UPLC測定彝藥滿山香中蘆丁含量△

郝慶秀，康利平，朱壽東，金艷，郭蘭萍

(中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心/道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700)

彝藥滿山香來源于木蘭科植物合蕊五味子的干燥藤莖和根，具有舒筋活血、消腫止痛的功能，用于治療骨折、慢性胃腸炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛經(jīng)、外傷出血等。以滿山香為主要原料的燈銀腦通膠囊用于中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)、瘀血阻絡(luò)的治療。目前，野生滿山香植物資源種群稀少，蘊藏量小[1]；在地方標準中，以根莖入藥，并且沒有質(zhì)量控制的指標成分[2]。在實際應(yīng)用中，制藥廠以收購藥農(nóng)采集的野生滿山香植物根莖為原料藥，砍伐后的葉片資源沒有被有效利用。目前，文獻報道中關(guān)注的是滿山香根莖中的木脂素類成分[3-6]。本課題組前期研究結(jié)果提示，彝藥滿山香富含蘆丁成分[7]。蘆丁被稱為Vitamin P，具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、降低血壓、保持血管彈性、神經(jīng)保護作用，能預(yù)防或治療糖尿病相關(guān)疾病[8-10]。目前未見對滿山香中蘆丁成分定量研究的報道。本實驗利用UPLC技術(shù)對滿山香根莖和葉片中的蘆丁含量進行測定，以期為彝藥滿山香資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)；同時，為擴大蘆丁的天然來源提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

滿山香樣品采集于云南、貴州，共13批，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院金艷助理研究員鑒定為木蘭科植物合蕊五味子Schisandrapropinqua(Wall.)Baill.，原植物標本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，樣品信息見表1。

表1 滿山香樣品信息

蘆丁對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號：12040302，純度≥98.0%)。色譜級乙腈、甲醇、甲酸(Merck公司，德國)；超純水為Milli-Q純水系統(tǒng)制備(電阻≥18.2 MΩ，Millipore 公司，美國)。

1.2 儀器

UPLC-H-CLASS，全波長紫外檢測器(PDA)(Waters公司，美國)，色譜柱為 Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司，美國)，分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)，離心機(Eppendorf公司，德國)，KQ-100DE超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，0.2 μm注射器式濾器(Pall公司，美國)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液及對照品溶液制備

樣品經(jīng)干燥、粉碎，過40目篩，準確稱取樣品粉末0.3 g，加70%甲醇水溶液(V/V)15 mL，超聲提取30 min，12 000 g離心10 min，取上清液經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，重復(fù)提取1次，合并濾液，作為供試品溶液。準確稱取對照品適量，用70%甲醇水溶解，定容 10 mL，備用。

2.2 實驗條件

2.2.1色譜條件 流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，按程序梯度洗脫(5∶95→95∶5，13 min)，柱溫：40 ℃，流速：500 μL·min-1，進樣量：1.0 μL。Acquity UPLC PDA 檢測器，波長范圍：190～400 nm。通過優(yōu)化色譜條件，發(fā)現(xiàn)蘆丁在365 nm處干擾少，吸光度強，選擇365 nm進行檢測分析。蘆丁對照品和滿山香樣品提取物的UPLC-PDA色譜分析結(jié)果見圖1。

注：A蘆丁對照品；B根莖提取物；C葉片提取物。圖1 滿山香提取物的UPLC-PDA圖

2.2.2定量下限考察 通過考察不同濃度和不同進樣量的對照品溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆丁的檢測下限為0.328 μg·mL-1，定量下限為1.64 μg·mL-1。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取2.10 mg 蘆丁對照品，置10 mL量瓶中，加70%甲醇水至刻度搖勻，制成對照品溶液Ⅰ(210 μg·mL-1)，吸取對照品溶液Ⅰ 5.0 mL稀釋定容到10 mL量瓶中，制成對照品溶液Ⅱ(105 μg·mL-1)，依次稀釋配成對照品溶液Ⅲ(52.5 μg·mL-1)、對照品溶液Ⅳ(26.25 μg·mL-1)、對照品溶液Ⅴ(13.125 μg·mL-1)、對照品溶液Ⅵ(6.562 5 μg·mL-1)、對照品溶液Ⅶ(3.281 25 μg·mL-1)、對照品溶液Ⅷ(1.640 25 μg·mL-1)，進樣1.0 μL，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積積分為縱坐標，蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果蘆丁在1.64～210 μg·mL-1具有良好的線性關(guān)系，計算得回歸方程：Y=340.3X-1 386.8，r=0.999 8。

2.2.4 精密度試驗 取同一對照品溶液，在所確定的HPLC條件下，連續(xù)進樣6次，分別記錄其峰面積，計算蘆丁峰面積的RSD=0.69%。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 準確稱取同一樣品粉末6份，按2.1制成供試品溶液，在所確定的UPLC條件下，分別于配制后0、1、3、5、8、12、16、20 h，測定蘆丁峰面積，RSD=1.03%，表明樣品至少在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗 準確稱取同一樣品粉末6份，按2.1制成供試品溶液，在所確定的HPLC條件下測定峰面積，RSD=1.58%。

2.2.7 加樣回收率試驗 準確稱取同一粉末樣品6份(1號根莖樣品)，分別添加兩份16.8 μg蘆丁對照品，兩份21.0 μg蘆丁對照品，兩份25.2 μg蘆丁對照品，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進樣量1.0 μL，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 滿山香藥材中蘆丁加樣回收率試驗

2.3 樣品含量測定

分別準確稱取各個滿山香樣品粉末0.3 g，按2.1制成供試品溶液，在所確定的UPLC條件下測定，結(jié)果見表3。

表3 滿山香藥材中蘆丁含量檢測結(jié)果

3 討論

在本實驗選定的條件下，對彝藥滿山香藥材中蘆丁含量進行了定量測定，經(jīng)方法學(xué)考察，方法準確可靠、簡便快速。從檢測結(jié)果看，不同產(chǎn)地滿山香的根莖中蘆丁質(zhì)量分數(shù)在30～187 μg·g-1，差異明顯。本研究所用根莖樣品的直徑從0.1 cm到4 cm不等，其中1號根莖樣品直徑最大，而蘆丁含量最低，據(jù)當?shù)厮庌r(nóng)估計，1號根莖的生長年限有40年左右，其他根莖的生長年限大約為2、3、5、10年不等。由于野生藥材的生長年限不易準確斷定，只能粗略地認為藥材直徑與藤莖的生長年限呈正相關(guān)關(guān)系。從本實驗結(jié)果看，蘆丁成分的含量與藥材的年限呈負相關(guān)關(guān)系。年限和產(chǎn)地差異對藥材的影響有待進一步研究。

不同產(chǎn)地滿山香的葉片中蘆丁含量在4.2～13.6 mg·g-1。葉片中蘆丁的含量均比較高，并且比對應(yīng)的根莖藥材中高出數(shù)十倍、甚至數(shù)百倍，某些地區(qū)滿山香葉片中蘆丁含量達1.36%。滿山香葉片有開發(fā)利用價值，建議開展?jié)M山香葉片的應(yīng)用研究，避免根莖藥材采集時廢棄大量的葉片而造成自然資源的浪費。本研究為彝藥滿山香資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)，同時為擴大蘆丁的天然來源提供了參考。

[1] 郝慶秀，劉超，金艷，等.彝藥滿山香的資源調(diào)查和鑒別研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17(7)：698-703.

[2] 云南省衛(wèi)生廳.云南藥品標準[M].昆明：云南大學(xué)出版社，1996：120.

[3] 陳業(yè)高，秦國偉，謝毓元.滿山香木脂素成分的研究[J].中藥材，2001，24(2)：105-107.

[4] 陳業(yè)高，秦國偉，謝毓元.滿山香中的聯(lián)苯環(huán)辛二烯木脂素[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，2001，22(9)：1518-1521.

[5] 李洪梅.兩種五味子屬藥用植物的化學(xué)成分和生物活性研究[D].昆明：昆明理工大學(xué)，2008.

[6] 吳彤，李燕，孔德云，等.藤香樹莖藤的化學(xué)成分[J].中國藥學(xué)雜志，2010，45(12)：902-905.

[7] 郝慶秀，康利平，朱壽東，等.基于UPLC-Q/Tof MSE技術(shù)的彝藥滿山香的化學(xué)成分鑒別研究[J].中國中藥雜志，2017，42(21)：4234-4245.

[8] Ganeshpurkar A，Saluja A K.The Pharmacological potential of rutin[J].J Saudi Pharm，2017，25(2)：149-164.

[9] Budzynska B，F(xiàn)aggio C，Kruk-Slomka M，et al.Rutin as neuroprotective agent：from bench to bedside[J].J Curr Med Chem，2017，24：1-12.

[10] Ghorbani A.Mechanisms of antidiabetic effects of flavonoid rutin[J].J Biomed Pharmacother，2017，96：305-312.