羅氏海盤車性腺脂質(zhì)的微波提取及其成分分析

樓喬明，徐 華，王云鵬，張進(jìn)杰，楊文鴿，徐大倫

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

0 引 言

海星（stelleroids，starfishes），又名海盤車，為棘皮動(dòng)物門（Echinodermata）海星綱（Asteroidea）動(dòng)物，是海洋常見大型無脊椎動(dòng)物之一。目前全世界約有海星1 800種，中國沿海約有100多種，年捕撈量達(dá)數(shù)十萬t[1]。海星性腺，又稱海星黃，是海星重要的可食用部位，其富含大量活性成分，如皂苷、生物堿、多糖、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等，具有抗癌、抗病毒、降血壓和降血脂等多種生理和藥理活性[2]。羅氏海盤車（Asterias rollestoni）廣泛分布于中國黃海、東海海域以及俄羅斯遠(yuǎn)東和日本沿海，是重要的海洋藥物和功能食品原料，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和開發(fā)潛力[3-4]。目前，國內(nèi)外關(guān)于羅氏海盤車的研究主要集中在皂苷、多糖、生物堿等方面[5-7]，而對(duì)其性腺的脂質(zhì)提取、脂質(zhì)成分分析及營養(yǎng)評(píng)價(jià)等方面均鮮有研究報(bào)道。

微波輔助提取技術(shù)是在傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型萃取技術(shù)，其通過微波加熱作用，加速被萃取成分向萃取溶劑界面擴(kuò)散，具有萃取時(shí)間短、效率高、能耗低和適于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[8]。近年來，微波輔助提取技術(shù)受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注，并已日益應(yīng)用于油脂提取[9-11]。因此，本研究以羅氏海盤車為原料，采用微波輔助提取技術(shù)對(duì)其性腺脂質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用核磁共振和氣相色譜-質(zhì)譜分別對(duì)其脂質(zhì)成分和脂肪酸組成進(jìn)行分析，以期為羅氏海盤車性腺脂質(zhì)的微波提取和成分分析以及海星資源的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅氏海盤車購于煙臺(tái)九田海鮮批發(fā)城，個(gè)體質(zhì)量（75.66±15.04）g，性腺指數(shù)（28.71±4.29）%。取羅氏海盤車性腺，經(jīng)冷凍干燥、粉碎和40目過篩，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。

氘代氯仿（CDCl3，氘代度99.8%+0.03%四甲基硅烷）購于阿拉丁試劑（上海）有限公司；37種脂肪酸甲酯混標(biāo)、魚油脂肪酸甲酯混標(biāo)購于美國Sigma公司；正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、石油醚等分析純購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MARS 6型微波消解系統(tǒng)，美國CEM公司；RV-10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司；AVANCE Ⅲ 400 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀，瑞士Bruker公司；7890A型氣相色譜儀，美國Agilent公司；M7-80EI型質(zhì)譜儀，北京普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脂質(zhì)提取工藝流程

取2 g羅氏海盤車性腺粉末置于萃取管中，加入提取溶劑，并在適當(dāng)條件下進(jìn)行提取；提取結(jié)束后將提取液過濾，濾液在37 ℃條件下，經(jīng)40 kPa減壓濃縮10 min，并于105 ℃干燥至恒質(zhì)量，并按公式（1）計(jì)算脂質(zhì)提取率。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

在微波功率800 W、液料比5 mL/g、提取時(shí)間10 min和提取溫度60 ℃的常規(guī)參數(shù)條件下，測(cè)定不同提取溶劑（正己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、石油醚）對(duì)羅氏海盤車性腺脂質(zhì)提取率的影響。采用最佳提取溶劑，以液料比（3、4、5、6、7 mL/g）、提取時(shí)間（6、8、10、12、14 min）和提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）3個(gè)單因素變量替換工藝流程中相應(yīng)的常規(guī)參數(shù)，測(cè)定上述 3個(gè)因素對(duì)羅氏海盤車性腺脂質(zhì)提取率的影響。

1.3.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以脂質(zhì)提取率為指標(biāo)，采用極差法對(duì)液料比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，正交因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.4 核磁共振分析

取50 mg羅氏海盤車性腺脂質(zhì)，加入0.6 mL氘代氯仿溶解，轉(zhuǎn)移至核磁管中用于核磁共振分析。氫譜參數(shù)：脈沖序列zg30，檢測(cè)溫度為296.4 K，90°脈沖寬度P1為10.00 μs，譜寬為8 012.82 Hz，脈沖延遲時(shí)間D1為1 s，采樣點(diǎn)數(shù)為65 536，掃描次數(shù)為8，空掃次數(shù)為2；碳譜參數(shù)：脈沖序列zgpg30，檢測(cè)溫度297.1 K，90°脈沖寬度P1為9.50 μs，譜寬為24 038.46 Hz，脈沖延遲時(shí)間D1為2 s，采樣點(diǎn)數(shù)為65 536，掃描次數(shù)為1 024，空掃次數(shù)為 4。氫譜和碳譜的化學(xué)位移均以四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS）為標(biāo)準(zhǔn)校正。使用MestReNova軟件對(duì)圖譜進(jìn)行處理和分析。

1.3.5 脂肪酸分析

甲酯化衍生法[12]：取10 mg羅氏海盤車性腺脂質(zhì)，加入1 mL 10%濃硫酸-甲醇溶液，于60℃水浴中甲酯化30 min，冷卻后加入1 mL正己烷振蕩，靜置分層取上清液進(jìn)行GC-MS分析。

色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm ×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持10 min，整個(gè)分析過程37 min；進(jìn)樣量1.0 μL，分流比50∶1；以氦氣為載氣，載氣流量1 mL/min。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度 250℃，EI（electron impact）離子源，離子源溫度200℃，電離能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍：m/z 50～650 u。

1.3.6 脂肪酸營養(yǎng)評(píng)價(jià)

參考朱成科等[13]計(jì)算羅氏海盤車性腺的脂肪酸致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（atherogenic index，AI）和血栓形成指數(shù)（thrombogenic index，TI），以評(píng)估羅氏海盤車性腺脂肪酸對(duì)人類心血管疾病發(fā)生的影響，AI及 TI計(jì)算見式（2）～（3）。

式中MUFA（monounsaturated fatty acids）為單不飽和脂肪酸，PUFAn-6（n-6 polyunsaturated fatty acids）為n-6型多不飽和脂肪酸，PUFAn-3（n-3 polyunsaturated fatty acids）為n-3型多不飽和脂肪酸，C12:0、C14:0 、C16:0、C18:0分別為不同種類的脂肪酸。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)平行測(cè)定 3次，采用單因素方差分析法（ANOVE，Tukey檢驗(yàn)）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并通過Duncan’s法進(jìn)行單因素多重比較分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

將提取溶劑、液料比、提取時(shí)間和提取溫度設(shè)為試驗(yàn)因素，測(cè)定上述 4種因素的不同水平對(duì)羅氏海盤車性腺脂質(zhì)提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

由圖 1a可知，3種溶劑對(duì)提取率無顯著差異（P＞0.05）；而正己烷和石油醚的提取率顯著低于乙酸乙酯、丙酮和乙醇（P＜0.05），這是由溶劑的介電常數(shù)和脂質(zhì)在溶劑中的溶解性所共同決定。5種溶劑對(duì)脂質(zhì)均具有較好的溶解性，但石油醚和正己烷的介電常數(shù)較低，對(duì)微波輻射能的吸收較弱，致使 2種溶劑的提取效果不佳[14]。孫協(xié)軍等[15]采用微波輔助提取技術(shù)對(duì)鹽藻油進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯的提取率最高，丙酮次之，而石油醚最低，這與本研究的結(jié)果一致。因此，選取乙酸乙酯作為提取溶劑，用于后續(xù)單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1b可知，當(dāng)液料比為3～6 mL/g時(shí)，脂質(zhì)提取率隨液料比的增大而顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)液料比為6 mL/g時(shí)，脂質(zhì)提取率達(dá)到最大值（31.84%）；繼續(xù)增加液料比對(duì)脂質(zhì)提取率無顯著影響（P＞0.05）。這是因?yàn)橐毫媳鹊脑黾邮乖吓c提取溶劑之間的接觸面積和脂質(zhì)濃度差增大，進(jìn)而提高傳質(zhì)速率和脂質(zhì)提取率；但當(dāng)液料比太大時(shí)，部分微波被提取溶劑吸收，而使原料內(nèi)部的微波作用減少，細(xì)胞破碎能力減弱，致使脂質(zhì)提取率降低[16]。

圖1 不同因素對(duì)羅氏海盤車性腺脂質(zhì)提取率的影響Fig. 1 Effects of different factors on extraction rates of Asterias rollestoni gonad lipids

由圖1c可知，當(dāng)提取時(shí)間為6～10 min時(shí)，脂質(zhì)提取率隨提取時(shí)間的增加而顯著增大（P＜0.05）；當(dāng)提取時(shí)間為12 min時(shí)，脂質(zhì)提取率達(dá)到最大值；之后，隨著提取時(shí)間的繼續(xù)增加，提取率顯著降低（P＜0.05），這是由于提取時(shí)間增加導(dǎo)致原料中部分低沸點(diǎn)成分的揮發(fā)所致[17]。

由圖1d可知，當(dāng)提取溫度低于60 ℃時(shí)，脂質(zhì)提取率隨提取溫度的升高而顯著增大（P＜0.05）；當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，脂質(zhì)提取率達(dá)到最大值（31.26%）；之后，繼續(xù)升高提取溫度，脂質(zhì)提取率顯著降低（P＜0.05），這是因?yàn)楦邷貙?dǎo)致溶劑和部分揮發(fā)性油脂損失，從而導(dǎo)致脂質(zhì)提取率降低[18]。

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙酸乙酯為提取溶劑，選取液料比（A）、提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）為試驗(yàn)因素，脂質(zhì)提取率為試驗(yàn)指標(biāo)，按表 1中的正交試驗(yàn)方法考察各因素對(duì)羅氏海盤車性腺脂質(zhì)提取率的影響，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果列于表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Designs and results of orthogonal test

由表 2可知，在微波輔助提取羅氏海盤車性腺脂質(zhì)的過程中，不同因素對(duì)羅氏海盤車性腺脂質(zhì)提取率的影響大小依次為：液料比＞提取溫度＞提取時(shí)間，即液料比對(duì)脂質(zhì)提取率的影響最大，提取溫度次之，提取時(shí)間最小；上述3因素的最優(yōu)組合為：A3B2C2，即液料比7 mL/g、提取時(shí)間12 min、提取溫度60 ℃，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，羅氏海盤車性腺脂質(zhì)提取率為33.82%。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，微波提取法的提取率略低于Folch法（35.39%）。Folch法作為脂質(zhì)提取的經(jīng)典方法，其所用提取溶劑（三氯甲烷-甲醇）對(duì)脂質(zhì)具有較好的溶解性，且提取時(shí)間較長，故脂質(zhì)提取完全[19]；而微波提取法溶劑用量少、毒性低、提取時(shí)間短，更適合脂質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)[8]，因此微波提取法是羅氏海盤車性腺脂質(zhì)提取的有效方法。

2.3 核磁共振分析

2.3.1 氫譜（1H-NMR）分析

根據(jù)1H-NMR譜中化學(xué)位移和信號(hào)模式，并參考Ruiz-Aracama等[20-22]對(duì)信號(hào)峰進(jìn)行歸屬，結(jié)果列于表3?；瘜W(xué)位移5.41～5.34 ppm譜峰歸屬為所有不飽和脂肪酸碳碳雙鍵上的氫；5.29～5.26 ppm譜峰為甘油醇次甲基上的氫；4.33～4.29和4.17～4.13 ppm譜峰為甘油醇亞甲基上的氫；3.31 ppm為磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）中與氮原子相連的甲基（(CH3)3N-）上的氫；2.85～2.82 ppm譜峰為多不飽和脂肪酸中2個(gè)碳碳雙鍵之間的亞甲基上的氫；1.00～0.96 ppm為n-3型多不飽和脂肪酸末端-CH3上的氫，0.90～0.86 ppm譜峰為除n-3型多不飽和脂肪酸之外的其他脂肪酸末端-CH3上的氫；0.94和0.55 ppm譜峰歸屬為膽固醇中C17位（-CH）和C18位（-CH3）上的氫。

在1H-NMR中，譜峰面積與物質(zhì)的摩爾濃度成正比[23-24]，因此通過2.12～2.00 ppm譜峰可得不飽和脂肪酸與總脂肪酸的摩爾比為0.70，通過1.73～1.69 ppm譜峰可得 C20:5n-3（eicosapentaenoic acid，EPA）和 C20:4n-6（arachidonic acid，ARA）總量與總脂肪酸的摩爾比為0.17，通過1.00～0.96 ppm譜峰可得n-3型多不飽和脂肪酸與總脂肪酸的摩爾比為0.21，此外通過0.55 ppm譜峰可得膽固醇與總脂肪酸的摩爾比為0.02。

表3 羅氏海盤車性腺脂質(zhì)的1H-NMR譜峰歸屬Table 3 Peak assignments of 1H-NMR spectrum of Asterias rollestoni gonad lipids

2.3.2 碳譜（13C-NMR）分析

根據(jù)13C-NMR譜中化學(xué)位移和信號(hào)模式，并參考Pollesello等[25-27]對(duì)信號(hào)峰進(jìn)行歸屬，結(jié)果列于表4。

表中可知，在羰基譜區(qū)（177～172 ppm），176.69 ppm歸屬為游離脂肪酸羰基碳原子，173.36～172.56 ppm為磷脂和甘油三酯中的羰基碳原子；在烯烴譜區(qū)（140～127 ppm），130.23～129.32、128.96～127.62 ppm 分別歸屬為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸烯烴碳原子；在甘油譜區(qū)（75～50 ppm），69.00～68.88、62.07 ppm分別歸屬為甘油三酯中甘油骨架上 sn-2和sn1,3位碳原子，70.06、62.76 ppm分別歸屬為磷脂中甘油骨架上sn-2和sn-1位碳原子，54.45 ppm歸屬為磷脂酰膽堿（PC）中與氮原子相連的甲基碳原子（(C H3)3N-）。膽固醇 C3、C17、C9特征峰信號(hào)分別出現(xiàn)在71.73、56.17和49.47 ppm。亞甲基譜區(qū)（40～20 ppm）包含脂質(zhì)中脂肪酸鏈長等信息，20.56 ppm歸屬為n-3型多不飽和脂肪酸中與端甲基相連的亞甲基碳原子；在甲基譜區(qū)（15～11 ppm），14.27～14.00 ppm歸屬為所有脂肪酸端甲基碳原子，膽固醇C18（-C H3）特征峰信號(hào)位于11.83 ppm處。

表4 羅氏海盤車性腺脂質(zhì)的13C-NMR譜峰歸屬Table 4 Peak assignments of 13C-NMR spectrum of Asterias rollestoni gonad lipids

通過13C-NMR的譜峰面積對(duì)羅氏海盤車性腺脂質(zhì)進(jìn)行定量分析可知：甘油三酯與磷脂的摩爾比為 6.53，游離脂肪酸和膽固醇與總脂肪酸的摩爾比為分別為0.01和0.02，表明羅氏海盤車性腺脂質(zhì)的主要成分為甘油三酯和磷脂，膽固醇和游離脂肪酸含量較低。

2.4 脂肪酸分析

羅氏海盤車性腺脂質(zhì)經(jīng)甲酯化衍生和氣相色譜-質(zhì)譜分析，其總離子流色譜分析結(jié)果列于表5。從羅氏海盤車性腺脂質(zhì)中共檢測(cè)出28種脂肪酸，由C12-C22脂肪酸組成，以 C14:0、C16:0、C18:1n-7、C20:1n-11、C20:5n-3（EPA）和 C22:6n-3（DHA）為主；其中單不飽和脂肪酸占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的38.77%，高于飽和脂肪酸（34.64%）和多不飽和脂肪酸（26.59%）。羅氏海盤車性腺飽和脂肪酸以C14:0（10.45%）、C16:0（10.69%）、C18:0（7.38%）和 C20:0（5.08%）為主，并含有少量的奇數(shù)碳飽和脂肪酸（C15:0和C17:0）和多支鏈飽和脂肪酸（4,8,12-TMTA）。單不飽和脂肪酸以 C18:1n-7（14.47%）和 C20:1n-11（15.23%）為主，其中，C20:1n-11為海洋動(dòng)物來源單不飽和脂肪酸的重要組成特征[28]。多不飽和脂肪酸以C20:5n-3（16.81%）和C22:6n-3（4.75%）為主，二者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá) 21.56%，遠(yuǎn)高于海膽（9.73%）[29]和海參（19.97%）[30]等棘皮動(dòng)物。同時(shí)，羅氏海盤車性腺中n-3 PUFA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)23.62%，而n-6 PUFA僅為2.71%，致使兩者比值為8.72，遠(yuǎn)高于國際糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的n-3/n-6日常膳食比值（0.1～0.2）[31]，可作為C20:5n-3和C22:6n-3等n-3型多不飽和脂肪酸的重要膳食來源。此外，羅氏海盤車性腺的脂肪酸致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（AI）和血栓形成指數(shù)（TI）分別為0.81和0.29，遠(yuǎn)低于羊肉（AI為1.00，TI為1.58），表明羅氏海盤車性腺脂肪酸具有較高的不飽和度，能有效調(diào)節(jié)血脂，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成[11]。

表5 羅氏海盤車性腺脂質(zhì)的脂肪酸組成Table 5 Fatty acid composition of Asterias rollestoni gonad lipids

3 結(jié) 論

1）采用微波輔助提取技術(shù)對(duì)羅氏海盤車性腺脂質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)得到最佳提取工藝條件：以乙酸乙酯為提取溶劑、液料比7 mL/g、提取時(shí)間12 min、提取溫度60℃，在此優(yōu)化條件下，羅氏海盤車性腺的脂質(zhì)提取率為33.82%。

2）羅氏海盤車性腺脂質(zhì)成分主要為甘油三酯和磷脂，膽固醇和游離脂肪酸含量較低；而脂肪酸以C14:0、C16:0、C18:1n-7、C20:1n-11、C20:5n-3和C22:6n-3為主，其中C20:5n-3和C22:6n-3含量高達(dá)21.56%，且脂肪酸致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)和血栓形成指數(shù)分別為0.81和0.29，表明羅氏海盤車性腺脂質(zhì)能有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成，具有很高營養(yǎng)價(jià)值和脂質(zhì)開發(fā)潛力，可作為C20:5n-3和C22:6n-3等功能性脂肪酸的重要膳食來源。

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