力的目標(biāo)臂，則認(rèn)為選擇錯(cuò)誤，不改變巧克力的放置位置，直到其選擇正確再更換位置，連續(xù)進(jìn)行18次選擇試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算選擇正確率(正確選擇次數(shù)/18×100%)。

1.6海馬場電位(localfieldpotential,LFP)記錄確定左側(cè)海馬的坐標(biāo)位置(AP -5 mm，L 3 mm，D 3.2 mm)[9]，采用單極電極記錄，記錄到的LFP經(jīng)MEZ-8301微電極放大器、AVB-11A前置放大器(濾波1～100 Hz)放大，顯示于VC-11示波器上，并通過生物電信號(hào)采集與分析系統(tǒng)CED1401 Spike2顯示并儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)，采樣頻率設(shè)置為100 Hz，記錄穩(wěn)定的海馬LFP后，通過給藥電極在MS-DB局部注射體積各100 nL的8-OH-DPAT(0.05 μg)或WAY-100635(0.3 μg)，給藥后持續(xù)記錄30 min，然后通過玻璃微電極電泳滂胺天藍(lán)標(biāo)記記錄位點(diǎn)(―20 μA，15 min)。海馬LFP的分析采用：每只老鼠隨機(jī)截取5段LFP信號(hào)(每段10 s)，功率譜峰頻率在3～6 Hz頻帶范圍內(nèi)為theta節(jié)律。分析theta節(jié)律的峰頻率和標(biāo)準(zhǔn)化功率，其中峰頻率為theta頻帶的峰值，標(biāo)準(zhǔn)化功率為theta頻帶的功率占1～50 Hz頻帶總功率的百分比[11]。

1.7組織學(xué)和免疫組織化學(xué)電生理記錄結(jié)束后，大鼠灌注固定，行連續(xù)冠狀冰凍切片。行尼氏染色用于觀察MS-DB和海馬的結(jié)構(gòu)及記錄位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，行酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)免疫組織化學(xué)染色法確認(rèn)腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area, VTA)和黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)中多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元的變性丟失程度，行5-HT1A受體免疫熒光染色明確該受體在MS-DB的表達(dá)。染色后，每只大鼠選取相應(yīng)位置的3張切片進(jìn)行SNc及VTA中TH陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)并取平均值，核與胞質(zhì)完整的細(xì)胞方可納入統(tǒng)計(jì)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)于行為學(xué)數(shù)據(jù)，假手術(shù)組和模型組大鼠在T-迷宮中選擇正確率的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，局部給予8-OH-DPAT、WAY-100635后選擇正確率的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。對(duì)于電生理學(xué)數(shù)據(jù)，假手術(shù)組和模型組大鼠海馬theta節(jié)律的峰頻率和標(biāo)準(zhǔn)化功率的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，局部給藥后峰頻率和標(biāo)準(zhǔn)化功率的改變采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TH陽性神經(jīng)元的計(jì)數(shù)假手術(shù)組大鼠的鹽水注射側(cè)SNc和VTA中TH陽性神經(jīng)元的數(shù)目輕度降低，與未注射側(cè)相比分別減少(2±1)%和(3±1)%(n=9)。模型組大鼠的損毀側(cè)SNc中的TH陽性神經(jīng)元完全缺失，而VTA中TH陽性神經(jīng)元的數(shù)目則顯著減少到未損毀側(cè)的(35±1)% (n=9，P<0.05，圖1)。

圖1 模型組大鼠SNc和VTA的TH免疫組織化學(xué)染色(A)及損毀側(cè)與未損毀側(cè)VTA中DA能神經(jīng)元數(shù)量的比較(B)Fig.1 Photomicrographs of TH immunohistochemical staining in coronal section of the midbrain in the 6-OHDA-lesioned rats (A) and the SNc and VTA DA neurons on the injected side compared to uninjected side (B)

2.2MFB損毀及5-HT1A受體的激活和阻斷對(duì)大鼠工作記憶的影響模型組大鼠在T-迷宮實(shí)驗(yàn)中的平均選擇正確率[(28±1)%]與假手術(shù)組[(56±3)%]相比明顯降低(n=9，P<0.05，圖2A)。單因素方差分析結(jié)果顯示，模型組大鼠MS-DB局部注射藥物對(duì)選擇正確率產(chǎn)生顯著影響(F=22.84，P<0.001，圖2B)，檢驗(yàn)后多重比較顯示，局部注射激動(dòng)劑8-OH-DPAT(0.25 μg/0.5 μL)組與溶媒組相比，顯著降低了選擇正確率(P<0.05，圖2B)，而拮抗劑WAY-100635(1.5 μg/0.5 μL)組顯著增加了選擇正確率(P<0.05，圖2B)。預(yù)先給予WAY-100635(WAY-100635+8-OH-DPAT)可以阻斷8-OH-DPAT的效應(yīng)(與溶媒組相比，P>0.05；與8-OH-DPAT組相比，P<0.05，圖2B)。

2.3MFB損毀及5-HT1A受體的激活和阻斷對(duì)海馬theta節(jié)律的影響假手術(shù)組大鼠海馬theta節(jié)律的峰頻率和標(biāo)準(zhǔn)化功率分別為(4.6±0.1)Hz和(32.0±8.0)%(n=8，圖3A、C、E、F)。模型組大鼠海馬theta節(jié)律的峰頻率為(4.0±0.2)Hz，較假手術(shù)組顯著降低(n=8，P<0.05，圖3B、D、E)，標(biāo)準(zhǔn)化功率為(36.0±8.0)%(圖3F)，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3F)。

圖2 MFB損毀和MS-DB局部注射5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT或拮抗劑WAY-100635對(duì)大鼠工作記憶的影響Fig.2 Effects of unilateral 6-OHDA lesion of the MFB, intra-MS-DB injection of 5-HT1A receptor agonist 8-OH-DPAT and the selective antagonist WAY-100635 on working memory measured by T-maze rewarded alternation tests

圖3 假手術(shù)組和模型組大鼠海馬theta節(jié)律的比較Fig.3 Power spectrum from LFP sequences during theta rhythm in sham-operated and 6-OHDA-lesioned rats

模型組大鼠與給藥前相比，局部給予8-OH-DPAT(0.05 μg/100 nL)抑制了海馬theta節(jié)律(圖4)，量化分析結(jié)果顯示，8-OH-DPAT降低了theta節(jié)律的標(biāo)準(zhǔn)化功率(n=8，P<0.05；圖5)，標(biāo)準(zhǔn)化功率較基礎(chǔ)功率降低(61.7±6.8)%，體循環(huán)給予WAY-100635(100 μg/kg, i.v)可恢復(fù)theta節(jié)律，并使其標(biāo)準(zhǔn)化功率升高到基礎(chǔ)功率的(206.0±42.1)%(n=6，圖4、圖5)。與給藥前對(duì)照組相比，局部給予WAY-100635(0.3 μg/100 nL)可誘發(fā)海馬theta節(jié)律(圖4)，顯著升高theta節(jié)律的標(biāo)準(zhǔn)化功率(n=8，P<0.05)；較基礎(chǔ)功率升高[(248.9±59.0)%，n=8，圖5]。

圖4 模型組大鼠MS-DB局部注射8-OH-DPAT、WAY-100635對(duì)海馬theta節(jié)律的影響Fig.4 Effects of local application of 8-OH-DPAT and WAY-100635 on hippocampal theta rhythm of the 6-OHDA-lesioned rats

圖5 模型組大鼠MS-DB局部注射8-OH-DPAT、WAY-100635對(duì)海馬theta節(jié)律標(biāo)準(zhǔn)化功率的影響Fig.5 Effects of local application of 8-OH-DPAT and WAY-100635 on normalized theta power of hippocampal theta rhythm of the 6-OHDA-lesioned rats

2.45-HT1A受體的表達(dá)變化模型組大鼠MS-DB中5-HT1A受體的熒光強(qiáng)度為(29.50±1.29)/μm2，較假手術(shù)組的(50.25±4.65)/μm2顯著降低(n=5，P<0.001，圖6)。

圖6 假手術(shù)組(A)和模型組(B)大鼠MS-DB中5-HT1A受體的免疫熒光染色結(jié)果Fig.6 Representative photomicrographs of 5-HT1A immunofluorescent staining in coronal section of MS-DB in sham-operated (A) and the 6-OHDA-lesioned (B) rats

3 討 論

關(guān)于PD模型大鼠是否存在認(rèn)知障礙的研究結(jié)果目前并不一致。一些研究發(fā)現(xiàn)6-OHDA或MPTP損毀的PD模型大鼠存在認(rèn)知功能障礙[12]，而另一些研究則表明6-OHDA損毀并未改變認(rèn)知行為[13]。這種分歧可能與藥物的注射位點(diǎn)、注射劑量、損毀方式、損毀時(shí)間、損毀程度和檢測認(rèn)知功能的方法不同等多種因素相關(guān)。T-迷宮實(shí)驗(yàn)是一種評(píng)估工作記憶的行為學(xué)方法[10]，大鼠在T-迷宮實(shí)驗(yàn)中的選擇正確率越高，反映其工作記憶越強(qiáng)。在本研究中，單側(cè)MFB完全損毀降低了大鼠在T-迷宮實(shí)驗(yàn)中的選擇正確率，提示單側(cè)黑質(zhì)-紋狀體通路變性導(dǎo)致工作記憶損害，該研究結(jié)果與以往的報(bào)道一致，這可能與海馬theta節(jié)律的電活動(dòng)改變有關(guān)。研究證實(shí)，海馬theta節(jié)律參與了記憶編碼過程，theta節(jié)律的峰頻率越高，大鼠在十字迷宮中的正確選擇率越高[14]，而theta節(jié)律的降低與T-迷宮選擇正確率降低有關(guān)[15]，這些結(jié)果說明海馬theta節(jié)律與工作記憶呈正相關(guān)。本研究中，MFB損毀引起海馬theta節(jié)律的抑制，這是PD模型大鼠工作記憶損害的一個(gè)重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，MS-DB局部注射5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT進(jìn)一步降低模型組大鼠在T-迷宮實(shí)驗(yàn)中的選擇正確率，提示局部給予8-OH-DPAT損害了工作記憶。這與BERTRAND等[16]的研究結(jié)果類似，其研究發(fā)現(xiàn)隔區(qū)局部注射8-OH-DPAT損害正常大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的空間學(xué)習(xí)能力。分析其原因如下：5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)對(duì)認(rèn)知功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[17]，越來越多的證據(jù)表明，5-HT1A受體與記憶密切相關(guān)。MS-DB表達(dá)豐富的5-HT1A受體，該受體為G蛋白耦聯(lián)受體，可分別作為自身受體和突觸后受體分布于縫核和其他腦區(qū)的多種神經(jīng)元，激活后抑制神經(jīng)元的電活動(dòng)。本研究電生理學(xué)結(jié)果顯示，模型組大鼠MS-DB局部給予8-OH-DPAT進(jìn)一步降低了海馬theta節(jié)律的峰頻率，提示5-HT1A受體的激活抑制海馬theta節(jié)律，這種抑制活動(dòng)有可能是模型大鼠工作記憶減弱的重要因素。此外，8-OH-DPAT對(duì)5-HT7受體亦存在一定程度的親和力，其可能通過5-HT7受體損害工作記憶。5-HT7受體廣泛分布于多個(gè)腦區(qū)，在MS-DB有少量表達(dá)[18]，可與GS蛋白相結(jié)合后激活腺苷酸環(huán)化酶，興奮神經(jīng)元的電活動(dòng)。但是，有實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮檢測大鼠空間記憶，在隔核局部注射8-OH-DPAT所誘發(fā)的作用可被5-HT1A受體拮抗劑阻斷，而5-HT7受體拮抗劑并未發(fā)揮作用[19]，提示了8-OH-DPAT對(duì)大鼠工作記憶的作用是由5-HT1A受體介導(dǎo)的，而非5-HT7受體。

同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)MS-DB局部注射WAY100635改善PD模型大鼠的工作記憶。WAY100635是一種選擇性5-HT1A受體拮抗劑，對(duì)5-HT1A受體具有高度親和力。本研究與MADJID等[20]的發(fā)現(xiàn)一致，即阻斷5-HT1A受體可增強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)能力。這一結(jié)果恰好可以用本研究的電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解釋，即WAY100635可以誘發(fā)海馬theta節(jié)律，并使theta節(jié)律的峰頻率升高，而theta節(jié)律又與記憶能力呈正相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，單側(cè)MFB損毀損害大鼠的工作記憶，這與海馬theta節(jié)律的活動(dòng)減弱有關(guān)。阻斷MS-DB中的5-HT1A受體可改善PD模型大鼠的工作記憶，這是通過興奮海馬theta節(jié)律實(shí)現(xiàn)的。提示MS-DB中5-HT1A受體參與了PD大鼠工作記憶的調(diào)節(jié)，為PD認(rèn)知障礙的治療提供了新的靶點(diǎn)。

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