利用全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程提高菌株耐受性研究進(jìn)展

郭學(xué)武，張 玉，陳葉福，肖冬光

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

微生物在環(huán)境變化過程中的反應(yīng)能力對于其在自然環(huán)境下的生存至關(guān)重要，因?yàn)槠淇赡芙?jīng)常處于熱或冷、極端 pH、滲透壓改變、營養(yǎng)饑餓和有毒化合物的極端環(huán)境下．同樣，在工業(yè)生產(chǎn)中微生物也會面臨極端環(huán)境，例如，通過利用木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物作為碳源生產(chǎn)生化物質(zhì)、生物燃料以及生物材料，木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物(呋喃衍生物、酚類化合物和有機(jī)酸)和抑制產(chǎn)物(乙醇、丁醇和異丁醇)中的有毒物質(zhì)會顯著抑制微生物發(fā)酵，因此嚴(yán)重阻礙了工業(yè)規(guī)模的生物煉制[1-3]．另外，當(dāng)產(chǎn)物本身是疏水性并且有細(xì)胞毒性時(shí)，微生物細(xì)胞本身會受到產(chǎn)物的壓力，在這些壓力下，產(chǎn)物的生成途徑不能正常工作，導(dǎo)致生產(chǎn)效率降低．盡管維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定可以確保細(xì)胞內(nèi)適當(dāng)?shù)姆€(wěn)態(tài)，但是當(dāng)細(xì)胞外環(huán)境改變破壞酶的最佳活性和代謝使細(xì)胞結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定時(shí)，也可以造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生波動，導(dǎo)致生產(chǎn)力和微生物活性降低．因此，在脅迫條件下，研究者們不斷尋找新的方法以提高微生物的耐受性以及保持代謝活性并促進(jìn)其高效生產(chǎn)．

近年來，提高菌株的耐受性成為人們的研究熱點(diǎn)，廣泛用于提高耐受性的方法為過表達(dá)微生物耐性相關(guān)基因如溶劑外排泵和熱休克蛋白等相關(guān)內(nèi)源或外源基因、長期適應(yīng)性進(jìn)化、人工誘變或基因組改組等[4-7]以提高微生物對藥物、滲透壓等各種壓力條件的耐受性．Patnaik等[8]通過全基因組重排的方法提高了乳酸菌(Lactobacillu)的耐酸性，使乳酸的產(chǎn)量提高了3倍；Fiocco等[9]通過過表達(dá)熱激蛋白(sHSP)改善了胚牙乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的抗寒性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)菌株對乙醇和丁醇的耐受性也得到提高；Borden等[10]通過在丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824中過表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CAC1869，發(fā)現(xiàn)菌株的丁醇耐受性提高了 81%；Tomas等[11]在硫解酶啟動子下過表達(dá)蛋白 groESL提高了丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824的丁醇耐受性；Park等[12]通過突變含鋅指基因的人工轉(zhuǎn)錄因子，篩選出了具有耐熱性的大腸桿菌(E．coli)；Alper 等[13]通過σ因子的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程(σ70)，使大腸桿菌對乙醇的耐受質(zhì)量濃度高達(dá)60,g/L，并且能夠同時(shí)耐受十二烷基磺酸鈉(SDS)；Gorsich 等[14]在ORFs缺失突變文庫中篩選出了具有糠醛耐受性的釀酒酵母．但在大多數(shù)情況下，因?yàn)榭姑{迫性是一個(gè)復(fù)雜的多基因表型，通過簡單地過表達(dá)某些功能基因或途徑，雖然在一定程度上有效，但不一定能夠達(dá)到所需的耐受水平．盡管長期的適應(yīng)性進(jìn)化和人工誘變或基因組改組方法沒有這樣的限制，但是非常耗時(shí)且費(fèi)力，并且所得到的表型難以轉(zhuǎn)化為新的菌株．而且，這些方法的固有缺點(diǎn)是獲得所需表型的總體具有隨機(jī)性，導(dǎo)致獲得所需耐受突變體的可能性降低．為打破以上局限，人們嘗試并建立了許多依賴特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子或 DNA結(jié)合序列改造微生物耐受性的方法，但由于仍局限在某一或特定基因簇中而達(dá)不到所期望的效果[15-17]．

由于細(xì)胞能夠通過調(diào)整自身全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制的某些組件，從而精細(xì)調(diào)節(jié)自身成百乃至上千個(gè)基因，基于該理論建立了全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程(global transcription machinery engineering，gTME)的方法能突破以上限制．gTME是一種全新的能在整體水平上改變細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄而獲得目的細(xì)胞表型的定向進(jìn)化方法，能在全局水平上強(qiáng)化微生物細(xì)胞的目標(biāo)性能，是在基因和細(xì)胞水平上改造微生物細(xì)胞的新途徑[18]．幾種轉(zhuǎn)錄因子包括含鋅指基因的人工轉(zhuǎn)錄因子[19-21]、σ因子[13,22]、Spt15[18]、H-NS[23]、Hha[24]和 cAMP[25-26]都是通過全局轉(zhuǎn)錄工程進(jìn)行修飾，以改善菌株耐受性及獲得其他優(yōu)良表型．

gTME 中研究較多的是σ因子，σ因子是 DNA依賴型 RNA 聚合酶的活性中心，與α,2ββ′ω亞基單元(RNA 聚合酶核心酶)構(gòu)成全酶，參與胞內(nèi)所有RNA的合成，其功能如圖 1[27]所示．σ因子能夠特異性地識別基因啟動子的-35區(qū)和-10區(qū)，并激活轉(zhuǎn)錄過程的起始．σ因子全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程的實(shí)施策略如圖2所示．隨著gTME方法的發(fā)展，目前已經(jīng)成功建立了利用轉(zhuǎn)錄因子工程提高菌種耐受各種抑制劑的方法，在提高菌種耐受性方面取得了一定的進(jìn)展.本文僅就全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程提高菌株耐受性的研究包括乙醇耐受性、有機(jī)溶劑耐受性、耐酸性、氧化應(yīng)激耐受性以及耐糖性進(jìn)行綜述．

圖1 全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子σ的功能示意圖Fig. 1 Function diagram of global transcriptional regulatory factor σ

圖2 σ因子全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程的實(shí)施策略Fig. 2 Implementation strategy of global transcription regulation project with factor σ

1 提高乙醇耐受性

生物的代謝途徑呈網(wǎng)絡(luò)體系，細(xì)胞中基因與表型之間并非線性對應(yīng)關(guān)系，細(xì)胞的特定表型往往由多個(gè)基因控制，因而只有在基因組水平上同時(shí)對控制目的表型的多個(gè)基因進(jìn)行修飾才有可能使得目的表型得到較高的表達(dá)，gTME 通過對調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄元件(σ因子和各種轉(zhuǎn)錄因子等)進(jìn)行合理化改組修飾(如易錯(cuò) PCR、DNA shuffling 等)，使得整個(gè)基因組的轉(zhuǎn)錄發(fā)生全局性改變，從而導(dǎo)致許多由多種基因控制的復(fù)雜的細(xì)胞表型得到改變，最終獲得需要的優(yōu)良表型．因此，將 gTME應(yīng)用于大腸桿菌(E．coli)，通過對全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子σ70(起始大部分基因在指數(shù)生長細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄)的誘變會改變啟動子的識別，進(jìn)而從全局轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄組的轉(zhuǎn)錄特征[28-29].將具有低、中和高突變率的σ70因子的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物混合在一起，并通過連續(xù)傳代培養(yǎng)以提高乙醇的耐受性．獲得σ70的突變株可以耐受 70,g/L的乙醇溶液，而親本只能耐受40,g/L的乙醇溶液．在同一研究中，用不同的方法成功篩選出了耐乙醇和十二烷基硫酸鈉(SDS)的多重耐受性表型[30]．Alper等[13]也證明了在大腸桿菌中σ70的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程可以提高菌株的乙醇耐受性，使乙醇的耐受性達(dá)到 60,g/L，同時(shí)菌株的 SDS耐受性也得到了提高，并可以大量生產(chǎn)番茄紅素．cAMP受體蛋白(CRP)在大腸桿菌中調(diào)節(jié)400多種基因，從而可以在轉(zhuǎn)錄水平上改善大腸桿菌的乙醇耐受性，Chong等[25]通過改造大腸桿菌的全局轉(zhuǎn)錄因子CRP以提高乙醇耐受性，在易錯(cuò)PCR庫中篩選出了乙醇耐受性最好的 CRP突變體E2(M59T)，在62,g/L乙醇中的生長速率為0.08,h-1，而對照菌株的僅為 0.06,h-1．隨后，將 M59T突變體整合到基因組中以產(chǎn)生突變體 iE2．當(dāng)暴露于150,g/L乙醇中時(shí)，15,min后iE2的存活率約為12%，而對照菌株的存活率為 0.01%,．對 CRP調(diào)節(jié)的 444個(gè)基因進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄 PCR分析(RT-PCR)揭示了在不含乙醇的情況下iE2中差異表達(dá)的基因有203個(gè)，而 92個(gè)基因在乙醇脅迫時(shí)顯示差異表達(dá)．這些基因?qū)儆谥袠兄虚g代謝(aceE、acnA、sdhD、sucA)、鐵離子運(yùn)輸(entH、entD、fecA、fecB)和一般應(yīng)激反應(yīng)(osmY、rpoS)等多種功能群．全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程不只應(yīng)用到大腸桿菌中，在其他細(xì)菌中也同樣適用．Tan等[31]在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中通過隨機(jī)誘變?nèi)洲D(zhuǎn)錄因子RpoD蛋白(σ70)，從易錯(cuò) PCR庫中篩選出了耐乙醇的突變菌株，培養(yǎng)54,h后殘?zhí)橇繛?.64%,，而對照菌株的殘?zhí)橇拷咏?5.43%,；在 9%,乙醇壓力下，突變菌株在30～54,h時(shí)乙醇產(chǎn)量為 13.0～14.1,g/L，對照菌株僅為 6.6～7.7,g/L．其研究結(jié)果表明，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中RpoD在提高乙醇耐受性方面發(fā)揮了重要作用，通過 gTME操縱 RpoD可以為復(fù)雜表型菌株的改良提供借鑒．

對于較復(fù)雜的真核微生物釀酒酵母的轉(zhuǎn)錄機(jī)制而言，gTME用于靶向RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子D的兩個(gè)組成部分，即 TATA結(jié)合蛋白復(fù)合體的成分SPT15和 TATA相關(guān)因子 TAF25．在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了兩個(gè)易錯(cuò) PCR基因文庫，并在葡萄糖和乙醇復(fù)合壓力下進(jìn)行篩選．研究[18]發(fā)現(xiàn)：SPT15突變文庫中乙醇耐受性提高的突變體SPT15-300中有3個(gè)氨基酸發(fā)生突變，在 6%,乙醇溶液和 100,g/L葡萄糖溶液中生長 20,h后，生長速度與野生型菌株相比提高了 13倍；在 10%～20%,乙醇體積分?jǐn)?shù)下，突變體的乙醇耐受性也有顯著提高．SPT15是酵母細(xì)胞存活必需的轉(zhuǎn)錄因子，通過結(jié)合 RNA聚合酶Ⅱ和十幾種基本的轉(zhuǎn)錄因子，可以轉(zhuǎn)錄基因組中大部分 mRNA，通過代謝工程方法也可以同時(shí)改變細(xì)胞中多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平．Yang等[32]應(yīng)用類似的方法篩選出了兩株乙醇耐受性提高的釀酒酵母菌株，在生物反應(yīng)器中用 20%,葡萄糖發(fā)酵 24,h 產(chǎn)生的乙醇比對照菌株提高 25%,，乙醇的產(chǎn)量和生產(chǎn)率也大大提高，分別由原來的0.31,g/g 和 2.6,g/(L·h)提高到 0.39,g/g 和 3.2,g/(L·h).由此研究表明，gTME篩選出的菌株不但增強(qiáng)了乙醇耐受性，還提高了乙醇產(chǎn)量．趙心清等[33]對釀酒酵母負(fù)責(zé)脅迫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的 SAGA復(fù)合體成分 SPT3編碼基因進(jìn)行易錯(cuò) PCR隨機(jī)突變，篩選得到了 1株在 10%,乙醇溶液中生長較好的突變株 M25．該突變株在 125,g/L葡萄糖中進(jìn)行乙醇發(fā)酵時(shí)，最終乙醇的產(chǎn)量比對照菌株提高了11.7%,．

全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程可通過改變?nèi)洲D(zhuǎn)錄調(diào)控因子對多基因控制的表型進(jìn)行有效的系統(tǒng)工程改造，而乙醇耐受性正是受多基因調(diào)控的．因此，全局轉(zhuǎn)錄工程是獲得乙醇耐受性高產(chǎn)菌株十分有效的方法之一.

2 提高有機(jī)溶劑耐受性

在全細(xì)胞生物催化中，如果存在不溶或難溶于水的底物或產(chǎn)物，通常采用非水系統(tǒng)(如有機(jī)溶劑)來促進(jìn)疏水底物和(或)產(chǎn)物的溶解[34]，然而有機(jī)溶劑對于大多數(shù)微生物是有毒的．這些有機(jī)溶劑通過摻入細(xì)胞膜脂質(zhì)與膜結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，破壞膜的基本功能[35]，導(dǎo)致細(xì)胞死亡并降低全細(xì)胞生物催化效率．據(jù)報(bào)道[36]大腸桿菌幾乎不耐受log,P值低于3.4的有機(jī)溶劑，例如，即使體積分?jǐn)?shù)低至 0.1%,，甲苯對大腸桿菌也有毒性[37]．因此，在含水/有機(jī)溶劑兩相體系中開發(fā)工業(yè)應(yīng)用的有機(jī)溶劑耐性(organic solvent tolerance，OST)微生物是至關(guān)重要的．

Matsui等[38]通過對有機(jī)溶劑耐受性的釀酒酵母進(jìn)行分析，在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的啟動子區(qū)中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 Pdrlp發(fā)生了突變；隨后通過對轉(zhuǎn)錄因子PDR1進(jìn)行單點(diǎn)突變，成功篩選出了具有有機(jī)溶劑耐受性的菌株．該菌株能夠在YPD培養(yǎng)基/異辛烷兩相系統(tǒng)中將 3-氧代丁酸丁酯還原成 3-羥基丁酸丁酯．大腸桿菌中涉及 OST的幾個(gè)基因(例如glpC、purR和manXYZ)與葡萄糖代謝有關(guān)，因此有學(xué)者對OST所必需的碳水化合物代謝的調(diào)控因子進(jìn)行了研究．在正己烷或正己烷與環(huán)己烷混合物的壓力下篩選大腸桿菌的 7個(gè)敲除突變體(acrA、acrB、cra、crp、cyaA、fnr和mlc)，發(fā)現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶(CyaA)和全局調(diào)控因子cAMP受體蛋白(CRP)的敲除使得突變體增強(qiáng)了OST，這兩種耐受性突變體顯示出細(xì)胞內(nèi)己烷濃度降低和對有機(jī)溶劑相的附著減少[39]．Basak等[40]通過全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CRP以提高大腸桿菌的OST，選擇甲苯作為有機(jī)溶劑壓力，通過易錯(cuò)PCR產(chǎn)生突變的crp基因，從隨機(jī)誘變文庫中富集篩選出了甲苯耐受突變體 M2，在 0.23%,甲苯中 M2的生長速率為 0.51,h-1，而野生型菌株的生長被完全抑制．與野生型相比，M2在其他有機(jī)溶劑如正己烷、環(huán)己烷和對二甲苯中也表現(xiàn)出優(yōu)異的生長性能．Zhang等[41]在環(huán)己烷的壓力下，篩選 rpoD突變文庫，旨在篩選出全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子σ70突變體有機(jī)溶劑耐受性提高的大腸桿菌，結(jié)果顯示含有σ70突變體 C9的大腸桿菌 JM109菌株具有耐受 69%,環(huán)己烷的能力，篩選出OST的大腸桿菌可以潛在地應(yīng)用于非水相生物催化和生物燃料的生產(chǎn)．用 2D-PAGE檢測攜帶 C9大腸桿菌 JM109菌株產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)差異，并且在不同的溶劑壓力下，204個(gè)高豐度蛋白質(zhì)顯示出超過兩倍的差異，其研究還表明了幾個(gè)基因(gapA、sdhB、pepB和dppA)在增強(qiáng)大腸桿菌 OST方面起著關(guān)鍵作用，主要涉及在溶劑脅迫下維持較高的細(xì)胞內(nèi)能量水平．以上研究說明全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程是用于增強(qiáng)OST表型工程菌株的有效方法之一．

3 提高耐酸性

某些生物催化過程在低 pH下，特別是在有機(jī)酸的生產(chǎn)過程中或利用木質(zhì)纖維素酸水解產(chǎn)物生產(chǎn)生物燃料過程中，細(xì)胞的活力會逐漸下降．因此，篩選低 pH或耐酸突變體在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的意義[42-45]．此前的研究[46-48]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌在酸壓力下應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子之一是受CRP調(diào)控的σ因子 RpoS．這些發(fā)現(xiàn)表明，對自身 CRP的修飾可能會改變大腸桿菌在低 pH下的耐受性．Basak等[49]試圖從轉(zhuǎn)錄水平改善菌株耐酸性，采用易錯(cuò) PCR方法突變大腸桿菌的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 CRP，根據(jù)其生長性能，從隨機(jī)誘變文庫中篩選出耐酸突變體 AcM1．在pH 4.2時(shí)，AcM1的生長速率(0.113,h-1)與對照菌株(0.062,h-1)相比有大幅度增加，并且該菌株在48,℃時(shí)也具有較好的耐熱性．實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果顯示，負(fù)責(zé)細(xì)胞耐酸性的關(guān)鍵酶——谷氨酸脫羧酶在AcM1突變體中的活性比親本菌株提高了 2倍，AcM1突變型CRP與Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型CRP依賴型啟動子的差異性結(jié)合表明，對自身 CRP的修飾可能導(dǎo)致全局轉(zhuǎn)錄水平的改變．

Klein-Marcuschamer等[22]應(yīng)用 gTME技術(shù)對植物乳桿菌的σ因子進(jìn)行改造，發(fā)現(xiàn)僅突變了σ因子中的1個(gè)氨基酸位點(diǎn)(Q345K)就明顯提高了植物乳桿菌對乳酸和高濃度鹽的耐性．張力[50]基于細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄水平，采用融合 PCR技術(shù)獲得 RNA聚合酶(RANP)的首要亞基σ因子的表達(dá)序列，并采用易錯(cuò)PCR技術(shù)引入突變，獲得轉(zhuǎn)錄突變庫，篩選獲得乳酸耐受性提高的優(yōu)勢菌株 LA5．由于氨基酸的替換及C末端27個(gè)氨基酸的缺失，導(dǎo)致了σ因子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，產(chǎn)生了一定的調(diào)控效果，提高了其在高酸環(huán)境下的生長速度．

Gao等[51]采用隨機(jī)插入缺失鏈交換誘變(RAISE)的三步法突變大腸桿菌全局調(diào)節(jié)因子Sigma D(RpoD)以改善其耐酸性．從隨機(jī)誘變文庫中篩選出了耐酸突變體Ⅶ，其在pH低至3.17時(shí)的生長速率(0.22,h-1)比親本菌株(0.15,h-1)高得多．為了更好地理解RpoD對調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的整體影響，對其進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，除了耐酸性外，大腸桿菌中有 95個(gè)基因(2.1%,)被誘導(dǎo)，178個(gè)(4.0%,)基因被抑制，包括對海藻糖生物合成、核苷酸生物合成、碳代謝以及氨基酸利用；還包括主要調(diào)控因子(ArcA、EvgA、HNS和 RpoS)和基因/操縱子特異性轉(zhuǎn)錄因子(GadX、GadW、AppY、YdeO 和 KdgR)．這些結(jié)果更好地說明了 RpoD在大腸桿菌的生長階段充當(dāng)了全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子．

Tanaka等[52]發(fā)現(xiàn) Haa1(釀酒酵母中參與適應(yīng)弱酸的轉(zhuǎn)錄激活因子)的過表達(dá)導(dǎo)致了乙酸耐受性的提高，Haa1的誘導(dǎo)削弱了參與乙酸進(jìn)入細(xì)胞的基因表達(dá)或者增加了乙酸輸出細(xì)胞的基因表達(dá)．Masuda等[53]通過響應(yīng)調(diào)節(jié)因子 EvgA的過表達(dá)可以在細(xì)胞生長指數(shù)階段賦予大腸桿菌耐酸性，在 LB培養(yǎng)基(pH 2.5)中處理 1,h后，EvgA高表達(dá)菌株的存活率比對照提高了 103～104倍，過表達(dá) EvgA 和敲除EvgA大腸桿菌的微陣列分析顯示，EvgA直接或間接調(diào)節(jié)至少 37個(gè)基因，其中包含結(jié)構(gòu)基因gadABC和hdeAB以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因ydeO、yhiE和gadX.ydeO的過表達(dá)增強(qiáng)了菌株的耐酸性，而ydeO的缺失能部分降低菌株的耐酸性．

4 提高氧化應(yīng)激耐受性

氧化應(yīng)激是由活性氧(ROS)和非自由基產(chǎn)生和清除之間不平衡引起的，如羥基自由基(·OH)、超氧陰離子(O2??)、過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧的氧化程度超過氧化物的清除[54]．ROS會對細(xì)胞成分(DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì))以及細(xì)胞氧化還原平衡造成嚴(yán)重?fù)p害[55]，因此篩選對 ROS具有較高耐受性表型的菌株對于工業(yè)規(guī)模的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)是非常重要的．Zhao等[56]利用全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制在兩個(gè)質(zhì)粒突變文庫(spt15和taf25分別編碼TBP 和Taf(Ⅱ)25)中成功地篩選出了兩株由 H2O2引起的氧化應(yīng)激耐性的酵母菌株．在溫和H2O2壓力下(≤3.5,mmol/L)，氧化耐受菌株的細(xì)胞生長性能與 H2O2濃度呈正相關(guān)．發(fā)酵結(jié)果表明突變株 taf25-3與對照菌株相比延滯期較短，taf25-3對 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激適應(yīng)能力提高，發(fā)酵效率提高．這表明一般轉(zhuǎn)錄因子(spt15和taf25)中的幾個(gè)氨基酸被取代可以修飾細(xì)胞氧化防御系統(tǒng)并提高釀酒酵母的抗氧化能力．CodYst是調(diào)節(jié)鏈球菌代謝網(wǎng)絡(luò)的全球轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，Lu等[57]構(gòu)建了codYst缺失的突變體，Wang等[58]比較了嗜熱鏈球菌ST2017及codYst缺陷型菌株中在不同H2O2應(yīng)激下的細(xì)胞存活率．結(jié)果顯示：在 2,mmol/L H2O2的溫和氧化脅迫下，野生型菌株和codYst缺陷型突變體的細(xì)胞存活率相似，并且與未處理的菌株相比僅減少了1個(gè)數(shù)量級．當(dāng)受到 10,mmol/L H2O2的強(qiáng)烈氧化應(yīng)激時(shí)，codYst缺陷型突變體的細(xì)胞存活率急劇下降，比野生型菌株低大約3個(gè)數(shù)量級，說明全局轉(zhuǎn)錄因子codYst在維持嗜熱鏈球菌ST2017的氧化應(yīng)激中具有重要的作用．Basak等[59]通過改造大腸桿菌中的全局調(diào)控因子CRP以改善大腸桿菌在氧化應(yīng)激條件下的耐受性，這些蛋白可以直接或間接調(diào)節(jié)氧化還原感應(yīng)調(diào)節(jié)因子 SoxR和 OxyR等，在 H2O2壓力下通過易錯(cuò)PCR篩選出了具有氧化應(yīng)激耐受性的最佳突變體OM3．該突變體菌株可在12,mmol/L H2O2中生長，生長速率為 0.6,h-1，而在此 H2O2濃度下野生型菌株的生長被完全抑制．OM3還具有異丙苯氫過氧化物耐受性和高溫耐受性．細(xì)胞內(nèi)的ROS決定細(xì)胞的活性，對活性氧測定發(fā)現(xiàn)不管是否在 H2O2的壓力下，OM3菌株中活性氧的濃度都低于野生菌株．Pan等[60]在大腸桿菌中過表達(dá)全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 IrrE提高了對滲透壓、熱和氧化應(yīng)激的耐受性．像IrrE這樣的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子經(jīng)常激活多種途徑，其中一些途徑可能不是針對靶向應(yīng)激耐受表型的特異性途徑．

5 提高耐糖性

肺炎克雷伯氏菌(K．pneumoniae)五碳糖利用性能優(yōu)良，在木糖生物轉(zhuǎn)化方面極具開發(fā)潛力，但其木糖耐受力較低，阻礙了其工業(yè)化應(yīng)用．本課題組[61]利用易錯(cuò) PCR的方法對產(chǎn) 2，3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌(KPG)全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子σ的編碼基因rpoD進(jìn)行突變，將突變產(chǎn)物連接 pDK7質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入親本菌株，構(gòu)建突變菌株文庫，從突變文庫中篩選出了具有木糖耐受性并高產(chǎn) 2，3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌株kpC．與親本菌株相比，木糖的消耗速率提高了169%，2，3-丁二醇的產(chǎn)量提高了216%,，且親本菌株在48,h之后基本不耗糖，說明對全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子σ的突變提高了肺炎克雷伯氏菌對木糖的耐受能力．

6 展 望

目前，gTME主要關(guān)注天然的σ70因子，只有鋅指蛋白已被用于設(shè)計(jì)人工調(diào)控因子，而大部分的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子尚未被開發(fā)研究．大腸桿菌本身的 7～14個(gè)全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中被大量研究的主要是σ70因子，到目前為止，只有 CRP能突變產(chǎn)生不同的表型. 生存在惡劣環(huán)境條件下，微生物的外源調(diào)節(jié)因子構(gòu)成了可能賦予重組宿主抗性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白庫，對于 IrrE這樣的外源全局調(diào)控因子來說，在不同的宿主或者相似的宿主中可能會成為新的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的演化原型．特別是在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和DNA與蛋白質(zhì)相互作用(PDI)分析的幫助下，深入剖析由全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程帶來的轉(zhuǎn)錄/翻譯譜的變化，會使人們認(rèn)識到識別和靶向直接負(fù)責(zé)脅迫耐受表型具體的基因和途徑，進(jìn)而應(yīng)用到提高菌株耐性的研究．總之，全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程方法應(yīng)該擴(kuò)展到更多天然的、外源的和人工調(diào)控的因子，并結(jié)合新的合成生物學(xué)的方法，使人們更深刻地了解如何人為調(diào)控工業(yè)微生物的基因組表達(dá)，在工業(yè)生產(chǎn)中使微生物在相關(guān)的壓力條件下具有更好的適應(yīng)性．

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