小貫小綠葉蟬半胱氨酸蛋白酶基因的克隆與表達(dá)

于永晨，肖斌，孫曉玲

1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州310008；3. 農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008

半胱氨酸蛋白酶（Cysteine protease，CYP）廣泛分布于植物、動(dòng)物、病原微生物、寄生線蟲和哺乳動(dòng)物等生物體內(nèi)，是一類以半胱氨酸殘基為活性中心的蛋白水解酶，可參與細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)水解與加工、組織再生、個(gè)體發(fā)育、免疫防御，以及細(xì)胞凋亡等許多生理過程[1-3]。在植食性昆蟲體內(nèi)，CYP是不可或缺的重要水解蛋白之一，主要參與食物消化、生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、蛻皮變態(tài)、免疫調(diào)節(jié)和種群防御等重要生命過程，目前在鱗翅目和鞘翅目等完全變態(tài)發(fā)育的昆蟲中研究得已較為透徹[4-9]。例如，家蠶（Bombyx mori）中已報(bào)道了 13條 CYP基因全長(zhǎng)序列，它們?cè)诓煌M織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜也已明確，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)CYP不僅參與了家蠶蛻皮與變態(tài)過程中的組織降解與重構(gòu)，而且也參與了家蠶血細(xì)胞發(fā)育或輔助血細(xì)胞執(zhí)行造血功能等生理過程[10-14]。Peter等[15]從馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineataSay）中克隆獲得了兩條與消化相關(guān)的 CYP基因全長(zhǎng)序列，并發(fā)現(xiàn)其中一條可被植物的誘導(dǎo)防御上調(diào)。棉鈴蟲（Helicoverpa armigeraHübner）CYP不僅參與 5~6齡幼蟲的蛻皮過程，而且參與胚胎發(fā)育過程中卵黃蛋白的降解[6-7]。迄今，關(guān)于不完全變態(tài)發(fā)育昆蟲CYP的研究?jī)H在豆長(zhǎng)管蚜（Acyrthosiphon pisum）等個(gè)別昆蟲中有少量報(bào)道[4]。

小貫小綠葉蟬（Empoasca onukiiMatsuda）的發(fā)育類型為不完全變態(tài)，以成蟲、若蟲刺吸茶樹芽、葉及嫩梢汁液為害，是我國(guó)茶園的頭號(hào)害蟲。雌成蟲陸續(xù)孕卵和分批產(chǎn)卵的習(xí)性導(dǎo)致其在田間世代重疊嚴(yán)重而難于防治，據(jù)統(tǒng)計(jì)，小貫小綠葉蟬大爆發(fā)可引起 30%~50%的茶葉產(chǎn)量損失，為害葉制成茶葉后品質(zhì)嚴(yán)重下降[16]。長(zhǎng)期以來，對(duì)小貫小綠葉蟬的有效防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥。然而，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、害蟲抗藥性等問題日益凸顯。王念武等[17]和莊家祥等[18]的研究結(jié)果表明，福建福安茶場(chǎng)的小貫小綠葉蟬對(duì)吡蟲啉、啶蟲脒和聯(lián)苯菊酯的抗性指數(shù)已達(dá)到中抗至高抗的水平。因此，利用新型抗蟲分子標(biāo)靶開發(fā)小貫小綠葉蟬的調(diào)控劑已成為當(dāng)務(wù)之急。如前所述，CYP在昆蟲的整個(gè)生命過程中發(fā)揮著重要作用，因此干擾半胱氨酸蛋白酶的生理功能，將會(huì)對(duì)目標(biāo)害蟲的生理機(jī)能造成嚴(yán)重阻礙，并最終導(dǎo)致死亡。目前，CYP已作為靶蛋白在一些鱗翅目昆蟲進(jìn)行了相關(guān)研究[19]。本文從小貫小綠葉蟬的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得CYP的基因片段的轉(zhuǎn)錄本序列，利用RACE技術(shù)對(duì)其全長(zhǎng)進(jìn)行克隆，繼而采用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)Eocyp在小貫小綠葉蟬的不同發(fā)育時(shí)期、不同組織部位，以及不同溫度和不同光照條件處理后的表達(dá)量變化情況進(jìn)行研究，擬為該基因的利用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與樣品采集

小貫小綠葉蟬成蟲捕于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)茶場(chǎng)，并在網(wǎng)籠中用離體茶枝飼喂[(25±2)℃，(70±5)%，14L︰10D]。繁殖一代后用于實(shí)驗(yàn)。不同發(fā)育時(shí)期（5個(gè)不同齡期若蟲及雌、雄成蟲）及不同部位（頭、胸、腹）的樣品在體視顯微鏡（SZ60，奧林巴斯，日本）下進(jìn)行采集。選取 5齡新羽化若蟲，分別于 4、26、36℃下飼養(yǎng) 1 h，并于26℃下恢復(fù)1 h后采集，作為不同溫度處理的樣品備用。選取 4齡新生若蟲，分別于不同光照時(shí)間（0L︰24D，14L︰10D，24L︰0D）下飼養(yǎng)2 d后采集，作為不同光照處理的樣品備用。上述樣品均保存于–80℃冰箱中。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 總RNA提取與cDNA的合成

使用 Promega總 RNA提取試劑盒（SV Total RNA Isolation System，Progema）提取總RNA。使用NANODROP 2000c測(cè)定RNA的濃度及質(zhì)量。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT Master Mix，TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA 第一鏈。利用 SMARTer?RACE 5′/3′ Kit（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行 RACE所用cDNA的合成。

1.3 Eocyp基因序列全長(zhǎng)克隆

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室小貫小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到 1個(gè)小貫小綠葉蟬半胱氨酸蛋白酶基因片段轉(zhuǎn)錄本序列，根據(jù)此序列分別設(shè)計(jì)RACE引物（表1），以RACE所用cDNA為模板進(jìn)行 PCR，反應(yīng)體系為：2×PrimerSTAR Max Premix（ TaKaRa, Tokyo, Japan） 20 μL ，10×Universal Primer A Mix（UPM）4 μL，5′或 3′基因特異引物（GSP）1 μL，cDNA模板1 μL，補(bǔ)充ddH2O至40 μL。克隆采用巢式PCR技術(shù)，反應(yīng)條件為：94℃變性 30 s，68℃退火30 s，72℃延伸90 s，25個(gè)循環(huán)。之后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化與回收，并以PMD-19T為載體進(jìn)行連接，成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后委托南京金斯銳科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的結(jié)果使用 DNAman進(jìn)行序列拼接，獲得全長(zhǎng)后對(duì)其開放閱讀框（ORF）設(shè)計(jì)引物（表1），進(jìn)行 PCR重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，驗(yàn)證所獲得的全長(zhǎng)序列。

1.4 生物信息學(xué)分析

推導(dǎo)得到的氨基酸序列在 NCBI上進(jìn)行同源比對(duì)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）；利用ProtParam（http://web.expasy.org/ protparam）進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，利用 ScanProsite（http://prosite.expasy.org/prosite.html）預(yù)測(cè)蛋白功能結(jié)構(gòu)域；利用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)；利用DNAman進(jìn)行多序列比對(duì)；使用MEGA7軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支重復(fù)檢驗(yàn)次數(shù)均為1 000。

1.5 小貫小綠葉蟬Eocyp表達(dá)特征分析

使用 FastStart Essential DNA Green Master（Roche）試劑盒進(jìn)行熒光定量分析。定量檢測(cè)引物詳見表1，以小貫小綠葉蟬18 S基因?yàn)閮?nèi)參基因。相對(duì)表達(dá)量通過 2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。利用SPSS 22.0軟件，采用單因素方差分析法對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析。

表1 引物信息Table 1 Information of Primers

2 結(jié)果與分析

2.1 Eocyp基因克隆、序列驗(yàn)證及分析

利用 RACE技術(shù)對(duì)Eocyp（GenBank登錄號(hào)：MH036890）的 3′和 5′端進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到800 bp和1 600 bp左右（圖1）的特異性條帶，使用DNAman軟件將測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接得到長(zhǎng)為 2 144 bp的cDNA序列，根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)引物（表1）擴(kuò)增出1條1 772 bp的片段（圖1）。該片段包含 ORF 1 656 bp（圖2），編碼 551個(gè)氨基酸，具有由24個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽。預(yù)測(cè)其分子式為 C2782H4163N737O835S25；相對(duì)分子量為 62 094.59；理論等電點(diǎn)為 6.02；不穩(wěn)定系數(shù)為 36.10，表明該蛋白狀態(tài)穩(wěn)定；總平均親水系數(shù)為–0.493，表明該蛋白為疏水性蛋白。由MotifScan分析表明，該蛋白具有半胱氨酸蛋白酶基因的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，即半胱氨酸活性位點(diǎn) Cys357（351~362 QSVCGS CWSFGT），組氨酸活性位點(diǎn) His499（497~507 LDHAVLLVGYG）和天冬酰胺活性位點(diǎn) Asn519（514~533 YWLVKNSW SNYWGNDGYILM），同時(shí)具有GCDGG簇等保守結(jié)構(gòu)域。

圖1 Eocyp基因RACE克隆及全長(zhǎng)驗(yàn)證Fig. 1 RACE and full-length cDNA clone of Eocyp

2.2 Eocyp基因進(jìn)化樹分析

將Eocyp編碼的氨基酸序列在 GenBank中進(jìn)行檢索，并與其他已登錄的昆蟲Cyp序列進(jìn)行比對(duì)，通過MEGA7軟件采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明（圖 3），小貫小綠葉蟬Eocyp與半翅目昆蟲茶翅蝽（H. halys）和溫帶臭蟲（Cimex lectularius）聚為一支，膜翅目昆蟲小蜜蜂（Apis florea），北美大黃蜂（Bombus impatiens）等聚為一支。等翅目昆蟲古白蟻（Zootermopsis nevadensis）單獨(dú)聚為一支，而鞘翅目昆蟲（Nicrophorus vespilloides）與雙翅目果蠅屬等昆蟲聚為一支。

2.3 Eocyp基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

Eocyp基因在小貫小綠葉蟬不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)結(jié)果詳見圖4。結(jié)果表明，Eocyp在小貫小綠葉蟬所有發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，從若蟲到成蟲的發(fā)育過程中，Eocyp的表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，5齡若蟲表達(dá)量顯著高于其他齡期，而 1齡若蟲和雄成蟲表達(dá)量最低，顯著低于其他若蟲生長(zhǎng)階段。由此推測(cè)Eocyp基因可能在小貫小綠葉蟬的若蟲發(fā)育階段發(fā)揮作用。

圖2 小貫小綠葉蟬Eocyp基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 The cDNA and deduced amino acid sequence of Eocyp in E. onukii

2.4 Eocyp基因在不同部位的表達(dá)分析

Eocyp在小貫小綠葉蟬雌成蟲頭部的表達(dá)量顯著低于胸部和腹部（圖5-A），而Eocyp在雄成蟲胸部的表達(dá)量顯著低于頭部和腹部（圖5-B）。

2.5 光照和溫度對(duì)Eocyp基因表達(dá)量的影響

不同溫度和不同光照處理對(duì)Eocyp的相對(duì)表達(dá)量都沒有顯著影響（圖6）。

3 討論

圖3 Eocyp系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of Eocyp

圖4 Eocyp在小貫小綠葉蟬不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression levels of Eocyp in different developmental stages of E. onukii

圖5 小貫小綠葉蟬Eocyp不同部位的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Relative expression levels of Eocyp in different parts of adults of E. onukii

圖6 小貫小綠葉蟬Eocyp在不同溫度（A）和不同光照（B）條件下的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Expression levels of Eocyp under different temperatures (A) and different photoperiods (B)

本研究克隆到 1條小貫小綠葉蟬半胱氨酸蛋白酶基因的全長(zhǎng)序列，命名為Eocyp，由該基因編碼的蛋白具有半胱氨酸蛋白酶基因的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)和 GCDGG簇等保守結(jié)構(gòu)域（圖 2）。將由該基因編碼的氨基酸序列與已報(bào)道的其他昆蟲半胱氨酸蛋白酶的蛋白進(jìn)行同源性比對(duì)分析，我們發(fā)現(xiàn)Eocyp與同為半翅目的茶翅蝽（Halyomorpha halys）（GenBank登錄號(hào)：XP_014283673.1）半胱氨酸蛋白酶1同源性最高為65%；與麥莖蜂（Cephus cinctus）（XP_015586901.1）、內(nèi)華達(dá)古白蟻（Zootermopsis nevadensis）（XP_021934297.1）及造紙胡蜂（Polistes dominula）（XP_015182850.1）中的 CYP同源率分別為63%、63%和61%，該結(jié)果進(jìn)一步證明我們克隆獲得的Eocyp為半胱氨酸蛋白酶基因。

Eocyp在小貫小綠葉蟬的整個(gè)發(fā)育過程中均有表達(dá)，且Eocyp在不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量存在一定差異，暗示Eocyp在葉蟬的不同發(fā)育階段可能發(fā)揮著不同的作用，這一現(xiàn)象在其他昆蟲中已見報(bào)道。例如，甘藍(lán)地種蠅（Delia radicum）的半胱氨酸蛋白酶DrCP1在幼蟲向蛹轉(zhuǎn)化時(shí)期的表達(dá)量顯著升高，說明該基因可能與幼蟲變態(tài)化蛹有關(guān)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅Bdcyp在不同發(fā)育階段皆有表達(dá)，但是主要集中在蛹期，由此推測(cè)Bdcyp在其變態(tài)發(fā)育過程中可能具有重要作用[20]。與之相似，本研究發(fā)現(xiàn)Eocyp的表達(dá)量由 1齡若蟲發(fā)育到 5齡若蟲的過程中逐步升高，這說明Eocyp對(duì)小貫小綠葉蟬若蟲的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用；Eocyp在5齡若蟲期的表達(dá)量顯著高于雌、雄成蟲的現(xiàn)象，說明該基因在小貫小綠葉蟬由若蟲向成蟲發(fā)育轉(zhuǎn)變的過程中亦具有重要作用。Eocyp在成蟲頭部的表達(dá)量顯著低于胸部和腹部，而Eocyp在雄成蟲胸部的表達(dá)量顯著低于頭部和腹部，這說明該基因可能在小貫小綠葉蟬不同雌、雄成蟲中具有相似且不同的功能。這與花絨寄甲（Dastarcus helophoroidesFairmaire）中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象基本一致[21]，但是Dahel caspase-1還被發(fā)現(xiàn)與老細(xì)胞凋亡和新細(xì)胞形成及成蟲衰老相關(guān)，Eocyp是否具有上述功能還需進(jìn)一步研究。但是，光照及溫度變化不影響Eocyp的相對(duì)表達(dá)量。需要說明的是，本文僅從轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)Eocyp在小貫小綠葉蟬不同發(fā)育階段、不同組織部位，以及不同非生物脅迫處理下的表達(dá)量進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行功能推測(cè)，但是該基因到底具有何種生物學(xué)功能尚需利用 RNAi技術(shù)進(jìn)行深入研究。

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