★ 張涵 索緒斌 張?jiān)屏? 姚琳 許慶瑞 張樹明 王偉明
(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院 哈爾濱 150036;2.廣東藥科大學(xué) 廣州 510006)
肺炎支原體(mycoplasma pneumonia, MP)是引發(fā)社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)的主要病原體之一,其引發(fā)的支氣管炎或者肺炎,不僅常見于嬰幼兒,也見于成人[1]。因其病程較長,且可引發(fā)哮喘及肺外癥狀,越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。其發(fā)病機(jī)制可能與細(xì)胞黏附、社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合癥毒素破壞及機(jī)體免疫異常有關(guān)[2-5]。NLRP3炎性體是一種細(xì)胞內(nèi)模式識別受體,研究表明,肺炎支原體可被NLRP3識別,觸發(fā)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng),與肺炎支原體肺炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6]。清熱止咳方(芩百清肺濃縮丸)是一種治療肺炎支原體感染的中藥復(fù)方,實(shí)驗(yàn)研究表明,其抗肺炎支原體肺炎與調(diào)節(jié)NLRP3炎性體有一定關(guān)系[7]。本文旨在探討其對MP感染模型小鼠肺組織NLRP3 炎性體mRNA表達(dá)及肺泡灌洗液中IL-18分泌動態(tài)變化的影響。
1.1 儀器與材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級BALB/c小鼠,6~8周,全部為雌性,購自中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心負(fù)壓SPF級動物房;動物合格證號為SCXK (粵) 2011-0029,許可證號為SYXK (粵) 2014-0136。
1.1.2 菌株 肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC-15531),為本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.1.3 藥物及試劑 清熱止咳方(每1g含生藥2.5g),黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所制備,制備方法同前[7];RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit及SYBR Premix Ex Taq 購自TaKaRa公司;NLRP3、ASC、Caspase-1引物由寶生物工程(大連)有限公司合成;IL-18 ELISA試劑盒購自ebioscience公司。
1.1.4 主要儀器 CFX96熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司;BSP-250生化培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;3k-20z型高效冷凍離心機(jī),1300 SERIES A2二級生物安全柜,美國 thermo公司;GEN ios pro酶聯(lián)免疫檢測儀,瑞士NAVO公司。
1.2 方法
1.2.1 肺炎支原體培養(yǎng) 將凍存的MP標(biāo)準(zhǔn)菌株用PPLO完全培養(yǎng)液復(fù)溶,將其置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液變橙黃色時傳代。把處于對數(shù)生長期的MP,行顏色改變單位(CCU)定量并分管凍存,用時調(diào)至所需濃度。
1.2.2 分組、接種MP及給藥 96只雌性BALB/c小鼠,隨機(jī)分為正常對照組、MP組、羅紅霉素組(50mg/Kg)、清熱止咳方組(3.3g/Kg),每組24只,各組小鼠分籠飼養(yǎng),其中正常對照組小鼠與其他組小鼠分房飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境和條件均一致。各組小鼠,均用乙醚麻醉,參照文獻(xiàn)方法[9],滴鼻法建立肺炎支原體感染小鼠模型。正常對照組小鼠同法用等容量的PPLO代替MP菌液滴鼻。滴鼻后第1d,羅紅霉素組及清熱止咳方組開始給藥,給藥容量為10 mL/Kg,連續(xù)給藥14d。模型組及正常對照組灌服相同容量蒸餾水。
1.2.3 標(biāo)本的采集及保存 分別于MP感染模型建立后第7d、14d及28d,每組隨機(jī)取出小鼠8只,頸椎脫臼法處死,并用75%乙醇消毒,在生物安全柜內(nèi)分離氣管,結(jié)扎右主支氣管,氣管插管,從氣管插管處慢慢注入0.5mL 4℃預(yù)冷的PBS溶液,30s 后緩慢的抽出,此步驟重復(fù)三次,合并BALF,4℃ 3000rpm離心10min,分離上清,于-80℃保存,備做ELISA;分離左肺,-80℃凍存,備提RNA。
1.2.4 NLRP3、ASC、caspase-1mRNA相對表達(dá)量檢測 常規(guī)方法提取各組小鼠左肺的RNA,并測定濃度。參照試劑說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增,NLRP3、ASC、caspase-1mRNA引物序列及擴(kuò)增條件參見文獻(xiàn)[7]。用2-ΔΔCt法分析PCR產(chǎn)物的相對定量。
1.2.5 IL-18檢測 用ELISA方法測定,操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。
2.1 清肺止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1mRNA相對表達(dá)量的動態(tài)變化 與正常對照組比較,感染后7d、14d模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.01);感染后28d模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達(dá)量無明顯變化,與正常對照組比較,沒有顯著性差異(P>0.05);清熱止咳方組給藥后7d、14d NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達(dá)量均下降,與模型組比較,差異有顯著性(P<0.05)。給藥后28d清熱止咳方組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA相對表達(dá)量無明顯變化,與模型組比較,無顯著性差異(P>0.05)。見表1-3。
表1 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織NLRP3 mRNA表達(dá)的影響
注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05。
表2 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織ASC mRNA表達(dá)的影響
注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05。
表3 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織caspase-1 mRNA表達(dá)的影響
注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05。
2.2 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠BALF IL-18的影響 MP感染后7d、14d,模型組小鼠BALF中IL-18分泌量增加,與正常對照組比較,差異有顯著性(P<0.01);感染后28d模型組小鼠BALF中IL-18分泌量稍有增加,但與正常組比較,無見顯著性差異(P>0.05)。給予清肺止咳方 7d、14d,小鼠BALF中IL-18分泌量減少,與模型組比較,差異有顯著性 (P<0.05,P<0.01)。清熱止咳方給藥14d,再停止給藥14d,與模型組比較,無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表4。
表4 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠BALF IL-18分泌的影響
注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。
NOD樣受體蛋白3即NLRP3炎性體是由NLRP3、ASC、Caspase-1組成的一種多蛋白復(fù)合物,屬于胞內(nèi)識別受體,它在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá),在多種感染性及非感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程發(fā)揮作用[8-9]。
研究表明,細(xì)胞感染肺炎支原體后,活性氧以及肺炎支原體特有的社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素均可被NLRP3炎性體識別,并激活NLRP3,通過與銜接蛋白ASC作用,活化caspase-1,進(jìn)而裂解無活性的pro-IL-1β,將其剪切為成熟的IL-1β,并介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng),在肺炎支原體肺炎的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[6,10]。
本研究通過MP滴鼻法建立BALB/c小鼠感染模型,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步動態(tài)觀察了NLRP3炎性體相關(guān)基因及IL-18在MP感染小鼠肺組織或BALF的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),小鼠接種MP 7d,NLRP3炎性體相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),BALF中IL-18分泌明顯增加;感染14d NLRP3炎性體相關(guān)基因表達(dá)及BALF中IL-18分泌雖較7d下降,但還高于正常對照組,即炎癥有所減退;感染28d,NLRP3炎性體相關(guān)基因表達(dá)及BALF中IL-18分泌無明顯變化,即炎癥基本消失。其中,NLRP3炎性體相關(guān)基因表達(dá)的變化趨勢與其相關(guān)蛋白表達(dá)的變化趨勢基本一致[7]。前期體外試驗(yàn)結(jié)果顯示,MP感染RAW264.7細(xì)胞后,細(xì)胞上清液IL-18的分泌量未有明顯變化,但本文整體動物試驗(yàn)結(jié)果表明,IL-18在肺炎支原體感染初期和中期分泌增加,感染后期分泌趨于正常,可能是由于體外試驗(yàn)中選取的時間點(diǎn)不同,抑或由于體外試驗(yàn)脫離了體內(nèi)試驗(yàn)的內(nèi)環(huán)境,故兩者結(jié)果不甚一致,具體原因有待于進(jìn)一步研究[11]。
清熱止咳方是治療肺炎支原體感染的中藥復(fù)方,方中以黃芩為君藥,以其苦寒之性,清泄肺火;百部為臣藥,甘、苦、微溫,可潤肺止咳;地龍性寒、味咸,可清熱、止喘;桔梗味苦、辛、性平,可宣肺、利咽、祛痰、排膿,并輔以麥冬、紫菀,全方共奏清熱解毒、潤肺止咳的功效。前期體外實(shí)驗(yàn)研究表明,清熱止咳方含藥血清能降低MP感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞NLRP3炎性體相關(guān)基因的相對表達(dá)量并減少肺泡灌洗液IL-1β的分泌,本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn),從NLRP3炎性體相關(guān)基因表達(dá)變化的角度探討其治療肺炎支原體感染的作用機(jī)制。結(jié)果表明,給予中藥復(fù)方清熱止咳方7d、14d后能下調(diào)MP模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達(dá)及BALF中IL-18的分泌。即清熱止咳方可能通過抑制NLRP3炎性體相關(guān)基因表達(dá)而抑制相關(guān)炎性細(xì)胞因子IL-18的分泌來發(fā)揮對肺炎支原體感染的治療作用。
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