禽腺病毒的分離鑒定及LMH細胞適應(yīng)毒的生物學(xué)特性研究

陳 玲，張 兵，宋亞芬，劉月煥，蔣桃珍*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081; 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京100097)

禽腺病毒屬(Aviadenovirus)原稱為I群禽腺病毒(Group I avian adenovirus)，主要宿主為雞、火雞和鵝。病毒分類學(xué)第九次報告[1]將禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)分為A、B、C、D、E 5個種，12個血清型，火雞腺病毒(TAdV)和鵝腺病毒(GOAdV)各劃分為一個種。以前的研究表明，腺病毒在雞體內(nèi)普遍存在，但常呈隱形感染，很少出現(xiàn)臨床癥狀，當(dāng)與其它致病病原混合感染時才導(dǎo)致一些臨床癥狀。最早報道的禽腺病毒感染是1949年發(fā)現(xiàn)的鵪鶉支氣管炎，1957年確認(rèn)的雞胚至死孤兒病毒[2]。但近年來，F(xiàn)AdV已成為雞的一種重要的致病病原之一，如FAdV-1(A)感染后，可以引起肌胃糜爛；FAdV-4(C)是心包積液綜合癥(hydropericardium syndrome, HS)的主要病原，該病于1987年首先在巴基斯坦卡拉奇附近的安卡拉村發(fā)現(xiàn)，因此也稱為“安卡拉”病[3-4]；D和E種的某些毒株可以造成嚴(yán)重的肝臟損傷，導(dǎo)致包涵體肝炎(inclusion body hepatitis, IBH)[4]。

自2013年起，國內(nèi)雞群出現(xiàn)由FAdV引起的心包積液、包涵體肝炎癥狀的病例開始增多，到2015年，國內(nèi)多個省份的許多養(yǎng)禽場流行FAdV感染，感染雞群出現(xiàn)以心包積液、肝臟腫大等病理變化為主的高死亡率的臨床疾病，給國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[5-6]。試驗通過對一株FAdV田間分離毒株的Hexon L1基因進行序列分析、在LMH細胞適應(yīng)后的生物學(xué)特性分析及不同代次毒液對SPF雞的致病性變化研究，為進一步開展FAdV流行毒株分子流行病調(diào)查研究及弱毒疫苗毒株的培育與篩選提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料、標(biāo)準(zhǔn)4型禽腺病毒、4型禽腺病毒陽性血清和LMH細胞 北京平谷養(yǎng)雞場疑似FAdV感染的雞肝組織，由北京市農(nóng)林科學(xué)院劉月煥研究員提供；標(biāo)準(zhǔn)4型禽腺病毒(AV211)、4型禽腺病毒陽性血清和LMH細胞由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備和保存。

1.2 SPF雞 3周齡SPF雞購自北京梅里亞維通實驗動物有限公司。

1.3 主要試劑 大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞、RNA提取試劑盒、DNA Marker為Takara產(chǎn)品； Reverse Transcription System為Invitrogen公司產(chǎn)品；pfu高保真聚合酶為Promega公司產(chǎn)品；pGEM-T載體購于Promega公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為Omega產(chǎn)品；DMEM/F12(1∶1), Foetal Bovine Serum為GIBCO產(chǎn)品。

1.4 病毒培養(yǎng)和傳代 將肝臟組織剪成小塊后置于研缽中，倒入適量液氮，充分研磨，按1∶5的體積比加入含雙抗(1000 U/mL)的PBS(1/15M pH7.2)，-80 ℃反復(fù)凍融三次，8000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，接種已長成單層的LMH細胞，37 ℃培養(yǎng)3 d，收獲后接種新的LMH細胞，并在LMH上連續(xù)傳至第15代(C1-C15)。

1.5 病毒鑒定

1.5.1 PCR鑒定 參照文獻[7]，用PCR方法擴增Hexon L1序列。

表1 Hexon L1引物Tab 1 Hexon L1 primers

參照Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0說明書，提取4型標(biāo)準(zhǔn)毒株和C3、C7、C11、C15代病毒基因組，以Hexon A/Hexon B為引物進行PCR擴增。反應(yīng)體系：2×Ex Taq Mix 25 μL，HexonA/HexonB(10 uM/L)各2 μL，模板5 uL。ddH2O 16 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增結(jié)果。

將PCR產(chǎn)物回收后，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化到JM109細胞，取100 μL涂布含有氨芐的LB瓊脂，37 ℃過夜培養(yǎng)。利用菌落PCR的方法鑒定重組子，挑選陽性克隆送往上海立菲生物技術(shù)有限公司測序。

1.5.2 中和試驗-特異性鑒定 用含DMEM/F12培養(yǎng)液將C5代毒稀釋至200TCID50/0.1mL，取1 mL與等量的4型禽腺病毒陽性血清混合，同時設(shè)病毒對照，37 ℃作用1 h，病毒中和組和對照組各接種5孔LMH細胞，每孔接種0.2 mL。同時設(shè)LMH細胞對照5孔，每孔加入0.2 mL含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。將48孔板置37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)5～7 d，觀察細胞病變。

1.6 病毒在LMH上的生長特性研究 測定C1-C15各代病毒的滴度，以傳代次數(shù)為橫坐標(biāo)，logTCID50/0.1mL為縱坐標(biāo)，繪制病毒在LMH上的生長曲線。

將C10稀釋10000倍，取1 mL接種已長滿單層的LMH細胞，37 ℃吸附1 h后，補充9 mL維持液。分別在接種培養(yǎng)的12、24、36、48、60、72、84、96、108和120 h取出細胞瓶，反復(fù)凍融三次，收獲病毒。取病毒懸液按Reed-Meunch方法計算不同收毒時間的TCID50，并繪制C10在LMH上的生長曲線。

1.7 致病性試驗 將30只3周齡SPF雞隨機分為3組，每組10只。第一組雞腿部肌肉接種 0.1 mLC5代毒，其病毒含量為106.5TCID50/0.1mL；第二組雞接種0.1 mL C15代毒，病毒含量為107.4TCID50/0.1mL；第三組為陰性對照，注射等量的生理鹽水。每天觀察和記錄試驗雞的發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 LMH細胞培養(yǎng)結(jié)果 肝臟組織病料在LMH上盲傳3代后，在LMH產(chǎn)生明顯的細胞病變，其特征為細胞變大變圓，聚集成不規(guī)則的葡萄串狀，聚團外的細胞間隙明顯增大，與4型腺病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株(AV211)出現(xiàn)同樣特征的細胞病變(圖1)。

A 正常的LMH細胞；B禽腺病毒標(biāo)準(zhǔn)毒 (AV211); C分離毒株.A normal LMH; B FAdV standard strain(AV211); C isolated strain圖1 標(biāo)準(zhǔn)毒株(AV211)和分離毒株在接種LMH細胞后48 h細胞病變情況(10X)Fig1 CPE on LMH caused by standard strain(AV211) and isolated strain 48 h post-inoculation(10X)

2.2 PCR鑒定 4型標(biāo)準(zhǔn)毒株和C3、C7、C11、C15代病毒均可以擴增出大小約為900 bp的Hexon L1片段(圖2)。與ATCC FAdV 12個血清型標(biāo)準(zhǔn)毒株的Hexon L1片段進行比對后，繪制核苷酸進化樹(圖3)?？梢钥闯龇蛛x毒株擴增出的保守序列大小與4型禽腺病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株完全一致，且與4型FAdV處于同一分支。

M: DL1000，分子量大小從上到下依次為1000、700、500、400、300、200 bp；1-6依次為4型標(biāo)準(zhǔn)毒株、C15、C11、C7、C3和陰性對照M:DL1000, Molecular weight from top to bottom are 1000,700,500,400,300,200 bp; 1-6:serotype 4 standard strain,C15,C11,C7,C3 and negative control圖2 標(biāo)準(zhǔn)毒株和各代次病毒Hexon L1片段電泳圖Fig 2 Hexon L1 electrophoresis chart of standard strain and different generations of isolated strain

圖3 各代次分離毒株與4型標(biāo)準(zhǔn)毒株、FAdV 12個血清型標(biāo)準(zhǔn)毒株的Hexon L1核甘酸序列進化樹Fig 3 Hexon L1 nucleic acid sequence evolution tree of different generations of isolated strain, serotype 4 standard strain and 12 serotype standard strains of FAdV

2.3 中和試驗結(jié)果 分離毒株與4型禽腺病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和后接種LMH細胞，不產(chǎn)生細胞病變，而病毒對照組都出現(xiàn)細胞病變，說明分離株能被4型禽腺病毒陽性血清完全中和。

表1 中和試驗結(jié)果Tab 1 The result of serum neutralization test

2.4 致病性試驗結(jié)果 C5和C15細胞毒接種SPF雞后，均在第2 d開始出現(xiàn)死亡，且雞只死亡時間集中在2～4 d。死亡雞剖檢，可見心包腔中有淡黃色清亮的積液；心包有斑點狀出血；肝臟腫大、出血(圖4)。C5和C15引起的死亡率分別為100%和70%，C15組未死亡雞精神沉郁、羽毛蓬松，10 d后恢復(fù)正常。說明分離毒株經(jīng)細胞適應(yīng)后，仍可導(dǎo)致3周齡SPF雞100%，且C5可導(dǎo)致SPF雞100%死亡。

表2 C5和C15毒液對SPF雞的致病性試驗結(jié)果Tab 2 The pathogenic result of C5 and C15 on SPF chickens

A心包腔有淡黃色清亮液體；B心包斑點狀出血；C肝臟脂肪黃染，腫大A amber colored liquid in the pericardial sac; B mottling hemorrhage on pericardium; C swelling liver with yellow color圖4 死亡雞心臟和肝臟大體病變Fig 4 Heart and liver lesion of dead chicken

2.5 病毒在LMH上的培養(yǎng)結(jié)果 隨著病毒在LMH上的傳代增加，其對細胞的適應(yīng)性逐漸增加，病毒滴度呈現(xiàn)上升趨勢，至第8代，病毒培養(yǎng)滴度趨于穩(wěn)定，8～15代培養(yǎng)物的病毒含量均在107.2～107.4TCID50/0.1mL，詳見圖5。

病毒在LMH上的滴度在感染后72 h達到峰值107.4TCID50/0.1mL，隨后略微下降，詳見圖6。

圖5 不同代次病毒在LMH上的增殖滴度Fig 5 The virus titer of different passages on LMH

圖6 不同培養(yǎng)時間病毒在LMH上的增殖滴度Fig 6 The virus titer on LMH at different point of time

3 討論與小結(jié)

雞感染禽腺病毒出現(xiàn)心包積液綜合癥的病例首次報道于1987年，該病發(fā)生在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)。上世紀(jì)90年代，在伊拉克、印度、墨西哥、厄瓜多爾、秘魯、智利、美國和俄羅斯等國家都相繼報道有該病的發(fā)生和流行[8]。牛登云等[9]在2014～2016年期間，對我國雞群中禽腺病毒感染情況進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)我國大部分地區(qū)雞群普遍存在禽腺病毒感染，且引起雞群的發(fā)病和死亡，發(fā)病和死亡雞的主要剖檢變化表現(xiàn)為包涵體肝炎和心包積液綜合征。從高發(fā)病地區(qū)的血清型調(diào)查結(jié)果來看，包涵體肝炎主要以FAdV8a/b(E)感染為主，而引起心包積液綜合癥的主要是FAdV-4型(C)。臨床上心包積液的病例大多數(shù)存在著與雞傳染性貧血病毒(CAV)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)等病原混合感染的情況[10]，這也是禽腺病毒感染后導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率的一個重要因素。但是，在研究的致病性試驗中，采用純凈的FAdV-4型分離株接種SPF雞，C5代毒仍能導(dǎo)致其100%發(fā)病和死亡，表明禽腺病毒田間分離株可以直接導(dǎo)致感染雞發(fā)病和死亡，其近期分離毒株的毒力已明顯高于早期分離毒株。

FAdV一般采用雞胚腎細胞(CEK)和雞胚肝細胞(CEL)兩種原代細胞進行分離和培養(yǎng)[11]，但原代細胞制備繁瑣、易污染，不利于實驗操作；LMH作為一種肝癌細胞系，可以無限傳代，用于FAdV培養(yǎng)時，可以產(chǎn)生明顯的細胞病變且病毒滴度高[12]。因此，研究直接采用LMH細胞對疑似禽腺病毒感染發(fā)病雞的臨床病料進行病毒分離培養(yǎng)，獲得了一株FAdV毒株。通過血清學(xué)試驗、基因序列分析等鑒定結(jié)果，表明分離到的病毒為4型禽腺病毒。此外，該4型禽腺病毒細胞適應(yīng)毒的培育，為進一步開展禽腺病毒的研究工作奠定了基礎(chǔ)。

細胞或組織連續(xù)傳代培養(yǎng)一直是傳統(tǒng)弱毒疫苗研發(fā)的主要技術(shù)之一。例如，雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗W93株就是由其親本強毒毒株在雞胚上連續(xù)傳代致弱獲得的[13]；日本乙型腦炎弱毒疫苗株SA 14-14-2是強毒株SA14在原代地鼠腎(PHK)細胞連續(xù)傳代的產(chǎn)物[14]；通過雞胚成纖維細胞(CEF)和BHK-21連續(xù)傳代的方式可以獲得鴨坦布蘇病毒的弱毒株[15]。試驗中將分離的FAdV在LMH上連續(xù)傳15代后，其C15代毒對SPF雞的毒力明顯低于C5。C5代毒以每只雞106.5TCID50接種后可導(dǎo)致接種雞100%死亡 而C15代毒以高于C5代毒約10倍劑量(107.4TCID50/每只)接種SPF雞后，引起的死亡率則為70%。該結(jié)果表明FAdV經(jīng)LMH細胞連續(xù)傳代后，可明顯降低病毒毒力。因此，可以推測，將分離到4型禽腺病毒在LMH細胞經(jīng)過連續(xù)傳代致弱，有可能獲得一株弱毒疫苗候選株，為今后進一步開展弱毒疫苗的研發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。

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