秋茶光合作用與品質(zhì)成分變化的分析

張?zhí)m，魏吉鵬,2，沈晨,2，顏鵬，張麗平，李鑫*，韓文炎*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

“春茶好，夏茶澀，秋茶好吃摘不得”。與春茶相比，夏秋茶芽葉中呈苦澀味的兒茶素、花青素等物質(zhì)含量增多，氨基酸含量減少，使其苦澀味重、滋味鮮爽度差，嚴(yán)重影響茶葉品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益[1]。夏秋季光照充足、雨水充沛，茶鮮葉產(chǎn)量很高，但品質(zhì)差、效益低在很大程度上降低了茶農(nóng)的生產(chǎn)積極性，許多地方夏秋茶僅少量采摘或棄之不采，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)[2-3]。

茶葉品質(zhì)的季節(jié)性變化及地區(qū)間的適制性差異反映了環(huán)境因素對品質(zhì)的影響，如光、溫度等因子不僅對茶樹生育具有十分重要的作用[4-5]，同時影響茶樹多酚類、咖啡堿及茶氨酸等品質(zhì)成分的合成與代謝[6]。遮蔭覆蓋作為目前生產(chǎn)上提高夏秋茶品質(zhì)最有效的農(nóng)藝措施[7]，就是通過種植遮蔭樹或覆蓋遮陽網(wǎng)等措施直接改變茶樹冠層的光照、溫度等環(huán)境因子，促進(jìn)茶樹生長，影響并調(diào)節(jié)茶樹生理代謝和生化過程，最終降低茶多酚含量，提高氨基酸、咖啡堿含量，改善夏秋茶品質(zhì)[8-11]。另外，適度遮蔭在改善茶葉品質(zhì)的同時能有效提高茶樹的凈光合速率，打破茶樹光合“午休現(xiàn)象”[12-13]。光合作用為茶樹碳、氮代謝提供碳源和能量[14-15]，而糖作為碳源或信號分子可能參與類黃酮生物合成的代謝調(diào)控[6]。因此，環(huán)境因子光、溫度及光合作用可能是影響夏、秋茶品質(zhì)的關(guān)鍵因素。

目前關(guān)于夏秋季強(qiáng)光、高溫等環(huán)境因素對茶品質(zhì)成分影響的研究較少，本試驗(yàn)以自然生長的龍井43為材料，測定在日照強(qiáng)度、日平均溫度顯著不同的兩時間里，秋茶冠層處光強(qiáng)、葉片溫度、光合作用、主要品質(zhì)成分含量及品質(zhì)成分相關(guān)基因合成表達(dá)，從而初步明確光強(qiáng)、溫度及光合作用與秋茶品質(zhì)成分之間存在的聯(lián)系，為茶葉生產(chǎn)者在改善夏秋茶品質(zhì)方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所龍冠公司茶園中進(jìn)行，采用適制綠茶品種龍井 43為材料。在茶園中選擇受光均勻，無樹木遮蔽的連續(xù)3行（長度為10 m）茶樹作為試驗(yàn)區(qū)。分別于2016年8月19日、9月23日（都為晴天）6時至18時每3 h測定冠層處光強(qiáng)，并隨機(jī)選取試驗(yàn)區(qū)12片茶樹新完全展開葉（一般為第三葉）測定葉片溫度及相關(guān)光合指標(biāo)；6時至21時每3 h均勻地在試驗(yàn)區(qū)采集一芽二葉新梢樣，用于測定茶主要品質(zhì)成分含量和品質(zhì)相關(guān)合成基因表達(dá)。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 光合氣體交換

利用 LI-COR 6400xt型便攜式光合熒光測量系統(tǒng)在光照強(qiáng)度為 600 μmol·m-2·s-1、CO2濃度為 400 μmol·mol-1條件下測定茶樹冠層處新展開葉片的凈光合速率、胞間 CO2濃度、氣孔導(dǎo)度及蒸騰速率，同時利用外部光強(qiáng)探頭及葉室內(nèi)葉溫?zé)犭娕紲y定冠層處光強(qiáng)及葉片的溫度。

1.2.2 茶多酚、游離氨基酸及咖啡堿含量測定

茶多酚含量測定參照GB/T 8313—2008。游離氨基酸、咖啡堿含量測定參照GB/T 8314—2013及GB/T 8312—2013有所改進(jìn)。上清液浸提方法：準(zhǔn)確稱取1.0000 g茶粉末于50 mL錐形瓶中，加入超純水 45 mL后轉(zhuǎn)入沸水浴中，浸提45 min（每隔10 min搖動 1次）后立即趁熱減壓過濾，殘?jiān)脽岢兯礈?~5次。濾液冷卻后轉(zhuǎn)入 50 mL離心管中，用超純水定容至刻度，搖勻。

游離氨基酸測定方法：吸取0.1 mL上清液于10 mL離心管中，分別加入50 μL 2%茚三酮、50 μL pH 8.0的磷酸緩沖液，沸水浴中加熱15 min后在冰水中快速冷卻，然后加入4.8 mL超純水，搖勻后在570 nm波長下測定吸光值。茶咖啡堿含量測定：準(zhǔn)確吸取 5 mL溶液至50 mL離心管中，分別加入4 mL 0.01 mol·L-1鹽酸和2 mL 50%（w/v）的乙酸鉛溶液，然后用超純水定容至刻度，靜置澄清過濾。準(zhǔn)確吸取濾液25 mL至50 mL離心管中，加入0.1 mL 4.5 mol·L-1硫酸溶液，加水稀釋至刻度，混勻，靜置澄清過濾。濾液在274 nm處測定吸光值。

吸光值的測定使用SHIMADZU UV-2550分光光度計(jì)。

1.2.3 茶樹總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

使用TIANGEN RNAprep pure Plant Kit（離心柱型）試劑盒，根據(jù)推薦步驟提取茶樹葉片的總RNA?？俁NA濃度及質(zhì)量的測定使用NaNoDrop2000超微量分光光度計(jì)（中國香港，Gene Company Limited）。使用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒（日本，TOYOBO）將提取的葉片總RNA根據(jù)推薦步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA模板。

1.2.4 基因表達(dá)

qRT-PCR（Quantitative real time-PCR，熒光實(shí)時定量PCR）使用StepOnePlus Real-Time PCR System儀器（美國，Applied Biosystems公司）進(jìn)行。20 μL 反應(yīng)體系中包括 10 μL SYBR Green Master Mix熒光染料（中國，Vazyme），濃度稀釋為 10 μmol·L-1的正、反向引物各 0.4 μL，0.4 μL ROX，2 μL cDNA 模板及 6.8 μL滅菌超純水。PCR采用兩步法標(biāo)準(zhǔn)程序，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 10 s，65℃延伸 40 s，擴(kuò)增 40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量計(jì)算參照Livak等方法[16]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SAS 8.1及SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異及相關(guān)性分析，Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物序列，Origin 7.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹冠層光強(qiáng)和葉片溫度的變化

茶樹冠層葉片處的光強(qiáng)及葉片溫度直接受外界環(huán)境光強(qiáng)及空氣溫度的影響，也是直接影響茶樹新梢生長發(fā)育的關(guān)鍵因素。從6時至18時，茶樹冠層處光照強(qiáng)度和葉片溫度均呈先升高后降低的趨勢。8月19日及9月23日光照強(qiáng)度在正午 12時達(dá)到最大值，分別為1649.3、1467.7 μmol·m-2·s-1，隨后迅速下降（圖1-A）。兩者的葉片溫度在12時至15時內(nèi)穩(wěn)定維持當(dāng)天最高值，分別約為42.8℃、34.2℃，前者最高溫比后者高約 8.6℃（圖 1-B）。通過圖1可知，8月 19日冠層處光強(qiáng)與葉片溫度顯著高于9月23日同一時間點(diǎn)的冠層處光強(qiáng)和葉片溫度。

2.2 茶樹冠層功能葉片光合參數(shù)的變化

光合作用是碳代謝的重要部分，植物體內(nèi)的糖、淀粉等碳水化合物和氨基酸、蛋白等含氮化合物都直接或間接地來源于光合作用。此外，植物體內(nèi)的碳氮代謝還需要光合作用提供能量。測定8月19日及9月23日茶樹新展開功能葉的凈光合速率發(fā)現(xiàn)，前者凈光合速率在6 時至 9 時最大，約為 10 μmol·m-2·s-1，其光合作用強(qiáng)度在12時顯著降低，至18時凈光合速率下降為 0.77 μmol·m-2·s-1；后者凈光合速率變化呈現(xiàn)典型的“單峰型”，峰值在上午9時，約 13.37 μmol·m-2·s-1（圖 2-A）。9 時至 18時前，后者光合作用強(qiáng)度顯著高于前者。不同時間點(diǎn)茶樹葉片的氣孔導(dǎo)度如圖 2-B所示，8月19日葉片氣孔導(dǎo)度最大值在9時至12時，約 0.11 mol·m-2·s-1；9 月23 日6~12 時，氣孔導(dǎo)度逐漸上升至最大值，約 0.17 mol·m-2·s-1。前者氣孔導(dǎo)度在15時之前顯著低于后者。圖2-C為不同時間點(diǎn)茶樹葉片的胞間 CO2濃度。8月19日葉片胞間CO2濃度在6時、9時、15時有最低值，12時和18時存在顯著上升；9月23日其趨勢變化較明顯，在9時、15時存在胞間 CO2濃度的當(dāng)天最低值，6時、18時其濃度相對較高。8月19日和9月23日的茶樹葉片蒸騰速率在中午12時達(dá)到最大值，約為3.70 mmol·m-2·s-1，9 時、15 時前者蒸騰速率顯著高于后者（圖2-D）。

2.3 茶樹一芽二葉品質(zhì)成分的變化

圖1 茶樹冠層光強(qiáng)和葉片溫度的變化Fig. 1 The changes of luminous intensity and leaf temperature of tea canopy

圖2 茶樹冠層功能葉片光合參數(shù)的變化Fig. 2 The changes of photosynthesis parameters of tea functional leaves

茶葉中的茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿是影響茶葉品質(zhì)的主要成分，三者的含量及比例直接影響茶葉的滋味品質(zhì)[17]。由圖3-A可知，8月19日6時至21時茶樹一芽二葉中茶多酚含量在 15時達(dá)到最大值，約為 32.41%，21時下降至28.59%。9月23日茶多酚含量在9時、12最高，范圍在14.94%~15.41%，21時含量下降至 12.68%。前者茶多酚含量是后者同一時間茶多酚含量1.9~2.3倍。8月19日游離氨基酸含量整體維持在2.09%~2.29%，但9月23日的含量變化幅度相對較大，不同時間點(diǎn)游離氨基酸含量分別為 3.93%、3.60%、3.76%、3.87%、3.96%、3.12%（圖3-B）。利用茶多酚及游離氨基酸含量的比值，獲得酚氨比（圖3-C）。結(jié)果顯示 8月 19日酚氨比維持在很高的水平，約13.27~14.75；9月23日酚氨比相對較低，范圍在 3.57~4.24。前者酚氨比是后者的3.14~4.09倍。圖3-D所示為茶葉片中咖啡堿含量，發(fā)現(xiàn)8月19日咖啡堿含量顯著高于9月23日。前者不同時間點(diǎn)咖啡堿含量分別為3.81%、2.92%、2.90%、3.00%、3.01%、2.62%，在上午 6時開始下降。后者咖啡堿含量分別為 2.37%、2.47%、2.61%、2.12%、2.09%、1.97%，在 12時達(dá)最大值后開始降低。

2.4 茶樹冠層處光強(qiáng)、葉片溫度與光合作用參數(shù)、品質(zhì)成分含量相關(guān)性分析

將8月19日、9月23日6時至18時茶樹冠層處光強(qiáng)、葉片溫度、光合作用參數(shù)與品質(zhì)成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析（表1）。結(jié)果表明，茶樹冠層處光強(qiáng)與葉片溫度顯著相關(guān)，同時影響茶樹葉片的氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率及胞間 CO2濃度，相關(guān)性系數(shù)分別為 0.659、0.409、–0.597和0.885。葉片溫度與凈光合速率負(fù)相關(guān)，與蒸騰速率正相關(guān)。同時，葉片溫度與品質(zhì)成分茶多酚、氨基酸含量及酚氨比分別有0.604、–0.691、0.676的顯著相關(guān)性。另外，茶樹主要品質(zhì)成分含量之間也具有顯著的相關(guān)關(guān)系。茶多酚含量與酚氨比、咖啡堿含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.960、0.802；與氨基酸含量負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為–0.939。氨基酸含量與酚氨比、咖啡堿含量呈顯著負(fù)相關(guān)。酚氨比與咖啡堿含量顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.800。

圖3 茶樹一芽二葉品質(zhì)成分含量的變化Fig. 3 The changes of tea quality components in two leaves and one bud shoot

表1 茶樹冠層處光強(qiáng)、葉片溫度與光合參數(shù)、品質(zhì)成分含量之間的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of luminous intensity, leaf temperature, net photosynthesis rate andquality component contents

2.5 茶樹冠層處光強(qiáng)、葉片溫度、凈光合速率與品質(zhì)成分基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析

為在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)一步明確光強(qiáng)、葉片溫度、凈光合速率是否與品質(zhì)成分相關(guān)合成基因表達(dá)存在聯(lián)系，通過GenBank中登錄的有關(guān)茶多酚[18-19]、氨基酸[20-21]及咖啡堿[22]合成基因的序列信息，設(shè)計(jì)相關(guān)引物（表2）。以CsPTB為內(nèi)參基因[23]，8月19日6時的表達(dá)量為對照，得到8月19日與9月23日不同時間點(diǎn)相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)。利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)與光強(qiáng)、葉片溫度、凈光合速率及品質(zhì)成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析（表3）。

結(jié)果表明，基因CsPAL、CsCHI、CsF3′5′H、CsDFR、CsANS、CsUFGT、CsLAR的表達(dá)水平與秋茶茶多酚含量顯著相關(guān)，其中CsPAL、CsANS、CsLAR與茶多酚含量的相關(guān)系數(shù)分別為 0.603、0.469、0.425，而CsCHI、CsF3′5′H、CsDFR、CsUFGT與茶多酚含量的相關(guān)系數(shù)分別為–0.683、–0.754、–0.696、–0.870?；駽sGDH、CsGS、CsGOGAT、CsTS1及CsTS2與秋茶氨基酸含量的顯著相關(guān)系數(shù)分別為 0.559、–0.427、0.413、0.882、–0.445。基因CsTIDH、CssAMS與咖啡堿含量具有顯著相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)分別為–0.421、0.503。在上述基因中進(jìn)一步篩選，表達(dá)量與葉片溫度顯著相關(guān)的分別是CsPAL、CsF3′5′H、CsANS、CsUFGT、CsGS、CsGOGAT及CsTS1；與光強(qiáng)顯著相關(guān)的是基因CsPAL、CsANS、CsGS、CsTS1、CsTS2及CssAMS；與凈光合速率顯著相關(guān)的基因是CsF3′5′H、CsANS、CsUFGT、CsGOGAT及CsTS2。

3 討論

在茶園生態(tài)系統(tǒng)中，光、CO2濃度、溫度、水分是影響茶樹光合作用的主要生態(tài)因子，葉片溫度、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度及蒸騰速率是影響茶樹光合作用的主要生理因子[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，秋茶生長期典型的強(qiáng)光、高溫環(huán)境下，冠層處光強(qiáng)并不是影響秋茶凈光合速率的直接因素，而與冠層處光強(qiáng)有顯著相關(guān)性的葉片溫度、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度是影響秋茶凈光合速率的關(guān)鍵生理因子。葉片胞間CO2濃度與氣孔導(dǎo)度密切相關(guān)，兩者的變化共同反映出凈光合速率主要受氣孔限制還是葉肉細(xì)胞活性限制[25]。由圖2-C可知，秋茶凈光合速率的下降伴隨著胞間CO2濃度的提高，此時葉肉細(xì)胞光合活性成為秋茶光合作用的主要限制因素。因此，秋茶葉片溫度以及葉肉細(xì)胞光合活性成為影響其凈光合速率的關(guān)鍵因素。

表2 茶樹茶多酚、氨基酸、咖啡堿合成相關(guān)基因的實(shí)時熒光定量引物序列Table 2 Primer sequences of genes related to the biosynthesis of tea catechins, amino acids and caffeine for qRT-PCR

表3 茶樹品質(zhì)成分合成基因表達(dá)與冠層處光強(qiáng)、葉片溫度及凈光合速率的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of the expressions of genes involved in quality component biosynthesis, the luminous intensity, leaf temperature and net photosynthesis rate

光、溫度不僅影響茶樹光合作用，同時也直接參與調(diào)控茶樹次生代謝途徑中一些關(guān)鍵基因的表達(dá)。李麗田[26]研究表明，光強(qiáng)影響茶樹兒茶素的組分含量并且多數(shù)兒茶素合成相關(guān)基因的表達(dá)受光強(qiáng)的影響，但不同基因?qū)鈴?qiáng)的響應(yīng)模式不同。表3研究結(jié)果顯示，秋茶冠層處光強(qiáng)可能對兒茶素合成基因CsPAL、CsCHS、CsANS、CsANR存在顯著誘導(dǎo)作用。目前，光對氨基酸、咖啡堿代謝調(diào)控的研究報(bào)道相對較少，本研究發(fā)現(xiàn)，冠層處光強(qiáng)可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因CsGS、CsTS1、CsTS2及CssAMS的表達(dá)。值得注意的是，冠層處光強(qiáng)與秋茶茶多酚、氨基酸及咖啡堿含量沒有顯著相關(guān)性，因此，光強(qiáng)雖然對秋茶部分品質(zhì)相關(guān)基因存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但可能不是影響最終品質(zhì)成分含量的關(guān)鍵因素。

有研究證明，晝夜溫度為15℃/5℃的低溫環(huán)境下，銀杏葉片中類黃酮總量，PAL、C4H及4CL活性顯著提高[27]；葡萄果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果證實(shí)，溫度對類黃酮代謝途徑可能存在轉(zhuǎn)錄后或翻譯后調(diào)控[28]。但是，目前關(guān)于溫度對茶樹次生代謝產(chǎn)物的影響還未見報(bào)道。表1和表3結(jié)果證明，秋茶葉片的溫度可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控兒茶素合成基因CsPAL、CsF3′5′H、CsANS、CsUFGT與氨基酸合成基因CsGS、CsGOGAT、CsTS1的表達(dá)，進(jìn)而影響秋茶茶多酚、氨基酸的合成積累。咖啡堿合成基因CsTCS1的表達(dá)雖與葉片溫度相關(guān)系數(shù)達(dá)0.511，但與咖啡堿含量無直接相關(guān)性。因此，在合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，葉片溫度可能不是影響秋茶咖啡堿合成的關(guān)鍵因素。

光合作用是葡萄糖、果糖、蔗糖等物質(zhì)的主要來源。許多研究報(bào)道糖作為碳源和能源或信號分子促進(jìn)類黃酮物質(zhì)的合成[29-30]，同時調(diào)控類黃酮途徑中PAL、C4H、4CL、CHS、DFR、F3H、UF3GT等基因表達(dá)[31]。表3結(jié)果顯示，秋茶光合作用的強(qiáng)弱與部分品質(zhì)基因的表達(dá)水平有顯著的相關(guān)性，糖類是否也作為碳源或信號分子對秋茶兒茶素、氨基酸某些合成相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控是值得深入研究的科學(xué)問題。

隨著全球極端氣候變化越來越明顯，夏、秋季持續(xù)的高溫天氣越來越普遍[32-33]，明確光、溫度等主要環(huán)境因素對茶樹光合作用、品質(zhì)成分的影響及調(diào)控機(jī)制能進(jìn)一步幫助生產(chǎn)者采取有效管理措施在生產(chǎn)栽培上預(yù)防極端天氣對茶樹生長的影響，有利于茶產(chǎn)業(yè)更好地發(fā)展。

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