桃葉鴉蔥黃酮對腦缺血再灌注大鼠的保護作用△

許麗娟，韻磊，楊輝

(1.張家口市第四醫(yī)院 藥劑科，河北 張家口 075000；2.中國人民解放軍第251醫(yī)院，河北 張家口 075000；3.河北北方學院 藥學系，河北 張家口 075000)

桃葉鴉蔥是菊科舌狀花亞科鴉蔥屬植物桃葉鴉蔥ScorzoneraSinensisLipsch的干燥全草，廣泛分布于我國北方各省，為我國重要的藥食兩用植物，資源豐富，但目前對其開發(fā)利用幾乎為空白。在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)桃葉鴉蔥提取物具有多種生物活性[1-3]。對其化學成分的研究發(fā)現(xiàn)，桃葉鴉蔥中含有黃酮、多糖及鞣質(zhì)等多種成分[4-6]。Paraschos等[7]從鴉蔥屬植物中分離出化合物6，8-dihydroxy-3-(4-methoxyphenyl)isochroman-1-one(1)，8-O-β-D-glucopyranosylscorzocreticin(2)及8-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl](3)，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 鴉蔥屬植物中化學成分結(jié)構(gòu)

高敬宇[8]也從鴉蔥屬植物中獲得5，7，3′，4′-tetrahydroxy-flavone 8-C-β-D-glucopyranoside、5，7，3′，4′-tetrahydroxy-flavone 6-C-β-D-glucopyranoside、5，7，4′-trihydroxy-flavone 6-C-β-D-xylofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside 3種黃酮苷。由于黃酮結(jié)構(gòu)中具有多個酚羥基，所以黃酮類化合物應該有較強的抗氧化活性。

近些年來，腦缺血再灌注損傷對人類的威脅越來越嚴重，學者們對其發(fā)病機制及治療方法進行了較多的研究。目前認為，脂質(zhì)過氧化是腦缺血再灌注損傷眾多致病因子中重要的損傷機制之一[9]。而尋找安全有效的具有抗氧化活性的藥物是對抗腦缺血再灌注損傷的重要方法之一。

基于以上現(xiàn)狀，我們設想桃葉鴉蔥黃酮可能對腦缺血再灌注具有一定保護作用。本實驗參照文獻方法對桃葉鴉蔥總黃酮進行提取[4]，以尼莫地平為陽性對照藥品，觀察桃葉鴉蔥總黃酮對腦缺血再灌注損傷的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)，8～10周齡，體質(zhì)量(290±10)g，河北北方學院動物室提供，置于河北北方學院藥學系實驗室飼養(yǎng)房內(nèi)飼養(yǎng)1周后用于實驗。室溫(20±2)℃，濕度(50±5)%。每日清潔1次墊料，期間自由進食普通鼠飼料，飲用自來水。

1.2 儀器

XTS-4A手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江中天光學儀器有限責任公司)，腦切片模具(300～600 g大鼠，北京西濃科技有限公司)，Heraeus SEPATECH Biofuge 15R低溫生物離心機(美國賽默飛公司)，萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，MENLAB-U/4C501H生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)，Nikon Eclipse 80i光學顯微鏡(日本尼康)，MODEL 680 型酶標儀(美國BIO-RAP 公司)，AX-II X射線攝影暗盒(廣東奧華醫(yī)療器械廠)。

1.3 藥品與試劑

桃葉鴉蔥采自河北張家口市崇禮區(qū)，由河北北方學院中醫(yī)學院李永明教授鑒定為桃葉鴉蔥Scorzo-nerasinensisLipsch全草；尼莫地平片(30 mg/片，黑龍江省地納制藥有限公司，批號：170702)制成混懸液；Anti-AQP4(H-80)(美國SANTA CRUZ 公司，貨號：sc-20812)；蘇木素(北京康為世紀生物科技有限公司，貨號：CW0127)；二氨基聯(lián)苯胺(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZLI-9018)；伊紅染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZLI-9613)；多聚甲醛(安徽欣樂生物技術(shù)有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗用水為三重蒸餾水。

2 方法

2.1 供試液的制備

取桃葉鴉蔥全草適量，于60 ℃恒溫干燥90 min，采用文獻方法提取總黃酮(TFSSL)[4]，總黃酮的含量為0.92%，加適量0.9%氯化鈉溶液，制備成質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1的混懸液。

2.2 實驗分組與給藥

取清潔級雄性健康SD大鼠72只，隨機分為6組，每組12只，即假手術(shù)組，模型組，桃葉鴉蔥總黃酮高、中、低劑量(400、200、100 mg·kg-1)組，尼莫地平(nimodipine，10.8 mg·kg-1)陽性對照組。造模后，各組每天上午9時灌胃給藥1次，連續(xù)給藥 20 d，模型對照組和假手術(shù)組灌胃給等體積0.9%氯化鈉溶液。

2.3 大鼠腦缺血再灌注模型的制備

用改良 Longa栓線法制備大腦中動脈閉塞(MCAO)模型[10-12]。假手術(shù)組除插入線栓外，其他操作與模型制備相同。模型成功的判斷標準：清醒后動物出現(xiàn)前肢彎曲，肩內(nèi)旋，以對側(cè)上肢為重的癱瘓，并伴有同側(cè)頸交感神經(jīng)麻痹綜合征陽性。不成功者剔除。造模2 h后，將拴線抽出頸內(nèi)動脈，實現(xiàn)再灌注。

2.4 指標測定

2.4.1神經(jīng)功能損傷評分 各組于末次給藥后24 h，以Zea Longa 5 級評分法為標準對其進行神經(jīng)功能損傷評分[10]。

2.4.2桃葉鴉蔥總黃酮對腦缺血-再灌注大鼠腦含水量的影響 于末次給藥后24 h，每組隨機取4只大鼠，處死后，快速斷頭取腦，濾紙吸去表面水分，取缺血側(cè)半邊大腦，稱質(zhì)量，然后于110 ℃干燥至恒質(zhì)量，按公式(1)計算腦含水量[13]。

(1)

2.4.3免疫組織化學實驗

2.4.3.1取材及組織處理 于末次給藥后24 h，每組取剩余8只大鼠，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)麻醉，依照文獻方法取腦[14]，取腦組織視交叉前后2 mm厚的中段腦組織，于4%多聚甲醛(4 ℃)中，固定一周，乙醇梯度脫水，二甲苯透明、浸蠟、常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，每片厚度為5 μm，烤干后備用。

2.4.3.2蘇木素-伊紅(HE)法檢測腦組織病理形態(tài) 每組隨機選取4張切片，參照文獻方法[15]，切片經(jīng)二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)脫蠟15 min，經(jīng)二甲苯+無水乙醇(1∶1)1 min，無水乙醇(Ⅰ、Ⅱ)、95%乙醇(Ⅰ、Ⅱ)和90%乙醇各5 min，經(jīng)80%、70%、50%乙醇和蒸餾水各2 min，蘇木精染色3 min，經(jīng)1%鹽酸乙醇分色2 min，于自來水藍化5 min，蒸餾水稍洗，經(jīng)50%，70%、80%、90%乙醇各2 min，通過伊紅染液10 s，經(jīng)95%乙醇(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)、無水乙醇(Ⅰ、Ⅱ)各2 min，二甲苯+無水乙醇(1∶1)1 min，最后經(jīng)二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)透明處理10 min，用中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察腦組織病理形態(tài)學改變，并在高倍鏡(400×)下采取盲法對海馬CA1 區(qū)(海馬腹側(cè)面，通過海馬溝與齒狀回相接界處)[16]的錐體細胞進行計數(shù)，在一張切片上取兩個連續(xù)的視野計數(shù)，以二者的平均值代表該切片的錐體細胞計數(shù)，最后取4張切片的平均值作為該組別的錐體細胞計數(shù)[17]。

2.4.3.3檢測AQP4 每組隨機選取3張切片，參照王海征等[18]的實驗方法采用二步法免疫組化法進行染色。用0.1 mol·L-1的EDTA緩沖液(pH 9.0)進行微波抗原修復20 min，每片滴加一抗50 μL，4 ℃孵育40 h，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗。每片滴加二抗Ⅰ50 μL，37 ℃孵育0.5 h，PBS沖洗，然后每片滴加二抗Ⅱ50 μL，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗，最后DAB顯色10 min，蒸餾水洗滌終止，蘇木素染細胞核5 min，蒸餾水洗滌終止，顯色后脫水，透明，封片。利用光學顯微鏡聯(lián)合數(shù)字顯微照相機，分別采集各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)5個視野的圖像，通過NIS-Elements Basic Research圖像分析軟件計算出各視野下陽性表達AQP4的積分光密度，用以反映AQP4的免疫染色強度。

2.5 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能損傷評分

首先去除昏迷不醒者，具體的評分標準：0分代表神經(jīng)癥狀不明顯；1分代表缺血對側(cè)前肢伸展不全；2分代表向缺血對側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分代表行走時肢體向缺血對側(cè)傾斜；4分代表完全無法獨立行走。結(jié)果見表1。假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，而其他組大鼠均出現(xiàn)了右側(cè)前肢伸展不全、行走不穩(wěn)、向右側(cè)傾斜，嚴重者無法獨立行走等輕重程度不一的神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能損傷評分顯著升高(P<0.01)，即缺血再灌注能導致大鼠出現(xiàn)顯著的神經(jīng)功能損傷。與模型組比較，尼莫地平組及桃葉鴉蔥總黃酮高、中劑量組大鼠神經(jīng)功能損傷評分均顯著降低，即尼莫地平及桃葉鴉蔥總黃酮高、中劑量均能減輕大鼠神經(jīng)功能損傷(P<0.05)。

表1 桃葉鴉蔥總黃酮對腦缺血-再灌注大鼠神經(jīng)癥狀評分的影響

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；下同。

3.2 桃葉鴉蔥總黃酮對腦缺血-再灌注大鼠腦含水量的影響

表2結(jié)果顯示，與假手術(shù)比較，模型組大鼠腦含水量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，桃葉鴉蔥總黃酮高、中劑量組和尼莫地平組大鼠腦含水量顯著降低(P<0.05)，低劑量組大鼠腦含水量較模型組低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明連續(xù)給藥20 d后，桃葉鴉蔥總黃酮高、中劑量組能有效抑制腦含水量的增加。

表2 桃葉鴉蔥總黃酮對缺血再灌注大鼠腦含水量的影響

3.3 免疫組化實驗

3.3.1 HE法檢測腦組織病理形態(tài) 圖1的HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元排列緊湊整齊，胞核染色清晰；血管內(nèi)皮細胞間相連緊密，形態(tài)完整，管周組織未見異常改變；海馬CA1區(qū)錐體細胞排列規(guī)整，胞核居于胞體中央，且可見1～2個清晰核仁。模型組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)嚴重破壞，大量神經(jīng)元細胞變性壞死，原有的整齊排列被破壞，細胞核形態(tài)模糊，胞體皺縮，細胞間質(zhì)疏松，膠質(zhì)細胞增生明顯；海馬CA1區(qū)錐體細胞體積變小，錐體細胞數(shù)較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，桃葉鴉蔥總黃酮中、高劑量組、尼莫地平組大鼠變性壞死組織范圍縮小、程度減輕，海馬CA1區(qū)錐體細胞排列規(guī)則，神經(jīng)元脫失不明顯，桃葉鴉蔥總黃酮中、高劑量組及尼莫地平組大鼠錐體細胞數(shù)較模型組明顯增加(P<0.05)，結(jié)果見表3。

注：A.假手術(shù)組(400×)；B.模型組(400×)；C.桃葉鴉蔥總黃酮低劑量組(400×)；D.桃葉鴉蔥總黃酮中劑量組；E.桃葉鴉蔥總黃酮高劑量組(400×)；F.尼莫地平組(400×)。圖1 桃葉鴉蔥總黃酮對腦缺血-再灌注大鼠海馬CA1 區(qū)病理損傷的影響(HE 染色)

表3 桃葉鴉蔥總黃酮對腦缺血-再灌注大鼠海馬CA1椎體細胞數(shù)的影響

3.3.2 AQP4檢測 表4、圖2結(jié)果顯示，AQP4 陽性表達主要集中在大鼠腦膜等處的膠質(zhì)界膜上及毛細血管壁周圍的星形膠質(zhì)細胞的胞膜上和胞漿中，呈現(xiàn)出黃色細顆粒。腦缺血再灌注24 h，模型組大鼠海馬區(qū) AQP4 表達明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)；桃葉鴉蔥總黃酮中、高劑量組及尼莫地平組大鼠 AQP4 表達均明顯低于模型組(P<0.05)。

表4 桃葉鴉蔥總黃酮對腦缺血-再灌注大鼠海馬區(qū)AQP4表達的影響

4 討論

近年來，黃酮類化合物的生物活性已經(jīng)成為人們研究的熱點問題之一，越來越多的研究證實，不同植物體內(nèi)提取的黃酮類化合物均通過不同的機制表現(xiàn)出極強的腦缺血保護作用。

葛根素是由豆科植物中提取的異黃酮碳苷類成分，目前已有注射劑上市，研究表明，葛根素通過對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元保護作用[19]，抑制Janus激酶2(JAK2)及信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3(JAK2/STAT3)信號通路的異常激活[20]、抗炎[21]等多種機制對腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。黃芩苷和黃芩素主要是從黃芩根部提取的黃酮類化合物，可能通過抑制腦缺血后興奮性氨基酸含量的增加而發(fā)揮其腦保護作用[22]。柚皮素屬于二氫黃酮類化合物，柚皮苷的苷元，在柑橘類等水果中含量較多，通過抗氧化改變腦缺血后腦組織中核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體2(NOD2)、受體相互作用蛋白2(RIP2)、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)、金屬蛋白酶9(MMP-9)及緊密連接蛋白-5抗體(claudin-5)等蛋白的表達[23-24]，產(chǎn)生神經(jīng)保護的作用。

腦水腫是腦缺血再灌注的一個嚴重的繼發(fā)性損傷，可以引起顱內(nèi)壓力短時間內(nèi)急劇升高，嚴重者可危及生命[25]，當腦組織在病理情況下發(fā)生缺血缺氧時，大量興奮性氨基酸積累于細胞外，導致大量鈣離子內(nèi)流，從而生成大量自由基，導致細胞凋亡或壞死，進一步引發(fā)血腦屏障破壞，血管通透性增加，導致血管源性腦水腫[26]。

注：A.假手術(shù)組(400×)；B.模型組(400×)；C.桃葉鴉蔥總黃酮低劑量組(400×)；D.桃葉鴉蔥總黃酮中劑量組；E.桃葉鴉蔥總黃酮高劑量組(400×)；F.尼莫地平組(400×)。圖2 桃葉鴉蔥總黃酮對腦缺血-再灌注大鼠海馬區(qū)AQP4表達的影響(免疫組化染色)

AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為重要的水通道蛋白，它在腦內(nèi)的分布非常廣泛，位于海馬區(qū)的AQP4主要功能為調(diào)控細胞間隙的大小，以及調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性[27-29]。Aoki等[30]對AQP4表達的研究發(fā)現(xiàn)，在人類缺血性腦卒中發(fā)生后，AQP4在腦組織中表達水平顯著升高，且在缺血中心的梗死灶周邊表達最強。本實驗結(jié)果表明，桃葉鴉蔥總黃酮對大鼠腦缺血再灌注所致腦水腫的抑制作用與其對AQP4表達的抑制作用有關(guān)，抑制腦水腫的發(fā)生發(fā)展應該是桃葉鴉蔥總黃酮對腦缺血再灌注的保護的機制之一。

本實驗結(jié)果表明，桃葉鴉蔥總黃酮可引起腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)AQP4的表達下調(diào)，抑制腦含水量的增加，降低腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)癥狀評分，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

[1] 楊輝，李秀榮.桃葉鴉蔥抗抑郁作用的實驗研究[J].中成藥，2011，33(9)：1588-1589.

[2] 孫雪，楊輝.桃葉鴉蔥對小鼠抗應激能力的影響[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2014，28(2)：31-32.

[3] 曾春萍.桃葉鴉蔥抗炎鎮(zhèn)痛作用的實驗研究[J].天津中醫(yī)藥，2010，27(6)：515-517.

[4] 楊輝，王治寶.桃葉鴉蔥根中總黃酮的提取工藝[J].食品研究與開發(fā)，2015，36(5)：35-37.

[5] 楊輝，李秀榮.不同產(chǎn)地桃葉鴉蔥多糖的含量測定[J].河南工業(yè)大學學報(自然科學版)，2010，31(5)：59-61.

[6] 楊輝，王治寶.桃葉鴉蔥鞣質(zhì)的提取及體外抗氧化作用[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(18)：244-246.

[7] Paraschos S，Magiatis P，Kalpoutzakis E，et al.Three new dihydroisocoumarins from the Greek endemic species Scorzonera cretica[J].Nat Prod，2001，64：1585-1587.

[8] 高敬宇.鴉蔥總黃酮純化方法及HPLC指紋圖譜的研究[D].長春：吉林大學，2015.

[9] 李蕾，許棟明，王文，等.莫諾苷抑制大鼠腦缺血再灌注模型皮層脂質(zhì)過氧化作用的研究[J].中國康復理論與實踐，2009，15(11)：1015-1016.

[10] Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20：84-91.

[11] Liang G J，Shi B，Luo W N，et al.The protective effect of caffeic acid on global cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].Behavioral and Brain Functions，2015，11(1)：1-10.

[12] Guo C，Tong L，Xi M M，et al.Neuroprotective effect of calycosin on cerebral ischemia and reperfusion injury in rats[J].J Ethnopharmacol，2012，144：768-774.

[13] 葉建新，林航，穆軍山，等.高壓氧治療對血管性癡呆大鼠學習記憶能力及海馬錐體細胞的影響[J].中國康復理論與實踐，2007，13(11)：1032-1033.

[14] 康康，冀書娟，梅海云.通絡救腦注射液對大鼠腦缺血/再灌注神經(jīng)保護作用的研究[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志，2016，19(5)：57-59.

[15] 韓天龍，王敏，紅敏，等.Masson三色染色與HE染色在豚鼠牙齒組織石蠟切片中的比較研究及應用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(3)：55-57.

[16] 孫曉彩，李力，張敏，等.Wistar大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回區(qū)的解剖分割[J].中國應用生理學雜志，2012，28(2)：189-192.

[17] Gibson G E，Blass J P，Beal M F，et al.the alpha ketoglutarate dehydrogenase complex：a mediator between mitochondria and oxidative stress in neurodegeneration[J].Mol Neurobiol，2005，31(1/3)：43-63.

[18] 王海征，趙暉，張弛，等.風藥、補虛藥對腦缺血大鼠側(cè)腦室GFAP、AQP-4 表達的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2013，36(10)：676-679.

[19] 尹雪莉，桂麗，李珍.葛根素預處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷的影響及其機制[J].安徽醫(yī)科大學學報，2015，50(6)：723-726.

[20] 陳媛，黃曉松，吳海金，等.葛根素對大鼠腦缺血再灌注損傷后JAK2/STAT3信號通路的影響[J].湖南中醫(yī)雜志，2017，33(4)：144-147，165.

[21] 竇思奇，江培.葛根素對腦缺血再灌注損傷的抗炎作用[J].黑龍江科技信息，2014(36)：74.

[22] 呂有文，張鵬，侯霞，等.黃芩素甙對腦缺血后大鼠海馬組織興奮性氨基酸含量的影響[J].實用臨床醫(yī)學，2009，10(7)：1-3.

[23] 王凱華.基于線粒體功能失調(diào)與Nrf2介導的抗氧化應激探索柚皮素對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2017.

[24] 白雪.柚皮素對永久性腦缺血大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制：下調(diào)NOD2，RIP2，NF-κB，MMP-9的表達，上調(diào)Claudin-5的表達[C]//中國中西醫(yī)結(jié)合學會神經(jīng)科專業(yè)委員會.第十一次中國中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)科學術(shù)會議論文匯編.北京：中國中西醫(yī)結(jié)合學會神經(jīng)科專業(yè)委員會，2015：2.

[25] Lee J H，Cui H S，Shin S K，et al.Effect of propofol post-treatment on blood-brain barrier integrity and cerebral edema after transient cerebral ischemia in rats[J].Neurochemical Research，2013，38(11)：2276-2286.

[26] 黃如訓，蘇鎮(zhèn)培.腦卒中[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:117-128.

[27] 劉健鋒，丁艷平，王建林，等.腦水通道蛋白的分布、功能及調(diào)控機制[J].中國組織工程研究，2014，18(2)：314-321.

[28] 李勝，屈春鳳，李潤水，等.水牛水通道蛋白8基因克隆及表達分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41(3)：44-48.

[29] 屈春鳳，李勝，李卉，等.水牛水通道蛋白9基因克隆及其表達分析[J].中國畜牧獸醫(yī).2015，42(7)：1621-1629.

[30] Aoki K，Uchihara T，Tsuchiya K，et al.Enchanced expression of aquaporin4 in human brain with infarction[J].Acta Neuro Pathologica，2003，106(2)：121-124.