朝鮮白頭翁的HPLC特征圖譜研究

任喬森，王海洋，翟宏宇，趙琳琳，李秀芬*，唐秋竹，趙琪鐘

(1.吉林省藥品檢驗所，吉林 長春 130033；2.普洱市食品藥品檢驗檢測中心，云南 普洱 665000)

朝鮮白頭翁為毛茛科植物Pulsatillacernua(Thunb.)Bercht et Opiz.的干燥根[1]，分布于中國遼寧南部、吉林東部，在朝鮮、日本、俄羅斯遠東地區(qū)也有分布。多生于山坡草地、灌叢間。其性寒，味苦，歸肝、胃經(jīng)，具瀉火解毒、止痛、利尿消腫、涼血等功效[2]。是朝鮮民族的民間用藥，其用藥歷史可追溯到14世紀，在朝鮮藥典(1982版)和韓國藥典(2016版)均有收載，僅有常規(guī)檢查項和重金屬等安全指標。朝鮮白頭翁在朝鮮族一直做白頭翁藥用，主治風火牙痛、四肢關(guān)節(jié)疼痛、禿瘡、浮腫、細菌性痢疾、阿米巴痢疾之發(fā)熱、腹痛、下痢膿血、里急后重等證，近年來的研究表明，朝鮮白頭翁不僅具有以上傳統(tǒng)的功效，而且還具有抑菌抗炎、抗微生物、抗生物酶、抗腫瘤等作用[3-6]，還有文獻報道朝鮮白頭翁所含的某些活性成分對于阿爾茨海默癥也具有治療作用[7]。白頭翁屬植物化學成分主要為五環(huán)三萜皂苷類，朝鮮白頭翁以常春藤皂苷元型和齊墩果酸型皂苷為主，而白頭翁以羽扇豆烷型皂苷為主[8-9]。

特征圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別模式，能有效地檢測和控制中藥產(chǎn)品的真實性、質(zhì)量的一致性及穩(wěn)定性[10]。本文采用高效液相色譜(HPLC)法建立不同產(chǎn)地朝鮮白頭翁的特征圖譜，能夠較全面地反映出其整體特征，也為進一步控制朝鮮白頭翁藥材的質(zhì)量提供了一定的實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，美國Agilent；BT-125D型分析天平，德國Sartorius；DK-98ⅡA電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；6202高速粉碎機，北京銀捷玉誠機械設備有限公司。

1.2 試劑與材料

白頭翁皂苷H(批號：Must-16032808，含量98.00%)、常春藤皂苷C(批號：Must-16032507，含量98.53%)等對照品，購自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，美國Fisher；其他試劑均為分析純，水為超純水。

實驗中所用的18批朝鮮白頭翁均由樸明杰采集，由吉林省藥品檢驗所中藥專家鑒定為基原正確藥材，烘干，備用。朝鮮白頭翁藥材樣本的采集信息分別見表1。

表1 朝鮮白頭翁藥材采集信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent 1200高效液相色譜儀；Thermo Hypersil BDS C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-水作為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫時間及比例見下表；流速0.8 mL·min-1，柱溫35 ℃，檢測波長201 nm。

表2 梯度洗脫時間表

2.2 對照品溶液的制備

分別取白頭翁皂苷H、常春藤皂苷C對照品適量，加50%乙醇制成每1 mL各含0.1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取適量朝鮮白頭翁藥材，粉碎，過3號篩，精密稱定，稱取1 g于具塞錐形瓶中，向其加入50%乙醇溶液50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一份“2.3”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄各共有峰的保留時間和峰面積，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD在0.1%～0.3%之間；相對峰面積比值的RSD在0.3%～0.6%之間，結(jié)果表明：儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.3”項下的供試品溶液分別于制備后0、4、8、12、18、24、48 h進樣，記錄各共有峰的保留時間和峰面積，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD在0.2%～0.3%之間；相對峰面積比值的RSD在0.3%～0.9%之間。結(jié)果表明，供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一批樣品分別制備6份供試品溶液，照“2.1”項下方法測定，記錄各共有峰的保留時間和峰面積，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD在0.2%～0.3%之間；相對峰面積比值的RSD在0.8%～1.6%之間，結(jié)果表明：此方法的重復性良好。

2.4.4 耐用性試驗

2.4.4.1 不同色譜柱對測定的影響 分別取“2.3”項下的供試品溶液，選用Apollo C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱、Diamonsil C18(4.6×250 mm，5 μm)、Venusil XDP C18(4.6×250 mm，5 μm)3根不同品牌的色譜柱，按“2.1”項下色譜條件進樣，均能達到系統(tǒng)適用性要求。

2.4.4.2 不同儀器對測定的影響 實驗選擇Agilent 1260高效液相色譜儀、島津LC-20A液相色譜儀和Waters E2695液相色譜儀，取“2.3”項下的供試品溶液分別進樣，進行比對分析，結(jié)果三種儀器所得圖譜均符合檢驗要求。表明，不同儀器對供試品色譜峰的影響不大。

2.5 特征圖譜的建立及檢驗結(jié)果的判斷

2.5.1 共有峰及參照峰的選擇 取上述18批次樣品，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣，記錄色譜圖?；旌蠈φ掌飞V圖見圖1，供試品色譜圖見圖2。通過對18批次朝鮮白頭翁樣品進行分析，確定其共有特征峰有20個，其中有2個色譜峰分別與相應的參照物峰保留時間相同，選取含量最高的常春藤皂苷C峰(16號峰)為S峰，分別計算各特征峰的相對保留時間，結(jié)果見表3。

2.5.2 特征圖譜結(jié)果分析 經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，朝鮮白頭翁特征圖譜的共有特征峰應為20個。將分析得到的18個樣品的色譜圖分別導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》，計算相似度。經(jīng)統(tǒng)計，在花期和果期的樣品相似度均較高，在95%以上；而于2015年7月份在安圖和龍井采的樣品，無花、無果的樣品，相似度較低，不到85%。由此可知，在花期和果期，朝鮮白頭翁中三萜皂苷類成分是穩(wěn)定的，非花、果期化學成分復雜，質(zhì)量難以保證，側(cè)面證明了采收的最佳時間應為果未落之前。其18批供試品的疊加圖譜見圖3。

注：16.常春藤皂苷C；17.白頭翁皂苷H圖1 對照品色譜圖

注：16.常春藤皂苷C；17.白頭翁皂苷H圖2 朝鮮白頭翁色譜圖

表3 18批朝鮮白頭翁樣品共有峰的相對保留時間

圖3 18批朝鮮白頭翁色譜圖共有模式

3 討論

3.1 提取溶劑和方法的考察

本實驗考察50%乙醇、80%乙醇、乙醇和甲醇等提取溶劑對朝鮮白頭翁進行提取，結(jié)果顯示，50%乙醇和甲醇提取所得到的色譜峰信息較多，而且，50%乙醇提取所得到的色譜峰較甲醇提取所得到的色譜峰分離度好，所以，最終選取50%乙醇作為朝鮮白頭翁的提取溶劑。

實驗中也考察了回流提取、超聲提取、索氏提取等提取方法，結(jié)果顯示，索氏提取和回流提取所得色譜峰的峰面積相差不大，超聲提取含量較低，且相差較大。因此，綜合考慮，最終選取回流提取作為提取方法。

3.2 檢測波長的選擇

在文獻報道中，白頭翁屬三萜皂苷研究資料中的檢測波長均為在201～210 nm之間[11-14]。為確定朝鮮白頭翁中三萜皂苷類的最佳檢測波長，按“2.3”項下確定的實驗方法，選用二極管陣列檢測器在201～210 nm進行掃描。實驗結(jié)果，在201 nm處朝鮮白頭翁特征圖譜顯示的色譜峰最多，色譜峰的峰高最高，確定為最佳檢測波長。

3.3 流動相的選擇

在中國藥典白頭翁的含量測定項中，提取三萜皂苷類成分的溶劑和流動相均采用了甲醇[15]，而甲醇在201 nm有末端吸收，必然會對特征圖譜的色譜行為有干擾。經(jīng)試驗，流動相由“甲醇-水”更改為“乙腈-水”，得到的色譜峰信息最多，且各成分分離情況相對較好，故最終選定乙腈-水系統(tǒng)作為流動相。

4 小結(jié)

中藥特征圖譜是一種多指標的質(zhì)量控制模式，雖然不能代替含量測定，但是能夠較全面的反映出藥材的整體特征。HPLC法由于具有分離效能高、分析速度快等優(yōu)點，近年來已廣泛地應用于中藥的定量分析中，在中藥的定性鑒別中也發(fā)揮著很好的作用。本文采用高效液相色譜法對不同采收期朝鮮白頭翁中所含的三萜皂苷類成分進行整體分析，不僅能夠反映出其所含單體皂苷的種類多少或有無，而且對于朝鮮白頭翁的鑒別、質(zhì)量標準的建立、資源開發(fā)及其臨床正確用藥提供了一定的實驗依據(jù)，具有重要意義。

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