利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)金絲桃苷治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制△

劉馳，袁宇，趙文婷，胡麗萍

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847)

中藥是一個(gè)高度復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)體系，其復(fù)雜性表現(xiàn)為化學(xué)成分的復(fù)雜，以及與人體相互作用關(guān)系的復(fù)雜。中藥研究者通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)機(jī)制探索中藥的藥效作用。但迄今為止，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究尚無(wú)根本性突破，原因是缺乏對(duì)中藥高度復(fù)雜性及系統(tǒng)性進(jìn)行研究的手段，如何揭示并系統(tǒng)闡明中藥化學(xué)物質(zhì)組成與藥效間的復(fù)雜關(guān)系，是中藥新藥研發(fā)的熱點(diǎn)和關(guān)鍵[1]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)快速發(fā)展的基礎(chǔ)上提出的藥物設(shè)計(jì)新方法和新策略，它基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)，通過(guò)分析基因網(wǎng)絡(luò)庫(kù)、蛋白網(wǎng)絡(luò)庫(kù)、疾病網(wǎng)絡(luò)庫(kù)、藥物網(wǎng)絡(luò)庫(kù)等現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)的信息資料，結(jié)合從實(shí)驗(yàn)中獲得的譜圖數(shù)據(jù)，利用專業(yè)網(wǎng)絡(luò)分析軟件及算法，系統(tǒng)的、整體的揭示疾病-疾病、疾病表型-靶點(diǎn)蛋白、靶點(diǎn)蛋白-藥物、藥物-藥物之間的聯(lián)系[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為中藥成分-靶點(diǎn)-疾病-機(jī)制的研究提供了新的方法。

山楂作為常用中藥材，臨床上應(yīng)用廣泛，其藥理作用主要包括調(diào)節(jié)血脂、助消化、保肝、降血壓、抗氧化、抗腫瘤等[3]。有實(shí)驗(yàn)證明，山楂的降血脂作用顯著，并對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)有治療作用[4-5]。然而山楂(果肉、核及葉)所含化學(xué)成分較多，目前為止從山楂中發(fā)現(xiàn)且分離得到的物質(zhì)有150多種，包括黃酮及其苷、有機(jī)酸、黃烷及其聚合物等[6]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，山楂黃酮是降血脂的主要成分，而金絲桃苷(Hyperin，Hyperoside，Hyp)是山楂黃酮的主要組分之一，可能對(duì)于治療高血脂癥，阻止血管動(dòng)脈粥樣硬化的形成具有重要的意義[7]。

目前，對(duì)Hyp治療AS的作用靶點(diǎn)及其分子機(jī)制相關(guān)研究較少，需要進(jìn)一步挖掘和整合，因此本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病-通路”相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)Hyp治療AS的作用靶點(diǎn)及其作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考性依據(jù)。

1 材料

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)；Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.uniprot.org/)；GAD數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//geneticassociationdb.nih.gov/)；DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/)；Cytoscape-v3.2.1。

2 方法

2.1 Hyp相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)是西北農(nóng)林科技大學(xué)研究開(kāi)發(fā)的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含499味草藥以及每味草藥的化合物成分，針對(duì)每個(gè)化合物提供了較全面的人體吸收、分布、代謝和排泄性質(zhì)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，同時(shí)提供了潛在活性分子的靶點(diǎn)及疾病信息，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢Hyp作用靶點(diǎn)，檢索得到Hyp相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名稱。全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot是一個(gè)集中收錄蛋白質(zhì)資源并能與其他資源相互聯(lián)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，也是收錄蛋白質(zhì)序列目錄最廣泛、功能注釋最全面的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)換成相對(duì)應(yīng)的基因名稱并去除非人源的靶點(diǎn)基因名稱，為后期PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治鲎鰷?zhǔn)備。

2.2 AS相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

GAD數(shù)據(jù)庫(kù)由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院開(kāi)發(fā)和維護(hù)，數(shù)據(jù)庫(kù)的信息以基因?yàn)楹诵模С衷诰€查詢某種特定疾病相關(guān)的基因或某個(gè)基因相關(guān)的疾病信息。首先對(duì)整個(gè)GAD數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行下載，然后查詢AS作用靶點(diǎn)，剔除重復(fù)項(xiàng)后直接得到AS相關(guān)靶點(diǎn)基因名稱。

2.3 Hyp靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將準(zhǔn)備好的Hyp作用靶點(diǎn)的基因名稱導(dǎo)入Cytoscape-v3.2.1軟件，繪制Hyp作用靶點(diǎn)與靶點(diǎn)相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。具體操作步驟：1)打開(kāi)Cytoscape-v3.2.1軟件中的Bisogenet插件，將Hyp作用靶點(diǎn)基因名稱導(dǎo)入Input Identifiers。2)參數(shù)設(shè)置。導(dǎo)入基因名后可見(jiàn)“Network building options”，“Network building options”下面包括4個(gè)按鈕，分別為“Identifiers”、“Data Settings”、“Method”和“Output”。首先，點(diǎn)擊“Identifiers”可見(jiàn)選項(xiàng)“Organism”和“Map Input identifiers list to”，在“Organism”中選擇“Homo sapiens(Human)”，在“Map Input identifiers list to”選擇“Gene identifiers only”。其次，點(diǎn)擊“Data Settings”可見(jiàn)“BioRelation Types”下面“Protein protein Interaction”選項(xiàng)，打開(kāi)“Protein protein Interaction”后可在“Data Sources”選項(xiàng)下進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)選擇，最終選擇“BIOGRID”數(shù)據(jù)庫(kù)。最后，“Method”和“Output”按鈕中內(nèi)容為默認(rèn)選項(xiàng)，可以不做處理。3)點(diǎn)擊Submit進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2.4 AS靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將準(zhǔn)備好的AS作用靶點(diǎn)的基因名稱導(dǎo)入Cytoscape-v3.2.1軟件，繪制AS作用靶點(diǎn)與靶點(diǎn)相關(guān)的蛋白的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。具體操作步驟：1)打開(kāi)Cytoscape-v3.2.1軟件中的Bisogenet插件，將AS作用靶點(diǎn)基因名稱導(dǎo)入Input Identifiers。2)參數(shù)設(shè)置。導(dǎo)入基因名后可見(jiàn)“Network building options”，“Network building options”下面包括4個(gè)按鈕，分別為“Identifiers”、“Data Settings”、“Method”和“Output”。首先，點(diǎn)擊“Identifiers”可見(jiàn)選項(xiàng)“Organism”和“Map Input identifiers list to”，在“Organism”中選擇“Homo sapiens(Human)”，在“Map Input identifiers list to”選擇“Gene identifiers only”。其次，點(diǎn)擊“Data Settings”可見(jiàn)“BioRelation Types”下面“Protein protein Interaction”選項(xiàng)，打開(kāi)“Protein protein Interaction”后可在“Data Sources”選項(xiàng)下進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)選擇，最終選擇“BIOGRID”數(shù)據(jù)庫(kù)。最后，“Method”和“Output”按鈕中內(nèi)容為默認(rèn)選項(xiàng)，可以不做處理。3)點(diǎn)擊Submit進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治龊秃诵陌悬c(diǎn)的篩選

首先，通過(guò)Hyp靶點(diǎn)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)和AS靶點(diǎn)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建交集網(wǎng)絡(luò)。其次，使用Cytoscape-v3.2.1軟件中CytoNCA插件對(duì)新建立的交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，操作步驟：1)選擇“Tool”后下拉菜單選擇“NetworkAnalyzer”，接著在“NetworkAnalyzer”的子菜單中選擇“Network Analysis”，然后在“Network Analysis”的子菜單中選擇“Analyze Network”。2)除Degree(DC)和Select All Centralities外，勾選其他選項(xiàng)進(jìn)行分析。3)選擇“File”后下拉菜單選擇“exprot”，接著在“exprot”的子菜單中選擇“table”，在“table”的子菜單中選擇“Export Table”，然后在“Export Table”的子菜單中選擇“Merged Network defaul node”導(dǎo)出拓?fù)鋽?shù)據(jù)。4)根據(jù)導(dǎo)出的拓?fù)鋽?shù)據(jù)計(jì)算Degree的中位數(shù)。最后，用Degree值篩選核心靶點(diǎn)。篩選條件參數(shù)設(shè)置：①點(diǎn)擊“Select”按鈕選擇“+”，接著選擇“column fliter”下拉菜單中的“Node：Degree”可以進(jìn)行Degree值范圍設(shè)置。②對(duì)Degree值范圍的界定，上限為拓?fù)鋽?shù)據(jù)中Degree的最大值，下限為Degree的中位數(shù)的兩倍。

2.6 對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析。設(shè)置參數(shù)，1)Upload：Step 1-輸入核心靶點(diǎn)基因名稱，Step 2-official genesymbol，Step 3-Gene List，Step 4-Submit List。2)List：Homo sapiens-Select Species。3)Background：Homo sapiens-use。參數(shù)設(shè)置完成后得到Gene_Ontology(GO注釋分析)和Pathways(KEGG通路分析)數(shù)據(jù)，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，篩選條件符合P<0.05和P<0.01。

3 結(jié)果

3.1 Hyp靶點(diǎn)信息及PPI網(wǎng)絡(luò)圖

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到Hyp靶點(diǎn)蛋白質(zhì)9個(gè)，剔除非人源靶點(diǎn)后最終得到8個(gè)靶點(diǎn)蛋白質(zhì)，將8個(gè)靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)化成8個(gè)靶點(diǎn)基因名稱，靶點(diǎn)相關(guān)信息見(jiàn)表1。將8個(gè)靶點(diǎn)基因名稱導(dǎo)入Cytoscape-v3.2.1軟件，生成Hyp靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示與Hyp相關(guān)的節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)278個(gè)，邊緣蛋白質(zhì)2308個(gè)，Hyp的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖1。

表1 金絲桃苷相關(guān)靶點(diǎn)信息

3.2 AS靶點(diǎn)信息及PPI網(wǎng)絡(luò)圖

通過(guò)GAD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到AS靶點(diǎn)基因172個(gè)，靶點(diǎn)基因信息見(jiàn)圖2。將172個(gè)靶點(diǎn)基因名稱導(dǎo)入Cytoscape-v3.2.1軟件，生成AS靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示與AS相關(guān)節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)1851個(gè)，邊緣蛋白質(zhì)25 980個(gè)，AS的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖3。

3.3 核心靶點(diǎn)信息

建立Hyp的PPI網(wǎng)絡(luò)和AS的PPI網(wǎng)絡(luò)的交集網(wǎng)絡(luò)后，可以得到93個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)和676個(gè)邊緣蛋白質(zhì)構(gòu)成的交集網(wǎng)絡(luò)圖，交集網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖4。對(duì)交集網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)鋽?shù)據(jù)中Degree值進(jìn)行排序，得到Degree最大值為57，計(jì)算所得Degree值中位數(shù)為13，將核心靶點(diǎn)篩選條件范圍設(shè)置為26～57，最終篩選結(jié)果得到10個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)，具體核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)信息見(jiàn)圖5。

注：靶點(diǎn)；靶點(diǎn)相關(guān)節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)。圖1 金絲桃苷PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)信息

圖3 動(dòng)脈粥樣硬化PPI網(wǎng)絡(luò)圖

注：表示Degree值由小到大。圖4 金絲桃苷PPI網(wǎng)絡(luò)和動(dòng)脈粥樣硬化PPI網(wǎng)絡(luò)的交集網(wǎng)絡(luò)

圖5 核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)

3.4 核心靶點(diǎn)的GO注釋分析和KEGG通路分析結(jié)果可視化

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析，GO注釋分析結(jié)果顯示有9個(gè)基因有注釋數(shù)據(jù)，42個(gè)生物過(guò)程中有富集，設(shè)置篩選條件后，符合P<0.05的生物過(guò)程有29個(gè)，符合P<0.01的生物過(guò)程有12個(gè)，GO注釋分析信息見(jiàn)圖6。KEGG通路分析結(jié)果顯示有9個(gè)基因有注釋數(shù)據(jù)，17條通路有富集，設(shè)置篩選條件后，符合P<0.05的通路有7條，符合P<0.01的信號(hào)通路有4條，KEGG通路分析信息見(jiàn)圖7。在GO注釋分析和KEGG通路分析中都有富集的是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路。

圖6 金絲桃苷治療動(dòng)脈粥樣硬化的GO注釋分析

圖7 金絲桃苷治療動(dòng)脈粥樣硬化的KEGG通路分析

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致冠心病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。早在18世紀(jì)中葉病理學(xué)家發(fā)現(xiàn)50%～70%的急性心肌梗死患者冠狀動(dòng)脈固定狹窄<50%。1910年Osler認(rèn)為，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，任何用力均可引起心肌缺血。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)，目前認(rèn)為可能是多種發(fā)病機(jī)制共同作用的結(jié)果，涉及復(fù)雜和龐大的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，包括血管損傷、炎癥、凋亡、細(xì)胞增殖和氧化應(yīng)激等[8]。

我們前期實(shí)驗(yàn)證明山楂總黃酮在降血脂和心肌缺血保護(hù)方面發(fā)揮重要的作用。金絲桃苷又名槲皮素-3-O-β-D吡喃半乳糖苷，是山楂中的主要化學(xué)成分之一，屬于黃酮醇類化合物，目前最突出的藥理活性是抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡、抗血栓和抗炎[9-10]。因此探索金絲桃苷對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)作用具有重要意義。

為了找到Hyp作用于AS的關(guān)鍵分子或調(diào)節(jié)結(jié)點(diǎn)，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法首先預(yù)測(cè)AS作用靶點(diǎn)蛋白質(zhì)172個(gè)和Hyp作用靶點(diǎn)蛋白質(zhì)8個(gè)，然后構(gòu)建AS靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)和Hyp靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)，取兩個(gè)蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)的交集，得到交集節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)93個(gè)，最后經(jīng)過(guò)篩選得到10個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)，分別為EGFR、GRB2、NTRK1、HSP90AA1、HSP90AB1、FBO6、PSMA3、PTPN1、HUWE1和VCP。通過(guò)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析，分析結(jié)果顯示PI3K/AKT和MAPK兩條信號(hào)通路在GO注釋分析和KEGG通路中都有富集，因此，Hyp治療AS可能是通過(guò)PI3K/AKT和MAPK兩條信號(hào)通路而發(fā)揮作用。

表皮生長(zhǎng)因子受體(Human epidermal growth factor receptor，HER/erbB)家族是酪氨酸激酶受體(RTKs)，他們包括4種同源的跨膜蛋白：HER1(EGFR或erbB1)、HER2(neu或erbB2)、HER3(erbB3)和HER4(erbB4)[11]。表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路啟動(dòng)首先是受體和配體形成二聚體，其中EGFR與HER2形成的異二聚體最常見(jiàn)，然后C-末端酪氨酸的磷酸化為具有SH2結(jié)構(gòu)域或者PTB結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)信號(hào)分子提供結(jié)合位點(diǎn)，這些信號(hào)分子包括：銜接蛋白(如GRB2)和激酶(如PI3K)，進(jìn)行信號(hào)傳遞。啟動(dòng)含有SH2結(jié)構(gòu)域的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子來(lái)激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)(含有銜接蛋白GRB2)和PI3K信號(hào)通路(含有激酶PI3K)[12]。因此，EGFR和GRB2兩個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)可能在PI3K/AKT和MAPK兩條信號(hào)通路中起到關(guān)鍵的作用。

PI3K屬于磷脂激酶家族，主要通過(guò)兩種方式激活：一種是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長(zhǎng)因子受體(如EGFR)等或者銜接蛋白相互作用，引起聚二體構(gòu)象改變而被激活；另一種是通過(guò)Ras和催化亞基直接結(jié)合導(dǎo)致PI3K活化，活化的PI3K進(jìn)一步催化胞質(zhì)膜上PIP3的生成，PIP3與含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白AKT結(jié)合而活化AKT[13-14]。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用。

MAPK信號(hào)主要特點(diǎn)是具有MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，MAPK至少有12種，分屬于ERK家族、p38家族和JNK家族，在不同的細(xì)胞中，MAPK通路成員組成及誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答有所不同。ERK在生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Ras屬于ERK家族，Ras/MAPK信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)信號(hào)，其基本過(guò)程是EGF與HER2形成異二聚體，激活受體的蛋白激酶活性，受體自身酪氨酸殘基磷酸化形成SH2結(jié)合位點(diǎn)，從而結(jié)合含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白GRB2，進(jìn)一步活化SOS分子，活化的SOS結(jié)合Ras蛋白，促進(jìn)Ras釋放GDP、結(jié)合GTP，活化的Ras蛋白(Ras-GTP)可以激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)磷酸化作用激活多種效應(yīng)蛋白，從而發(fā)揮作用[15-16]。MAPK信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡密切相關(guān)。

綜上所述，Hyp治療AS的機(jī)制可能是通過(guò)EGFR和GRB2兩個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)調(diào)控PI3K/AKT和MAPK兩條信號(hào)通路，參與AS相關(guān)因子、蛋白和受體等重要調(diào)控分子的活化而影響AS的病理進(jìn)程。

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