稻田土壤厭氧氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)對長期不同施肥的響應(yīng)*

聶三安 王 祎 王 飛 楊 靜 周碧青 邢世和?

（1 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

（2 福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，福州 350002）

（3 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福州 350003）

稻田是我國典型的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，與人類關(guān)系密切，受人為干擾較大。為了獲得高產(chǎn)，各種不同形式的氮肥長期大量投入，引起氨揮發(fā)和硝酸鹽淋溶、徑流及反硝化等氮損失過程［1］。長期以來，反硝化被認為是稻田土壤氮素損失的最主要生物學(xué)途徑，但隨著20世紀(jì)末厭氧氨氧化的發(fā)現(xiàn)改變了這一傳統(tǒng)觀點［2］，厭氧氨氧化導(dǎo)致土壤氮素的損失不可忽略［3-4］。厭氧氨氧化是在厭氧或微氧條件下，厭氧氨氧化菌以亞硝酸鹽為電子受體將氨氮氧化為氮氣和水的生物反應(yīng)過程，是生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，在濕地生態(tài)系統(tǒng)中廣泛發(fā)生。過去的研究大多集中在海洋［5-6］、湖泊［7-8］、河流岸邊帶［9］的厭氧氨氧化過程，針對稻田的研究主要針對單一肥料在短期內(nèi)對厭氧氨氧化過程的影響［10-11］，而關(guān)于長期不同施肥（化肥、有機肥、有機無機配施）對厭氧氨氧化過程的效應(yīng)研究十分有限。

厭氧氨氧化菌廣泛存在于農(nóng)業(yè)土壤中［11-12］。參與厭氧氨氧化反應(yīng)的微生物屬于細菌域浮霉菌門的Brocadiales（目名，中文譯名未定），目前已探知的厭氧氨氧化菌有5個屬：Candidatus Brocadia、Candidatus Kuenenia、Candidatus Anammoxoglobus、Candidatus Jettenia和Candidatus Scalindua，這5個屬均已在農(nóng)業(yè)土壤中發(fā)現(xiàn)［4,11,13］，但這些研究因大部分未進行高通量測序無法獲得具體的厭氧氨氧化菌相對豐度及多樣性數(shù)據(jù)。利用新一代高通量測序技術(shù)可以破譯微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)合土壤因子的變化，可以反映微生物對環(huán)境因子的響應(yīng)機制［14］。中國不同地區(qū)旱地農(nóng)田土壤的研究表明，厭氧氨氧化菌豐度為每克干土6.4×104～3.7×106個拷貝數(shù)，厭氧氨氧化菌的優(yōu)勢種群為Candidatus Brocadia，其多樣性和群落結(jié)構(gòu)與土壤有機質(zhì)和氨含量顯著相關(guān)［13］。中國東北典型白漿土水稻土的優(yōu)勢種群是Candidatus Scalindua，且4 a種植水稻的厭氧氨氧化菌多樣性高于1 a和9 a種植水稻土壤［12］。對中國南方典型水稻土的研究表明，厭氧氨氧化菌豐度為每克干土1.2×104～9.6×104個拷貝數(shù)，可檢測到Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia兩個屬，厭氧氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)受pH和氨濃度顯著影響［11］。已有的研究表明，厭氧氨氧化菌在不同稻田土壤中的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)不盡相同，不同肥料種類和種植方式的土壤中豐度和種群分布也具有一定差異。

因此，本研究選擇福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院33 a長期定位試驗田為研究對象，設(shè)置不施肥、單施化肥、無機肥配施牛糞、無機肥加秸稈還田四個處理，針對厭氧氨氧化的功能基因hzsA進行定量，并對厭氧氨氧化菌的16S rRNA基因在Illumina Miseq平臺進行高通量測序，研究長期不同施肥稻田厭氧氨氧化微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)特征。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本研究依托福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院位于福建省閩侯縣白沙鎮(zhèn)（119°04′10″E，26°13′31″N）的長期定位試驗田。供試土壤類型為黃泥田，成土母質(zhì)為低丘紅壤坡積物。定位試驗于1983年開始。試驗地1983—2004年采用雙季稻輪作，2005年開始采用單季稻種植。

設(shè)置（1）不施肥（CK）、（2）單施氮磷鉀化肥（NPK）、（3）氮磷鉀加牛糞（NPKM）、（4）氮磷鉀加秸稈還田（NPKS）四個處理，每個處理3次重復(fù)，小區(qū)面積12 m2（3 m×4 m），小區(qū)之間采用隨機區(qū)組排列，用水泥埂隔開。施肥量為：CK處理不施用任何肥料，其余處理無機肥施用量均為N 103.5 kg hm-2（尿素），P2O527.0 kg hm-2（過磷酸鈣）和K2O 135.0 kg hm-2（氯化鉀）。牛糞養(yǎng)分含量為有機質(zhì)394.2 g kg-1，N 15.8 g kg-1，P2O58.8 g kg-1和K2O 11.7 g kg-1，施用量（干基）為3 750 kg hm-2；秸稈養(yǎng)分含量為有機質(zhì)647.4 g kg-1，N 11.0 g kg-1，P2O53.8 g kg-1和K2O 20.4 g kg-1，施用量為上茬秸稈全部回田，多年平均還田量為4 500 kg hm-2。

1.2 土壤樣品采集與基本理化性質(zhì)分析

土壤樣品采集于2016年7月，為水稻種植之前。采樣方法：用土鉆在每個小區(qū)采用對角線多點采樣法采集耕層（0～20 cm）土壤樣品，混勻后采用四分法保留樣品。樣品分為兩部分，一部分立即液氮冷卻后帶回實驗室冷凍干燥，用于分子生物學(xué)分析；另一部分鮮樣帶回實驗室后，或直接用于銨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮（NO3--N）分析，或室內(nèi)自然風(fēng)干后過2 mm篩用于總有機碳、全氮、鹽度（電導(dǎo)率）和pH分析。

土壤樣品相關(guān)理化性質(zhì)分析參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》［15］中的分析方法。其中，銨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮（NO3--N）采用KCl（2 mol L-1）浸提，流動注射儀（FIA QC8500，Lachat，美國）分析測定?？傆袡C碳、全氮采用總有機碳分析儀（TOC-V CPH，SHIMADZU，日本）進行分析。土壤pH采用水土比為1︰2.5，pH計測定。鹽度測定采用中華人民共和國環(huán)境保護標(biāo)準(zhǔn)（HJ 802-2016）方法［16］測定。

1.3 DNA提取與實時熒光定量PCR

稱取約0.5 g冷凍干燥后的土壤，按照土壤DNA快速提取試劑盒的方法提取土壤總DNA。超微量紫外分光光度計（ND2000，Thermo，美國）檢測DNA純度。采用實時熒光定量PCR方法對土壤DNA中hzsA基因進行定量檢測。定量儀器為TIB-8600（泰普，中國），引物為hzsA_1594F和hzsA_1857R，反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 3 min，擴增95℃ 10 s，63℃ 10 s，72℃ 10 s（45個循環(huán)），最終溶解曲線為82℃ 10 s。每個獨立樣品3次重復(fù)，反應(yīng)體系20 μL，包括4 μL DNA模板，0.6 μL前引物和后引物，10 μL SYBR 2 Premix Ex Taq酶，1.0 μL牛血清白蛋白（20 mg mL-1），3.8 μL滅菌水。

1.4 高通量測序和序列分析

對于厭氧氨氧化菌16S rRNA基因，采用巢式PCR反應(yīng)。第一次反應(yīng)采用引物PLA46f-630r，反應(yīng)條件為：預(yù)變性96℃ 10 min，擴增96℃ 60 s，56℃ 1 min（35個循環(huán)），溶解曲線72℃ 1 min。然后取1 mL PCR產(chǎn)物稀釋500倍作為第二步擴增反應(yīng)的模板。第二次反應(yīng)的引物為Amx368f-Amx820r，反應(yīng)條件為：預(yù)變性96℃10 min，擴增96℃ 30 s，58℃ 1 min（25個循環(huán)），溶解曲線72℃ 1 min。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照Hefting等［17］的方法。擴增產(chǎn)物由2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，經(jīng)瓊脂糖凝膠純化試劑盒（Promega，Madison，WI）后用超微量紫外分光光度計ND 2000（Thermo，美國）測定濃度，通過Illumina Miseq平臺（派森諾生物科技有限公司，上海）進行測序。

序列分析步驟如下：①序列整理和過濾：為了整合原始雙端測序數(shù)據(jù)，首先采用滑動窗口法對FASTQ格式的雙端序列逐一作質(zhì)量篩查，要求堿基平均測序準(zhǔn)確率大于99%，且不允許存在模糊堿基。隨后，利用FLASH軟件對通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進行配對連接，要求兩條序列的重疊堿基長度大于10 bp，且不允許堿基錯配。最后，根據(jù)每個樣本所對應(yīng)的Barcode序列信息，將連接后的序列識別分配入對應(yīng)樣本，獲取有效序列。②操作分類單元（OTU）劃分和分類地位鑒定：使用QIIME軟件，調(diào)用序列比對工具UCLUST，對前述獲得的序列按97%的序列相似度進行歸并和OTU劃分，并選取每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。隨后，根據(jù)每個OTU在樣本中所包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件。在QIIME軟件中通過將OTU代表序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫的模板序列相比對，獲取每個OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2010，圖形處理采用SigmaPlot 12.5軟件，采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著性檢驗采用鄧肯（Duncan）法，不同字母表示在p＜0.05水平具有顯著性差異，相關(guān)性分析采用雙尾檢驗。高通量測序多樣性指數(shù)包括香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）、辛普森指數(shù)（Simpson index）、豐富度指數(shù)（Chao 1 index）等采用R 3.1.0軟件運行。

2 結(jié) 果

2.1 長期不同施肥對土壤理化性質(zhì)的影響

表1列出了長期不同施肥管理模式下稻田土壤基本理化性質(zhì)。由表1可知，由于長期施肥（33 a）改變了土壤養(yǎng)分，有機質(zhì)（OM）、全氮（TN）、銨態(tài)氮（NH4+-N）和鹽度（EC）均發(fā)生了顯著變化。與CK處理相比，NPKM和NPKS處理均顯著增加了土壤有機質(zhì)、全氮、氨態(tài)氮和鹽含量，但CK處理與NPK處理差異不明顯，說明有機無機配施更有利于土壤養(yǎng)分的提高。此外，NPKM處理的有機質(zhì)、全氮、銨態(tài)氮含量與NPKS處理無顯著差異。鹽度的方差分析表明，有機無機配施有利于土壤鹽的提高，且NPKS顯著高于NPKM。不同處理之間土壤pH無顯著差異。各處理硝態(tài)氮（NO3--N）含量均較低，且含量無顯著差異。

2.2 長期不同施肥土壤厭氧氨氧化菌功能基因

為研究不同施肥對厭氧氨氧化菌數(shù)量的影響，采用熒光定量PCR技術(shù)分析了厭氧氨氧化菌功能基因hzsA的拷貝數(shù)。結(jié)果表明，不同處理之間hzsA基因豐度存在顯著差異，且長期施肥處理基因豐度高于不施肥處理2個數(shù)量級（圖1）。總體而言，有機無機配施高于單施無機肥，單施無機肥高于不施肥。其中，NPKM處理hzsA豐度最高（每克干土（3.6±0.2）×106個），NPKS處理次之（每克干土（2.9±0.2）×106個），且顯著高于NPK處理（每克干土（1.3±0.2）×106個）和CK處理（每克干土（6.9±0.6）×104個）。因此，長期施肥顯

表1 不同處理下的土壤理化性質(zhì)Table 1 Effects of long-term different fertilization on soil physical-chemical properties relative to formula of the fertilization （n=3）

圖1 長期不同施肥土壤厭氧氨氧化菌hzsA基因豐度Fig. 1 hzsA gene abundance in paddy soils under long-term fertilization relative to formula of the fertilization （n=3）

著提高了厭氧氨氧化菌豐度，且有機無機配施效果更為明顯。

將厭氧氨氧化菌功能基因hzsA豐度與土壤理化性質(zhì)做相關(guān)性分析（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同施肥處理厭氧氨氧化菌豐度與土壤有機質(zhì)（r=0.999，p=0.001）和銨態(tài)氮（r=0.998，p=0.002）均呈極顯著正相關(guān)，與全氮呈顯著相關(guān)關(guān)系（r=0.988，p=0.012）。厭氧氨氧化菌功能基因的數(shù)量與土壤pH、鹽度和硝態(tài)氮含量無顯著相關(guān)關(guān)系。表明長期施肥土壤中，高土壤肥力（有機質(zhì)及全氮）和銨態(tài)氮利于厭氧氨氧化菌的生長。

2.3 厭氧氨氧化菌的群落組成與多樣性

圖2 長期不同施肥土壤厭氧氨氧化菌相對豐度Fig. 2 Relative abundance of anammox bacteria in paddy soils under long-term fertilization relative to formula of the fertilization

2.3.1厭氧氨氧化菌的群落組成 根據(jù)厭氧氨氧化菌16S rRNA基因高通量測序結(jié)果，對不同施肥稻田土壤厭氧氨氧化細菌的所有序列在97%的相似度下進行聚類，挑選出1 355條代表性序列，挑選出每個OTUs的代表序列加入DNA序列數(shù)據(jù)庫（Genebank）中與已探明的厭氧氨氧化菌序列做參比序列，總共獲得4類厭氧氨氧化菌：Candidatus Brocadia、Candidatus Anammoxoglobus、Candidatus Scalindua以及相當(dāng)一部分未分離或不可培養(yǎng)的厭氧氨氧化菌（Unidentified Planctomycetaceae）。然后對代表性序列對應(yīng)的OTUs中的樣品序列進行注釋，獲得每個樣品的厭氧氨氧化細菌群落組成的相對豐度（圖2）。結(jié)果顯示，長期不同施肥土壤厭氧氨氧化菌的優(yōu)勢種群為Candidatus Brocadia（74.70%～89.27%），且不同處理間無顯著差異。其次為不可培養(yǎng)的厭氧氨氧化菌Unidentified Planctomycetaceae，相對豐度為9.00%～19.53%，其中C K處理（1 5.0 0%±2.1 8%）、N P K M處理（1 2.1 0%±2.2 3%）和N P K S處理（19.53%±2.39%）之間無顯著差異，但顯著高于NPK處理（9.00%±2.40%）。另外兩種厭氧氨氧化菌Candidatus Anammoxoglobus和Candidatus Scalindua豐度較低（0.0 3%～5.5 3%）。其中CK處理Candidatus Anammoxoglobus相對豐度最高（5.5 3%±0.6 1%），N P K S處理次之（4.7 0%±0.6 1%），N P K M處理為3.6 7%±0.4 4%，顯著高于N P K處理（1.70%±0.17%）。不同土壤中，僅有少量Candidatus Scalindua（0.03%～1.07%）被鑒定出來，有機無機配施處理（NPKS和NPKM）相對豐度（1.00%～1.07%）顯著高于NPK處理和CK處理（0.03%～0.27%）。

表2 不同施肥土壤厭氧氨氧化功能基因（hzsA）與理化性質(zhì)的相關(guān)性Table 2 Pearson correlations between hzsA gene copies and soil physical-chemical properties under long-term fertilization relative to formula of the fertilization （n=4）

通過不同施肥處理厭氧氨氧化菌的群落組成與土壤基本理化因子的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（表3），所有樣品中，僅發(fā)現(xiàn)Candidatus Scalindua相對豐度與土壤有機質(zhì)（r=0.619，p=0.032）及氨態(tài)氮（r=0.607，p=0.036）呈正相關(guān)，其他種的相對豐度與所測土壤理化性質(zhì)均無顯著相關(guān)性。因此，在一定范圍內(nèi)高有機質(zhì)和氨氮有利于Candidatus Scalindua在土壤中的富集生長。土壤厭氧氨氧化菌的相對豐度可能受土壤綜合因素的影響。

表3 不同施肥土壤厭氧氨氧化菌群落組成與理化性質(zhì)的相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson correlations coefficient between community structure of anammox bacteria and soil physical-chemical properties under long-term fertilization relative to formula of the fertilization （n=12）

2.3.2 厭氧氨氧化菌的α多樣性 本研究從OTUs水平上通過分析香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）、辛普森指數(shù)（Simpson index）及豐富度指數(shù)（Chao1 index）考察不同施肥處理厭氧氨氧化菌的α多樣性。其中，香農(nóng)指數(shù)表示物種的豐富度和均勻度；辛普森指數(shù)表示一個群落或生境內(nèi)優(yōu)勢種的地位和作用，其值越高表明群落內(nèi)物種數(shù)量分布越不均勻，優(yōu)勢種群的地位越突出；豐富度指數(shù)表示一個群落或生境內(nèi)物種的復(fù)雜程度，值越高表明群落內(nèi)物種數(shù)目越多。通過R3.1.0軟件對樣品OTUs進行多樣性分析得出計算結(jié)果，見表4?？傮w而言，不同施肥處理的土壤樣品中，不施肥（CK處理）和氮磷鉀加秸稈還田（NPKS處理）厭氧氨氧化菌的群落多樣性明顯高于單施氮磷鉀肥（NPK處理）和氮磷鉀加牛糞（NPKM處理）。

表4 長期不同施肥土壤厭氧氨氧化菌的α多樣性指數(shù)Table 4 α-diversity index of anammox bacteria in paddy soils under long-term fertilization relative to formula of the fertilization（n=3）

比較不同施肥處理土壤厭氧氨氧化菌的α多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，CK處理和NPKS處理多樣性較高且差異不顯著，說明這兩個處理厭氧氨氧化菌多樣性較為接近。NPK處理和NPKM處理多樣性較低，除香農(nóng)指數(shù)無顯著差異外，NPKM處理的辛普森指數(shù)（0.74±0.05）和豐富度指數(shù)（88.75±3.25）顯著高于N P K處理（分別為0.5 9±0.0 6和62.69±13.45）。因此，單施化肥和化肥加牛糞均降低了厭氧氨氧化菌的多樣性，且在單施化肥處理中更為明顯。通過分析不同處理α多樣性指數(shù)與土壤理化因子之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者之間無顯著相關(guān)關(guān)系（數(shù)據(jù)未列出），說明厭氧氨氧化菌多樣性可能受土壤因子綜合因素的影響。

3 討 論

本研究應(yīng)用新一代高通量測序技術(shù)結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)，針對厭氧氨氧化菌的16S rRNA基因進行擴增測序，并對功能基因進行定量，研究了長期不同施肥對土壤厭氧氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性和數(shù)量的影響及其與土壤因子的關(guān)系。

3.1 長期不同施肥稻田土壤厭氧氨氧化菌群落組成差異的原因

已有研究表明Candidatus Brocadia是土壤中最主要的厭氧氨氧化菌［18-19］，本研究結(jié)果表明，長期不同施肥處理稻田土壤的優(yōu)勢種群也是Candidatus Brocadia。大量研究表明，這類厭氧氨氧化菌更適合在土壤系統(tǒng)中生長，原因可能是相比于其他厭氧氨氧化菌，Candidatus Brocadia本身的代謝途徑多樣［20］，可以利用更多的電子供體，如小分子有機酸、Fe2+、Mn2+等，還原亞硝酸鹽（NO2-）生成氮氣（N2）［21］。不同施肥處理可以檢測到少量的Candidatus Scalindua，且有機無機配施處理相對豐度顯著高于不施肥和單施化肥（圖2），這很可能與鹽度有關(guān)。在高鹽度區(qū)域如海洋中優(yōu)勢種群通常是Candidatus Scalindua［22］，對河口和河流沉積物的研究表明，Scalindua與鹽度高度相關(guān)，但Brocadia和Kuenenia在低鹽中豐度更高［23］，說明Scalindua對高鹽度具有更好的適應(yīng)性。對中國東北白漿土的厭氧氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)研究表明，Scalindua是白漿水稻土中的優(yōu)勢種群［12］，盡管原文未指出具體原因，推測很可能是白漿土的高鹽基飽和度造成的［24-25］。本研究中，長期有機無機配施后顯著提高了土壤鹽度（表1），利于Scalindua的生長。但由于其鹽度相對于海洋與河流沉積物等生態(tài)系統(tǒng)存在數(shù)量級上的差異，因此，在土壤中僅能檢測到少量的Scalindua。相關(guān)分析結(jié)果還表明，Scalindua豐度也與土壤有機質(zhì)和氨態(tài)氮含量具有一定的正相關(guān)關(guān)系，因此，土壤中Scalindua的生長不僅受鹽度調(diào)控，也可能與有機質(zhì)和氨態(tài)氮有關(guān)。不同施肥處理均可以檢測到一定數(shù)量的Anammoxoglobus屬（1.7%～5.5%），與中國32個不同旱地農(nóng)田土壤Anammoxoglobus平均豐度3%接近［13］，說明不同農(nóng)業(yè)土壤Anammoxoglobus屬的相對豐度較為接近。其他研究也在長期施肥土壤中鑒定出一定數(shù)量的Anammoxoglobus屬［4,26］，但不同處理之間的相對豐度差異原因仍有待深入研究。

3.2 長期不同施肥稻田土壤厭氧氨氧化菌多樣性差異的原因

研究表明，土壤中厭氧氨氧化菌的生物多樣性高于海洋［22］和淡水生態(tài)系統(tǒng)［27］，這可能與土壤中存在復(fù)雜的多種微生態(tài)有關(guān)。本研究表明，不同施肥處理對厭氧氨氧化菌的多樣性影響也不同。綜合而言，不施肥和無機肥加秸稈還田處理的厭氧氨氧化菌多樣性高于無機肥加牛糞處理，無機肥加牛糞處理又高于單施無機肥處理（表4）。一般認為，施肥處理會增加土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性［28-29］，然而本研究表明，施肥在一定程度上降低了厭氧氨氧化菌多樣性，且單施無機肥處理最為明顯。對不同施氮水平的研究［30］表明，稻田厭氧氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)對高氮水平具有較高的響應(yīng)，高氮處理的厭氧氨氧化菌群落多樣性顯著高于中、低氮和不施肥對照。但該研究僅對同一種施肥條件下進行，且因未進行測序分析無法得到具體的微生物群落信息［30］。最近，王鎣燕等［31］對石灰性紫色水稻土的研究結(jié)果表明，單施化肥和化肥配施豬廄肥均在一定程度上降低了厭氧氨氧化菌的多樣性，本研究結(jié)果與之類似。然而，無機肥加秸稈還田不僅未降低厭氧氨氧化菌多樣性，與不施肥處理相比，還有一定程度的提高（表4）。本研究認為這主要與施用有機肥料的組成成分、性質(zhì)及腐解速度有關(guān)［32］。牛糞中含有較多的易分解有機氮成分，C/N比較低（約20.2～42.4:1），分解速度較快；秸稈的C/N較高（約43.5～58.2:1）［33］，分解速率較慢。一方面，牛糞中較低的C/N可能會影響厭氧氨氧化菌的碳源代謝，使其養(yǎng)分和能源受限，如Li等［34］的研究表明，C/N比可能是影響厭氧氨氧化的重要因素；另一方面，過快的分解速度不能為厭氧氨氧化菌提供穩(wěn)定的外界環(huán)境，而厭氧氨氧化菌自身是一類生長緩慢的微生物，本研究不施肥處理厭氧氨氧化菌多樣性較高的結(jié)果也證實了該觀點。因此，厭氧氨氧化菌的多樣性對不同肥料種類的響應(yīng)不盡相同。

3.3 厭氧氨氧化菌豐度與土壤性質(zhì)的關(guān)系

長期定位施肥可以改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤肥力和作物產(chǎn)量，對土壤微生物生長的影響更加深刻［35］。厭氧氨氧化菌多樣性與肥料性質(zhì)有關(guān)，但其數(shù)量受土壤性質(zhì)影響較大。本研究結(jié)果表明，由于長期施肥顯著提高了土壤肥力（表1），厭氧氨氧化菌的數(shù)量也發(fā)生了顯著變化（圖1）。厭氧氨氧化菌數(shù)量與土壤有機質(zhì)、全氮和銨態(tài)氮含量顯著相關(guān)（表2）。銨態(tài)氮是厭氧氨氧化菌的底物來源，高銨態(tài)氮利于其生長，不同地區(qū)農(nóng)田土壤的研究也表明，厭氧氨氧化菌豐度與有機質(zhì)或銨態(tài)氮含量顯著正相關(guān)［13］。土壤有機質(zhì)和全氮也是微生物利用底物的重要來源，其含量往往對微生物的生長具有重要影響。本研究中，由于長期施肥，土壤肥力發(fā)生顯著變化，有機無機配施有機質(zhì)含量顯著高于單施化肥，因此更利于厭氧氨氧化菌的生長。此外，長期施肥可以改善土壤結(jié)構(gòu)和通氣性，促進大顆粒團聚體的形成［36］，這些環(huán)境也可能利于厭氧氨氧化菌在土壤中的富集。單施化肥也在一定程度上提高了土壤肥力，其厭氧氨氧化菌數(shù)量顯著高于不施肥處理（圖2）。

本研究從一定范圍內(nèi)揭示了厭氧氨氧化菌對長期施肥的響應(yīng)及與土壤理化因子的關(guān)系。由于土壤是復(fù)雜的多相系統(tǒng)，且受人為因素干擾較大，對厭氧氨氧化菌與土壤關(guān)鍵因子的生物調(diào)控機理及其他指標(biāo)（如容重、溶解氧、氧化還原電位、溫度、土壤團聚體、孔隙度等）與厭氧氨氧化菌的關(guān)系尚有待深入研究。此外，不同田間管理措施，如灌溉、輪作方式、耕作如何通過影響土壤進而對厭氧氨氧化過程進行調(diào)控也有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本文通過高通量測序和熒光定量PCR技術(shù)對不同施肥模式下厭氧氨氧化微生物的數(shù)量和群落多樣性進行分析，主要有以下結(jié)論：（1）長期不同施肥顯著改變了厭氧氨氧化菌的數(shù)量，厭氧氨氧化菌數(shù)量與有機質(zhì)、全氮和氨態(tài)氮呈顯著正相關(guān)關(guān)系；（2）長期施肥稻田土壤中主要的厭氧氨氧化菌為Candidatus Brocadia、Candidatus Anammoxoglobus和Candidatus Scalindua，其中優(yōu)勢種群為Candidatus Brocadia；（3）厭氧氨氧化菌多樣性與土壤基本理化性質(zhì)無顯著相關(guān)性，但很可能與肥料性質(zhì)有關(guān)，厭氧氨氧化菌對不同施肥的響應(yīng)不同。

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