陳年茯磚茶多酚類(lèi)對(duì)老年人腸道菌群的影響研究

吳根梁，侯?lèi)?ài)香，李珂，李宗軍

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

茯磚茶具有調(diào)節(jié)腸道功能、促進(jìn)消化、護(hù)肝、降三高及延緩衰老等多種功效[1-3]，在一定年份內(nèi)合理存放，其藥理價(jià)值及保健功能會(huì)不斷提升。研究表明，茶多酚是茯磚茶中含量較高的功能性物質(zhì)之一，其成分在儲(chǔ)藏過(guò)程中會(huì)不斷氧化，這其中涉及到多種空間結(jié)構(gòu)及官能團(tuán)的改變，并最終形成種類(lèi)繁雜的多酚成分[4-6]。有報(bào)道指出，經(jīng)過(guò)10年的陳放，茯磚茶中主要兒茶素總量仍能占茶多酚總量的 20%~40%[7]。盡管人們熟知茶多酚對(duì)人體具有多方面的益處，但實(shí)際研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚的生物利用率非常低，茶多酚進(jìn)入小腸被人體直接吸收利用的只有一小部分，大概 90%以上需經(jīng)過(guò)腸道菌群分解代謝為小分子化合物來(lái)提高生物利用率，進(jìn)而能更好地被人體吸收利用[8-9]。

近年來(lái)，學(xué)者們基于腸道菌群與膳食營(yíng)養(yǎng)素互作的研究，將微生物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)及食品科學(xué)有機(jī)結(jié)合來(lái)闡明膳食影響人體健康的機(jī)理[10-12]。研究表明，腸道菌群與膳食營(yíng)養(yǎng)素的相互作用是膳食營(yíng)養(yǎng)素發(fā)揮其生物調(diào)節(jié)作用的重要途徑，腸道菌群能通過(guò)水解反應(yīng)、裂解反應(yīng)、還原轉(zhuǎn)化、官能團(tuán)轉(zhuǎn)移及基酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等酶促反應(yīng)類(lèi)型來(lái)改變膳食營(yíng)養(yǎng)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，提高膳食營(yíng)養(yǎng)素的生物活性和生物利用率，方便人體更好地對(duì)膳食營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)行吸收利用，同時(shí)膳食營(yíng)養(yǎng)素?cái)?shù)量及結(jié)構(gòu)的改變又能改善腸道微生物的菌相，促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生，最終對(duì)人體健康產(chǎn)生積極的影響，形成雙贏的局面[13-16]。因此，我們認(rèn)為腸道菌群與茯磚茶多酚類(lèi)互作在維護(hù)人體健康方面也具有重要的作用。

目前，我國(guó)人口老齡化進(jìn)程加速，2016年底老年人口已超過(guò)2.3億，如何讓老年人健康地安度晚年，催發(fā)了大健康產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展[17]。為此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)模擬人體腸道微生物體外發(fā)酵技術(shù)，分析發(fā)酵過(guò)程中茯磚茶多酚類(lèi)及 SCFAs的含量變化，并結(jié)合高通量測(cè)序分析發(fā)酵過(guò)程中老年人腸道菌群多樣性及結(jié)構(gòu)的改變，從而研究老年人腸道菌群與陳年茯磚茶多酚類(lèi)的體外互作情況，希望能為以后進(jìn)一步研究陳年茯磚茶對(duì)老年人的營(yíng)養(yǎng)與保健方面的影響提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳放1年及7年的茯磚茶由湖南有關(guān)企業(yè)提供；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（GA）：上海瑞永生物科技有限公司；6種主要兒茶素單體的標(biāo)準(zhǔn)品：表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）、兒茶素（DL-C）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（GCG），美國(guó)sigma公司；SCFAs標(biāo)準(zhǔn)溶液：乙酸、丙酸及丁酸，美國(guó)Sigma公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器有限公司；YQX-II厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；安捷倫1200型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；安捷倫 7890A氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司； GeneAmp? PCR System 9700系列PCR熱循環(huán)儀，美國(guó)愛(ài)普拜斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茯磚茶多酚的提取純化

①將茶葉粉碎，按料液比1∶10（g∶mL）加入超純水，調(diào)節(jié)pH值至4，在95℃恒溫水浴中以120 r·min-1振蕩浸提 30 min，接著室溫冷卻靜置1 h，分別浸提2次，并合并2次浸提液；②將浸提液以5 000 r·min-1離心15 min，過(guò)濾后于 50℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)中濃縮至原來(lái)的1/3；③在濃縮液中加入等體積的二氯甲烷，上下振蕩3 min，靜置分層后收集上層水相，重復(fù)3次；④在上層水相中加入等體積的乙酸乙酯，上下振蕩 3 min，靜置萃取，共萃取 2次，合并2次的上層乙酸乙酯相；⑤30℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙酸乙酯，蒸發(fā)至干，得茶多酚固形物，再使用超純水溶解于平皿內(nèi)，-80℃冷凍過(guò)夜；⑥進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得茶多酚凍干粉，備用。

1.3.2 茯磚茶多酚提取物的純度測(cè)定

（1）茶多酚純度測(cè)定

準(zhǔn)確稱取茶多酚凍干粉 0.1 g，加入超純水充分溶解，根據(jù)GB/T 8313—2008福林酚比色法[18]使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值。結(jié)合沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線按下式計(jì)算茯磚茶多酚純度：

式中：C為測(cè)得的多酚含量，μg·mL-1；V為樣品溶液的體積，mL；d為稀釋倍數(shù)；m為茯磚茶多酚凍干粉的質(zhì)量，g。

（2）提取物中茶多酚衍生物含量測(cè)定

茶黃素、茶紅素及茶褐素含量測(cè)定根據(jù)《茶葉品質(zhì)理化分析》分光光度法略作改動(dòng)[19]。

1.3.3 老年人腸道微生物體外靜態(tài)厭氧培養(yǎng)

參考張?chǎng)蔚萚20]報(bào)道的方法，對(duì)老年人腸道菌群的體外靜態(tài)厭氧培養(yǎng)略作改動(dòng)。收集受試者（2男1女，均為湖南省65歲健康老年人，在采集糞樣前 3個(gè)月內(nèi)均未服用過(guò)抗生素）的新鮮全便，在厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行樣品處理（環(huán)境溫度4℃）。

首先，取3位老年人的糞樣等重混勻，并稱取混勻糞樣10 g，在90 mL無(wú)菌PBS緩沖液（pH 7.4）中旋渦振蕩 3 min，混勻后用 4層紗布過(guò)濾，得到含老年人腸道菌群的 PBS混合液。接著在3個(gè)分裝有225 mL無(wú)菌含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試劑瓶中各加入PBS混合液25 mL，經(jīng)漩渦振蕩3 min，混勻后獲得含老年人腸道菌群的混合培養(yǎng)基，得空白組（B組）。然后根據(jù)茯磚茶多酚的純度差，將2.50 g（純度83.15%）陳放1年及2.73 g（純度76.56%）陳放 7年的茯磚茶的茶多酚凍干粉各加入一瓶混合培養(yǎng)基中漩渦振蕩3 min，充分混勻后得到含老年人腸道菌群的1年陳茶多酚組（N組）和 7年陳茶多酚組（O組）。最后將 B組、N組和O組以每管5 mL在厭氧條件下各密閉分裝45管，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜態(tài)厭氧培養(yǎng)，在培養(yǎng) 0 h、4 h、8 h、12 h及24 h時(shí)，分別取9管發(fā)酵液置于-80℃保藏，以備接下來(lái)的試驗(yàn)。

1.3.4茯磚茶多酚的含量測(cè)定

根據(jù) 1.3.2節(jié)的試驗(yàn)方法，測(cè)定 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后的樣品吸光度值。

根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，可列以下計(jì)算公式：

茶多酚含量=C×d

式中：C為測(cè)得的多酚含量，μg·mL-1；d為稀釋倍數(shù)。

1.3.5主要兒茶素單體及GA的含量測(cè)定

（1）高效液相色譜檢測(cè)條件

色譜柱：Calesil-C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，進(jìn)樣量 10 mL，流速 1.0 mL·min-1。經(jīng) 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，采用梯度洗脫，流動(dòng)相A：超純水；流動(dòng)相 B：VN,N-2甲基甲酰胺∶V甲醇∶V冰醋酸=40∶2∶1.5，洗脫時(shí)間及流動(dòng)相變化情況如表1所示。

表1 高效液相色譜檢測(cè)洗脫時(shí)間及流動(dòng)相變化情況Table 1 Elution time and mobile phase change of high performance liquid chromatography

（2）含量測(cè)定

根據(jù)各峰的峰面積利用外標(biāo)法計(jì)算各種成份的含量，公式如下：

式中：A1為樣品的峰面積；A2為標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；C為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；V為樣品稀釋倍數(shù)；W為樣品的重量。

1.3.6 SCFAs的含量測(cè)定

（1）樣品前處理

準(zhǔn)確移取各樣品 1 mL，12 000 r·min-1離心15 min取上清，按9∶1（V∶V）加入25%偏磷酸靜置處理3 h，再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

（2）氣相色譜檢測(cè)條件

色譜柱：DB-FFAP氣相色譜柱（30 m×250 μm×5 μm）。載氣：99.99%高純氮?dú)?，流?.8 mL·min-1。輔助氣：99.99%高純氫氣。FID檢測(cè)器溫度 280℃，進(jìn)樣口溫度 250℃，分流比50∶1，進(jìn)樣量1 μ 。程序升溫：初始溫度60℃，以20℃·min-1的速率升溫至220℃，維持 1 min。程序自動(dòng)測(cè)定樣品中乙酸、丙酸及丁酸的含量。

1.3.7 Illumina高通量測(cè)序試驗(yàn)

（1）樣本DNA提取及PCR擴(kuò)增

將各樣本的3組平行樣品進(jìn)行等量混勻，采用DNA提取試劑盒對(duì)基因組DNA進(jìn)行提取，再使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA的純度及濃度。

以檢測(cè)達(dá)標(biāo)的基因組DNA為模板，使用帶有Barcode的特異引物對(duì)樣品的16 S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增：

正向引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA-3'）

反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3'）

每個(gè)樣品重復(fù)3次，且所有的PCR反應(yīng)終止于線性擴(kuò)增期，PCR結(jié)束后將同一樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合，再用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)條件為5 V·cm-1，檢測(cè)時(shí)間為20 min。使用OMEGA膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。

（2）待測(cè)樣本的定量

參照電泳檢測(cè)的初步結(jié)果，將 PCR回收產(chǎn)物用Qubit 2.0（ThermoFisher公司）進(jìn)行定量，之后參照每個(gè)樣品的測(cè)序要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

（3）文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

使用 Illumina公司的 Truseq DNA PCR-Free Sample Prep Kit試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，檢測(cè)合格后使用Illumina公司的Hiseq Rapid SBS Kit v2測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

茯磚茶多酚及 SCFAs含量變化的數(shù)據(jù)分析：試驗(yàn)均進(jìn)行3次獨(dú)立樣品的測(cè)定，結(jié)果以±s表示，并運(yùn)用SPSS 24.0軟件的單因素分析方法（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析。數(shù)據(jù)圖通過(guò)Excel 2013軟件完成。

Illumina高通量測(cè)序試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析：雙端測(cè)序得到的PE reads首先運(yùn)用FLASH[21]進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染的序列后完成數(shù)據(jù)過(guò)濾，獲得可供后續(xù)分析的高質(zhì)量目標(biāo)序列。后續(xù)的生物信息學(xué)操作運(yùn)用QIIME[22]、Usearch[23]等完成，統(tǒng)計(jì)和作圖方法主要參照參考文獻(xiàn)[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯磚茶多酚提取物的成分構(gòu)成

如表2所示，提取純化的陳放1年及7年的茯磚茶的茶多酚純度分別為 83.15%和76.56%，兩者純度相差 6.59百分點(diǎn)，因此本試驗(yàn)中N組和O組茯磚茶多酚每100 mL的添加量分別為1、1.09 g，從而保證兩組中多酚總量一致。經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，茯磚茶多酚提取物中均無(wú)茶黃素及茶紅素檢出，僅檢測(cè)到茶褐素的微少殘留，且在兩組中的殘留量接近，可以基本排除這幾類(lèi)非多酚類(lèi)功能性成分對(duì)試驗(yàn)的影響。由于茯磚茶多酚類(lèi)成分種類(lèi)繁多，本試驗(yàn)選取含量較高的 EGCG、EGC、ECG、EC、DL-C、GCG及GA等成分進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)年份的茯磚茶中這幾類(lèi)成分的含量差異較大，可用來(lái)闡釋陳年茯磚茶多酚類(lèi)成分的含量差異對(duì)老年人腸道菌群的影響，詳見(jiàn)表3。

表2 茯磚茶多酚純度及其衍生物的占比Table 2 The purity of polyphenols and proportion of derivatives in Fu brick teas

表3 茯磚茶多酚類(lèi)中主要成分的占比Table 3 The main polyphenol components in the Fu Brick teas

2.2 茯磚茶多酚及其主要成分的含量變化

在混合糞樣及 B組中檢測(cè)不到多酚、主要兒茶素單體及GA的含量，可以排除糞樣及培養(yǎng)基中可能殘留的多酚類(lèi)成分對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。通過(guò)表4可知，在發(fā)酵4 h時(shí)，N組和 O組的茶多酚含量分別下降 4.14%（P＜0.05）、13.03%（P＜0.01），而這兩組中的主要兒茶素單體及 GA的含量均無(wú)較大改變；說(shuō)明在0~4 h階段，老年人腸道菌群對(duì)兒茶素單體及GA的利用較少，可能利用的主要是茯磚茶在殺青發(fā)酵、加工發(fā)酵及儲(chǔ)藏發(fā)酵中由兒茶素類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化而來(lái)的多酚成分，而7年陳茯磚茶多酚類(lèi)中具有更多的轉(zhuǎn)化成分，更易被老年人腸道菌群破壞酚羥基結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致茶多酚含量下降更明顯。在 4~12 h階段中，這兩組中的茶多酚含量均無(wú)顯著性變化，但出現(xiàn)EGCG、EGC、ECG及EC含量的顯著下降（P＜0.05），且N組中這4類(lèi)兒茶素的降低量分別是O組的1.39倍、5.61倍、1.75倍及2.48倍；說(shuō)明此階段中，老年人腸道菌群對(duì)茯磚茶多酚類(lèi)的轉(zhuǎn)化作用沒(méi)有停滯，只是對(duì)酚羥基結(jié)構(gòu)的破壞作用降低，導(dǎo)致茶多酚含量變化不明顯。而在12~24 h階段，N組和O組的茶多酚含量極顯著下降16.23%及15.09%（P＜0.01），但主要兒茶素單體及 GA的含量均無(wú)明顯降低（P＞0.05）；說(shuō)明此階段中這兩組的老年人腸道菌群主要利用的多酚成分不是主要兒茶素單體及GA。

2.3 SCFAs的含量變化

乙酸、丙酸及丁酸是人體腸道菌群的發(fā)酵產(chǎn)物，約占腸道內(nèi)SCFAs總量的80%以上，它們不僅可以作為腸道粘膜細(xì)胞的主要能量來(lái)源，還可以通過(guò)減少促炎癥因子的產(chǎn)生來(lái)降低腸道炎癥的發(fā)生[25]。如表5所示，N組及O組在發(fā)酵過(guò)程中，乙酸、丙酸及丁酸的含量均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。在培養(yǎng)24 h后，N組中的乙酸、丙酸及丁酸的含量分別是B組的1.60倍、1.17倍和2.66倍；而O組中的乙酸、丙酸及丁酸的含量分別是B組的2.16倍、1.26倍和 3.46倍。以上數(shù)據(jù)表明，茯磚茶多酚類(lèi)能有效促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程中乙酸、丙酸及丁酸的產(chǎn)生，其中以7年陳茯磚茶的茶多酚類(lèi)作用效果更加顯著。

2.4 Alpha多樣性分析

在 97%的相似性水平上使用 UPARSE算法[26]進(jìn)行 OTU（Operational Taxonomic Units）的聚類(lèi)分析，并對(duì)樣品間的OTU代表性序列進(jìn)行計(jì)數(shù)，其OTU數(shù)可以代表樣品中物種的豐度。Alpha多樣性能反應(yīng)出每個(gè)樣品中菌群的豐度和多樣性水平，其中Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均用來(lái)估計(jì)菌群中含有的OTU數(shù)目，指數(shù)值越高表示菌群中物種的豐度也越高；Shannon指數(shù)（香農(nóng)-維納指數(shù)）和 Simpson指數(shù)（辛普森指數(shù)）均用來(lái)估算樣品中菌群的多樣性，其指數(shù)值越大表明菌群多樣性越高。

表4 茯磚茶多酚及其主要成分的含量變化Table 4 Changes of the main polyphenol contents in Fu brick teas

表5 SCFAs的含量變化Table 5 Changes of the SCFA contents

由表6可知，在4 h時(shí)，相比初始階段，各組的菌群豐度和多樣性水平有所下降，但是添加茯磚茶多酚類(lèi)的組分對(duì)腸道菌群豐度和多樣性的穩(wěn)定作用較B組的強(qiáng)，其中O組比N組更突出。在8 h時(shí)，各組的菌群豐度和多樣性水平開(kāi)始上升，整體上O組＞N組＞B組。在 12 h及 24 h時(shí)，則呈現(xiàn)出 O組＞B組＞N組，這可能與 N組在4~12 h階段中EGCG、EGC、ECG及EC的含量降低較多有關(guān)，這4種兒茶素類(lèi)化合物對(duì)部分腸道有害菌群呈現(xiàn)出抑菌作用，從而稍微降低了N組的菌群豐度和多樣性水平，這與許奇等[27]研究結(jié)果相同。

表6 樣品Alpha多樣性指數(shù)Table 6 Alpha-diversity values of samples

2.5 老年人腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化

2.5.1 門(mén)水平上老年人腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化

使用 Uclust分類(lèi)法對(duì) 97%相似程度的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，挑選出OTU的代表性序列使用 Uchime[28]去除嵌合體，通過(guò)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)[29]進(jìn)行物種分類(lèi)信息的劃分，同時(shí)剔除注釋為葉綠體、線粒體及非細(xì)菌或古菌界的OTU，統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。通過(guò)圖1發(fā)現(xiàn)老年人腸道菌群所含細(xì)菌分屬19個(gè)門(mén)，在這3組的各個(gè)厭氧培養(yǎng)階段中相對(duì)豐度超過(guò)1%的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)有：變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）及放線菌門(mén)（Actinobacteria），這4個(gè)門(mén)的菌群總和均在各樣品中占99%以上。在各個(gè)培養(yǎng)階段，各組的老年人腸道菌群在門(mén)水平上的變化均呈現(xiàn)出波動(dòng)性變化的特征，其中 N組和 O組在這4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)上較為接近，與B組的變化相左。以下統(tǒng)計(jì)相同時(shí)間段下各組中相同菌門(mén)的相對(duì)豐度變化在 5%以上的情況：在12 h時(shí)變形菌門(mén)的相對(duì)豐度大小為B組＞N組＞O組，而在24 h時(shí)則出現(xiàn)N組和O組大于B組的情況；擬桿菌門(mén)在4 h及12 h時(shí)的相對(duì)豐度大小為O組＞N組＞B組，在24 h時(shí)則為B組＞N組＞O組；厚壁菌門(mén)在4 h時(shí)的相對(duì)豐度大小為B組＞N組＞O組，而在24 h時(shí)B組＞O組＞N組；放線菌門(mén)豐度差異5%以上的階段僅出現(xiàn)在12 h時(shí)，相對(duì)豐度大小為B組＞N組＞O組。

2.5.2 屬水平上老年人腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化

根據(jù)物種注釋結(jié)果，在屬水平上得到256個(gè)不同的 OTU，再通過(guò)所有樣品在屬水平上的物種注釋及豐度信息，挑選豐度排名在前50的屬，根據(jù)其在所有樣品中的豐度信息，從物種和樣品兩個(gè)層面進(jìn)行聚類(lèi)，繪制成Heatmap圖，如圖2。在Heatmap圖上，通過(guò)Z-Score（Z值）來(lái)繪制顏色變化梯度，根據(jù)各樣品間的相似程度來(lái)反應(yīng)數(shù)據(jù)的相似性和差異性。圖形上方的樹(shù)形圖是樣品聚類(lèi)關(guān)系樹(shù)，它表示對(duì)不同樣品的聚類(lèi)分析結(jié)果，根據(jù)樣品與樣品間的差異，處于同一分支內(nèi)的樣品序列進(jìn)化關(guān)系相近。圖形左側(cè)的樹(shù)狀圖是物種豐度相似樹(shù)，它表示對(duì)來(lái)自不同樣品的不同物種的聚類(lèi)分析結(jié)果，豐度最相近的物種會(huì)被分配到同一分支上。

圖1 門(mén)水平上老年人腸道菌群變化Fig. 1 Changes in the intestinal flora of the elderly at the phylum level

為了方便了解這 3組在各時(shí)間段下的菌群相對(duì)豐度變化，選取相對(duì)豐度排名前8的屬列表（表7）。發(fā)現(xiàn)埃希氏菌屬（Escherichia）、擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、普雷沃菌9屬（Prevotella 9）、普拉梭菌屬（Faecalibacterium）、γ-變形菌綱_B38（γ-proteobacteria_B38）、罕見(jiàn)小球菌屬（Subdoligranulum）及毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）的相對(duì)豐度總和在各組中均占 70%~80%。其中，在 4 h及12 h時(shí)，埃希氏菌屬及γ-變形菌綱_B38的相對(duì)豐度大小為B組＞N組＞O組，而擬桿菌屬、雙歧桿菌屬及普拉梭菌屬的相對(duì)豐度大小為 O組＞N組＞B組。在8 h時(shí)，上述8種腸道菌屬在這3組中變化不明顯，說(shuō)明此時(shí)在 N組和O組中，陳年茯磚茶多酚類(lèi)成分對(duì)老人腸道菌群的調(diào)節(jié)作用降低，難以影響菌群變化。在24 h時(shí)，相比B組，N組和O組中埃希氏菌屬、雙歧桿菌屬及γ-變形桿菌屬的相對(duì)豐度升高，而擬桿菌屬及普拉梭菌屬則降低。在各個(gè)時(shí)間段下，普雷沃菌9屬、罕見(jiàn)小球菌屬及毛螺旋菌科在各組中的相對(duì)豐度差異不明顯，可以認(rèn)為陳年茯磚茶多酚類(lèi)對(duì)老年人腸道菌群的影響主要集中在埃希氏菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、普拉梭菌屬及γ-變形菌綱_B38上。

圖2 屬水平上老年人腸道菌群變化（Heatmap圖）Fig. 2 Changes in intestinal microflora of elderly people at the gunus level（Heatmap）

表7 屬水平上老年人腸道菌群的相對(duì)豐度變化Table 7 Relative abundance changes in the intestinal flora of the elderly at the genus level

3 討論

茯磚茶是后發(fā)酵茶，在陳放過(guò)程中仍進(jìn)行著微生物代謝及內(nèi)含物轉(zhuǎn)化，其營(yíng)養(yǎng)成分在組成及含量上均不斷發(fā)生著改變，而這些改變能顯著改善茶湯風(fēng)味及提升醫(yī)療保健療效。黃亞輝等[30]研究發(fā)現(xiàn)，茯磚茶陳放時(shí)間越久，其水浸出物、茶多酚、茶紅素、氨基酸及果膠的含量會(huì)逐漸減少，而水溶性糖和茶褐素的含量會(huì)不斷增加，這些生化變化在一定陳放年限內(nèi)會(huì)使茶湯滋味由醇濃轉(zhuǎn)為醇和，湯色由橙色逐漸轉(zhuǎn)為紅色。在醫(yī)療保健方面，陳年茯磚茶在民間經(jīng)常被作為調(diào)理腸胃、治療腸炎的“特效藥”，蕭力爭(zhēng)等[31]研究了不同年份生產(chǎn)的茯磚茶對(duì)小鼠小腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)陳放年份較長(zhǎng)的茯磚茶對(duì)腹瀉的治療效果較新茶好，而行使治療效果的功能性成分可能是陳年茯磚茶的茶多酚。

人體內(nèi)的微生物主要寄居于結(jié)腸內(nèi)，其數(shù)量可以達(dá)到人類(lèi)細(xì)胞數(shù)量的10倍以上，它們能編碼超過(guò)330萬(wàn)個(gè)基因，約為人體自身基因的150倍，其中包含糖苷降解、脂肪酸代謝、多酚類(lèi)降解及修飾等相關(guān)基因[32]。而近年來(lái)，隨著人們對(duì)腸道菌群的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與人體健康密切相關(guān)，膳食營(yíng)養(yǎng)素能通過(guò)與腸道菌群互作來(lái)調(diào)節(jié)腸道微生物的生長(zhǎng)變化，對(duì)癌癥、炎癥、心腦血管疾病、自身免疫性疾病、肥胖、營(yíng)養(yǎng)不良、糖尿病、慢性腎病、艾滋病、肝病及神經(jīng)障礙性疾病的預(yù)防和治療有著密不可分的作用[33-34]。相關(guān)報(bào)道指出，茶多酚能被腸道菌群的多種代謝途徑改變結(jié)構(gòu)，并通過(guò)這些結(jié)構(gòu)不同的產(chǎn)物被腸道吸收來(lái)累積發(fā)揮生物效應(yīng)，另一方面多酚成分及其代謝產(chǎn)物能通過(guò)抑制腸道有害菌群及促進(jìn)腸道有益菌群的增殖來(lái)改善腸道內(nèi)環(huán)境[35]。腸道內(nèi)環(huán)境的改善能促進(jìn)腸道有益菌群產(chǎn)生更多的SCFAs，而SCFAs的增加，又能降低腸道內(nèi)的 pH值，從而減少腸道有害菌的生長(zhǎng)，進(jìn)一步改善腸道健康[36]。

到目前為止，利用現(xiàn)代分子技術(shù)研究膳食多酚中的復(fù)雜成分與腸道菌群相互作用的案例較少，大多數(shù)研究?jī)H局限在單一多酚成分或少數(shù)幾種菌株上[37]。Zhang等[38]利用烏龍茶的EGCG、GCG及EGCG3''ME（EGCG甲基化衍生物）進(jìn)行相關(guān)研究，結(jié)果表明不同的茶多酚成分及含量在腸道菌群的調(diào)節(jié)和促進(jìn)SCFAs的含量增加等方面存在著一定的差異。因此，本試驗(yàn)將模擬人體腸道微生物體外發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到老年人腸道菌群與陳年茯磚茶的茶多酚類(lèi)的體外互作中，通過(guò)探究陳年茯磚茶的茶多酚對(duì)老年人腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，來(lái)初步闡釋陳年茯磚茶的茶多酚影響老年人身體健康的潛在作用。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在各時(shí)間段中O組比N組及B組顯著提高乙酸、丙酸及丁酸的含量，同時(shí)提升老年人腸道菌群的豐度及多樣性水平。在4 h及 12 h時(shí)，O組能明顯降低埃希氏菌屬及γ-變形菌綱_B38的相對(duì)豐度，同時(shí)提高擬桿菌屬、雙歧桿菌屬及普拉梭菌屬的相對(duì)豐度，其中，埃希氏菌屬有 5種菌種，以大腸桿菌在人體腸道中最為常見(jiàn)，一般不致病，但部分菌株具有致病性強(qiáng)的特點(diǎn)，容易引起腹瀉[39]。γ-變形菌綱中有很多常見(jiàn)的致病菌屬，比如沙門(mén)氏菌屬及耶爾辛氏菌屬，且大腸桿菌也屬于這個(gè)綱。近來(lái)，擬桿菌屬中的代表菌株脆弱擬桿菌逐漸被學(xué)者們認(rèn)定為繼雙歧桿菌及乳桿菌之后有益的菌種之一，在腸道中可能比大腸桿菌的含量高，它可以釋放消炎物質(zhì)，在預(yù)防或治療炎癥性腸病中具有優(yōu)異的作用[40]。雙歧桿菌屬對(duì)人體功能具有調(diào)節(jié)作用，在老年人腸道菌群中的數(shù)量較年輕人少，學(xué)者們認(rèn)為過(guò)少的雙歧桿菌是引起衰老的原因之一[41]，它的主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙酸和丁酸。普拉梭菌屬在腸炎患者的腸道中顯著減少，研究表明它能通過(guò)產(chǎn)丁酸、上調(diào)TJ蛋白改善腸道通透性及對(duì)致病菌的抑制作用來(lái)預(yù)防及治療腸道炎癥[42]。因此，通過(guò)以上研究可以認(rèn)為在一定年限內(nèi)，隨著陳放年份的增加，陳年茯磚茶的茶多酚類(lèi)對(duì)老年人腸道菌群的改善作用會(huì)逐漸提升，這值得繼續(xù)深入研究。

[1] Liu B, Yang T, Zeng L, et al. Crude extract of Fuzhuan brick tea ameliorates DSS-induced colitis in mice [J].International Journal of Food Science & Technology, 2016,51(12): 2574-2582.

[2] Foster M T, Gentile C L, Cox-York K, et al. Fuzhuan tea consumption imparts hepatoprotective effects and alters intestinal microbiota in high saturated fat diet-fed rats [J].Molecular Nutrition & Food Research, 2016, 60(5):1213-1220.

[3] Li Q, Liu Z, Huang J, et al. Anti-obesity and hypolipidemic effects of Fuzhuan brick tea water extract in high-fat diet-induced obese rats [J]. Journal of the Science of Food &Agriculture, 2013, 93(6): 1310-1316.

[4] Lin Y, Liu Z H, Lin H Y, et al. Study on influence of Fuzhuan brick tea aqueous extract on lipid metabolism in hyperlipidemia mice and its antioxidation [J]. Journal of Food Safety & Quality, 2015(5): 1561-1566.

[5] Yun-Fei Z, Jing-Jing C, Xiao-Ming J, et al. Changes of major tea polyphenols and production of four new B-ring fission metabolites of catechins from post-fermented Jing-Wei Fu brick tea [J]. Food Chemistry, 2015, 170:110-117.

[6] Jie X, Hu F L, Wei W, et al. Investigation on biochemical compositional changes during the microbial fermentation process of Fu brick tea by LC–MS based metabolomics [J].Food Chemistry, 2015, 186: 176-184.

[7] Zheng W J, Wan X C, Bao G H. Brick dark tea: a review of the manufacture, chemical constituents and bioconversion of the major chemical components during fermentation [J].Phytochemistry Reviews, 2015, 14(3): 499-523. DOI 10.1007/s11101-015-9402-8.

[8] Due? as M, Mu? oz-Gonzá lez I, Cueva C, et al. A survey of modulation of gut microbiota by dietary polyphenols [J].Biomed Research International, 2015, 2015: 850902.

[9] Espí n J C, Gonzá lez-Sarrí as A, Tomá s-Barberá n F A. The gut microbiota: a key factor in the therapeutic effects of(poly)phenols [J]. Biochemical Pharmacology, 2017, 139:82-93.

[10] Shanahan F, Van S D, O'Toole P W, et al. Feeding the microbiota: transducer of nutrient signals for the host [J].Gut, 2017, 66(9): 1709-1717.

[11] Singh R K, Chang H W, Yan D, et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health [J].Journal of Translational Medicine, 2017, 15(1): 73.doi.org/10.1186/s12967-017-1175-y.

[12] Barratt M J, Lebrilla C, Shapiro H Y, et al. The gut microbiota, food science, and human nutrition: a timely marriage [J]. Cell Host Microbe, 2017, 22(2): 134-141.

[13] Mckenzie C, Tan J, Macia L, et al. The nutrition-gut microbiome-physiology axis and allergic diseases [J].Immunological Reviews, 2017, 278(1): 277.

[14] Koppel N, Maini R V, Balskus E P, et al. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota[J]. Science, 2017, 356(6344): eaag2770. DOI:10.1126/science.aag2770.

[15] Leulier F, Macneil L T, Lee W J, et al. Integrative Physiology: At the Crossroads of Nutrition, Microbiota,Animal Physiology, and Human Health [J]. Cell Metabolism,2017, 25(3): 522.

[16] Foster K R, Schluter J, Coyte K Z, et al. The evolution of the host microbiome as an ecosystem on a leash [J]. Nature,2017, 548: 43-51.

[17] 聞?dòng)衩? “醫(yī)老”可顯著緩解老齡化的壓力與負(fù)擔(dān)[J]. 科技導(dǎo)報(bào), 2017, 35(18): 1.

[18] 中華人民共和國(guó)國(guó)家監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局, GB/T 8313—2008茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008: 3-5.

[19] 鐘蘿. 茶葉品質(zhì)理化分析[M]. 上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1989.

[20] 張?chǎng)? 馬麗蘋(píng), 張蕓, 等. 茶葉兒茶素對(duì)腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(5): 232-237.

[21] Mago? T, Salzberg S . F ASH: fast length adjust ent of short reads to improve genome assemblies [J].Bioinformatics, 2011, 27(21): 2957.

[22] Mago? T, Salzberg S L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies [J].Bioinformatics, 2011, 27(21): 2957-5963.

[23] Schloss P D, Westcott S L, Ryabin T, et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, communitysupported software for describing and comparing microbial communities [J]. Applied & Environmental Microbiology,2009, 75(23): 7537-7541.

[24] Team C R, Team RDC. R: a language and environment for statistical computing. r foundation for statistical computing:Vienna, Austria [J]. Computing, 2016, 1: 12-21.

[25] 劉松珍, 張雁, 張名位, 等. 腸道短鏈脂肪酸產(chǎn)生機(jī)制及生理功能的研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 40(11):99-103.

[26] Edgar R C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads [J]. Nature Methods, 2013, 10(10):996.

[27] 許奇, 王麗, 余碧麗, 等. 茶多酚影響腸道菌群活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC)狀態(tài)轉(zhuǎn)變的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2014, 40(8): 12-17.

[28] Edgar R C, Haas B J, Clemente J C, et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection [J].Bioinformatics, 2011, 27(16): 2194.

[29] Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools [J]. Nucleic Acids Research, 2013,41(Database issue): 590-596.

[30] 黃亞輝, 陳建華, 周筠, 等. 不同年代茯磚茶感官品質(zhì)和化學(xué)成分的差異性[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(2): 228-232.

[31] 蕭力爭(zhēng), 余智勇, 黃建安, 等. 茯磚茶對(duì)小鼠小腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的影響[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(s1): 579-582.

[32] 楊陽(yáng), 張?chǎng)? 翁佩芳, 等. 茶葉兒茶素的益生元活性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015(4): 128-136.

[33] Lamas B, Richard M L, Leducq V, et al. CARD9 impacts colitis by altering gut microbiota metabolism of tryptophan into aryl hydrocarbon receptor ligands [J]. Nature Medicine,2016, 22 (6): 598-605.

[34] 郭慧玲, 邵玉宇, 孟和畢力格, 等. 腸道菌群與疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2015, 42(2): 400-410.

[35] Cheng M, Zhang X, Guo X, et al. The interaction effect and mechanism between tea polyphenols and intestinal microbiota: Role in human health [J]. Journal of Food Biochemistry, 2017: e12415. doi.org/10.1111/jfbc.12415.

[36] Sá nchez-Patá n F, Barroso E, Van d W T, et al. Comparativein vitrofermentations of cranberry and grape seed polyphenols with colonic microbiota [J]. Food Chemistry,2015, 183: 273-282.

[37] Kemperman R A, Gross G, Mondot S, et al. Impact of polyphenols from black tea and red wine/grape juice on a gut model microbiome [J]. Food Research International, 2013,53(2): 659-669.

[38] Zhang X, Zhu X, Sun Y, et al. Fermentationin vitroof EGCG, GCG and EGCG3"Me isolated from Oolong tea by human intestinal microbiota [J]. Food Research International,2013, 54(2): 1589-1595.

[39] Mihai Cirstea, Nina Radisavljevic, B Brett Finlay. Good bug,bad bug: breaking through microbial stereotypes [J]. Cell Host & Microbe, 2018, 23: 10-13.

[40] 智發(fā)朝, 白楊, 王曄, 等. 一種脆弱擬桿菌在預(yù)防和/或治療炎癥性腸病中的應(yīng)用, CN105434476A[P]. 2016-03-30.

[41] 王舒悅, 于曉紅, 李鳴, 等. 雙歧桿菌對(duì)中老年人健康影響的菌種特異性初探[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2017,48(5): 745-749.

[42] 徐豪明, 周有連, 聶玉強(qiáng). 普拉梭菌與炎癥性腸病的關(guān)系及機(jī)制研究[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2017, 38(2): 318-321.