益氣解毒方對(duì)鼻咽癌細(xì)胞標(biāo)志物T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1及Ras相關(guān)C3肉毒素底物1表達(dá)的影響

陳艷 楊婷

摘要：目的 觀察益氣解毒方對(duì)鼻咽癌細(xì)胞標(biāo)志物T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1（Tiam1）和Ras相關(guān)C3肉毒素底物1（Rac1）表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、益氣解毒方組和陽性藥組，分別予生理鹽水、益氣解毒方藥液和5-氟尿嘧啶注射液，干預(yù)后置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，24 h后采集細(xì)胞。免疫組化和Western blot檢測(cè)細(xì)胞Tiam1和Rac1蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Tiam1和Rac1 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，益氣解毒方組和陽性藥組Tiam1和Rac1的蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低，且益氣解毒方組降低更明顯（P<0.01）。結(jié)論 益氣解毒方可能通過抑制腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物Tiam1和Rac1的表達(dá)，達(dá)到治療鼻咽癌的作用。

關(guān)鍵詞：益氣解毒方；鼻咽癌；T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1；Ras相關(guān)C3肉毒素底物1

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.011

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）05-0046-04

Effects of Yiqi Jiedu Prescription on Expressions of Nasopharyngeal Carcinoma

Cell Markers Tiam1 and Rac1

CHEN Yan， YANG Ting

College of Traditional Chinese Medicine， Changsha Medical University， Changsha 410219， China

Abstract： Objective To investigate the effects of Yiqi Jiedu Prescription on expressions of nasopharyngeal carcinoma cell markers Tiam1 and Rac1； To explore its possible mechanisms. Methods The experiment included blank group， Yiqi Jiedu Prescription group and positive control group， and the three groups were given saline， Yiqi Jiedu Prescription and 5-Fu injection， respectively. After being intervened， the three group were cultured at 37 ℃ in 5% incubator. After 24 hours， the cells were collected. The protein levels of Tiam1 and Rac1 were evaluated by Western blot and immunohistochemistry. The mRNA levels of Tiam1 and Rac1 were determined by real-time PCR. Results Compared with blank group， protein and mRNA expressions of Tiam1 and Rac1 decreased in Yiqi Jiedu Prescription group and positive control group， and Yiqi Jiedu Prescription group showed more significant decrease （P<0.01）. Conclusion Yiqi Jiedu Prescription plays a role in the treatment of nasopharyngeal carcinoma by inhibiting the expression of tumor cell markers Tiam1 and Rac1.

Keywords： Yiqi Jiedu Prescription； nasopharyngeal carcinoma； Tiam1； Rac1

鼻咽癌是頭頸部高發(fā)的惡性腫瘤之一，主要起源于鼻咽上皮細(xì)胞，在我國(guó)南方及東南亞地區(qū)較為常見。近年研究顯示，T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1（Tiam1）是重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[1]。益氣解毒方是臨床治療鼻咽癌的常用方，具有生津潤(rùn)燥、益氣解毒的功效。前期臨床觀察顯示，益氣解毒方治

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（15C0162）

通訊作者：楊婷，E-mail：285934286@qq.com

療鼻咽癌療效確切[2-4]。本實(shí)驗(yàn)觀察益氣解毒方對(duì)鼻咽癌細(xì)胞標(biāo)志物Tiam1和Ras相關(guān)C3肉毒素底物1（Rac1）表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人鼻咽癌5-8F細(xì)胞株，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)中心。

1.2 藥物及制備

益氣解毒方（黃芪20 g、天花粉10 g、白花蛇舌草10 g、射干10 g、黨參5 g、黃連5 g、甘草3 g等），長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院制備，處方飲片用三蒸水浸泡過夜，煮沸25 min過濾，離心后濃縮，加定量生理鹽水配成1 g/mL溶液，抽濾除菌，4 ℃冰箱冷藏備用。5-氟尿嘧啶（5-Fu）注射液，南通精華制藥有限公司，批號(hào)080607。

1.3 主要試劑與儀器

小牛血清，杭州四季青生物制品有限公司；胰蛋白酶，美國(guó)Difco公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)MBI公司；HRP（sp-9001-3ml）標(biāo)記二抗，北京康為生物試劑公司；兔抗人Tiam1（H-300）蛋白單克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz公司；鼠抗人Rac1（610650）蛋白單克隆抗體，即用型非生物素免疫組化EliVision plus檢測(cè)試劑盒，福州邁新公司；PBS、Trizol試劑、PCR反應(yīng)試劑盒，上海生工生物工程有限公司。多通道PCR儀（美國(guó)MJ PTC-220），雙光束紫外分光光度計(jì)（美國(guó)LAMBDA BIO 20），凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（BIO-RAD GD Doc2000，美國(guó)），DNA測(cè)序儀（美國(guó)ABI3100型）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將人鼻咽癌5-8F細(xì)胞株置于含10%熱滅活小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)，每毫升含青霉素100 U、鏈霉素100 ?g，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。PBS沖洗2次，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿至單層后，加入0.25%胰蛋白酶1 mL消化貼壁細(xì)胞。血清培養(yǎng)終止消化，細(xì)胞收集置離心管離心，細(xì)胞傳代2～3次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105/mL備用。將懸液接種于3孔板中，分成對(duì)照組、益氣解毒方組和陽性藥組進(jìn)行處理。對(duì)照組加生理鹽水培養(yǎng)，益氣解毒方組加益氣解毒方藥液培養(yǎng)，陽性藥組加5-Fu培養(yǎng)，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.5 免疫組化檢測(cè)T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1蛋白表達(dá)

采用EliVision plus法染色，將制作好的切片脫蠟水化，加入復(fù)合消化酶進(jìn)行酶修復(fù)，PBS沖洗3次×3 min，分別加入3%過氧化物酶、山羊血清工作液，37 ℃孵育30 min，滴加Tiam1一抗（稀釋度1∶100），4 ℃過夜，溫箱孵育30 min，PBS沖洗3次×3 min，分別加入生物素標(biāo)記兔抗人及辣根酶標(biāo)記鏈酶工作液后，再次PBS沖洗3次×3 min，滴加DAB顯色試劑，鏡下觀察3～5 min，胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色、黃棕色顯示為陽性，蘇木精復(fù)染2 min，脫水后放入碳酸鋰10 s，梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封固，鏡下觀察，拍照記錄，對(duì)照組用PBS代替一抗陽性判定，以著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)綜合判斷。著色強(qiáng)度：無色記0分，黃色記1分，棕黃色記2分；陽性細(xì)胞數(shù)≤10%記1分，11%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果<3分為陰性，3～4分為陽性，>4分為強(qiáng)陽性。最終結(jié)果由2位高年資藥師采用雙盲法獲得，強(qiáng)陽性定義為高表達(dá)。

1.6 Western blot檢測(cè)T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1和Ras相關(guān)C3肉毒素底物1的蛋白表達(dá)

取出收集的細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制的蛋白提取液中提取細(xì)胞總蛋白，BCA定量法測(cè)定蛋白濃度，收集上清液，定量提取10 mg標(biāo)準(zhǔn)蛋白，加入SDS上樣緩沖液，PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜封閉，加入Tiam1和Ras1一抗（1∶100），4 ℃搖床過夜，孵育30 min后加HRP標(biāo)記羊抗兔（1∶100），孵育4 h后漂洗顯影，用GAPDH做內(nèi)參（OD值為目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值），以上步驟重復(fù)3次。

1.7 RT-PCR檢測(cè)T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1和Ras相關(guān)C3肉毒素底物的mRNA表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞收集于1.5 mL EP管中，按照試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取和c-DNA的制備，采用軟件設(shè)計(jì)引物，以GAPDH作為參照，Tiam1和Rac1引物序列見表1，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min（94 ℃、30 s 57 ℃、30 s 72 ℃、30 s）×30 cycles；72 ℃ 10 min。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)吸光度掃描儀掃描后，用PCR條帶軟件進(jìn)行定量分析，灰度值用ImageJ軟件分析，結(jié)果以基因相對(duì)表達(dá)量表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)檢驗(yàn)后，采用方差分析，組間比較用LSD法。P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

Tiam1在對(duì)照組中呈棕黃色、強(qiáng)陽性表達(dá)，在陽性藥組陽性細(xì)胞表達(dá)均下降，益氣解毒方組下降更明顯（P<0.01）。見表2、圖1。

圖1 各組人鼻咽癌細(xì)胞Tiam1陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，陽性藥組和益氣解毒方組Tiam1和Rac1蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且益氣解毒方組Tiam1和Rac1蛋白表達(dá)降低更明顯（P<0.01）。見表3、圖2。

注：A.對(duì)照組；B.益氣解毒方組；C.陽性藥組

圖2 各組人鼻咽癌細(xì)胞Tiam1和Rac1蛋白表達(dá)免疫印跡圖

2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，陽性藥組和益氣解毒方組Tiam1、Rac1 mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且益氣解毒方組Tiam1、Rac1 mRNA表達(dá)降低更明顯（P<0.01）。見表4、圖3和圖4。

注：A.對(duì)照組；B.益氣解毒方組；C.陽性藥組

圖3 各組人鼻咽癌細(xì)胞Tiam1 mRNA表達(dá)凝膠電泳圖

注：A.對(duì)照組；B.益氣解毒方組；C.陽性藥組

圖4 各組人鼻咽癌細(xì)胞Rac1 mRNA表達(dá)凝膠電泳圖

3 討論

Tiam1是一個(gè)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要基因，最初是從小鼠T淋巴瘤細(xì)胞中分離而來，它在T淋巴瘤的轉(zhuǎn)移侵襲和傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，可激活Rho蛋白家族的活性并參與Rac1介導(dǎo)的信號(hào)通路，Rac1是Rho小G蛋白家族成員，屬于Ras相關(guān)C3肉毒梭菌毒素底物蛋白，在外界細(xì)胞刺激下，Tiam1能影響Rac1從無活性的GDP結(jié)合狀態(tài)向有活性的GTP結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變，間接影響細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)，使其發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，是Rac1的直接上游靶蛋白[5]。有研究表明，Rac1在胃癌等腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[6]，是腫瘤細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一。過表達(dá)Tiam1可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲，其分子機(jī)制可能為其他腫瘤相關(guān)因子對(duì)Tiam1的調(diào)控作用及Tiam1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響。Shi Y L等[7]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Tiam1對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲有重要的促進(jìn)作用；Li J等[8]研究表明，miR-22等基因能通過負(fù)向調(diào)控Tiam1的表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；Minard M E等[9]研究顯示，通過檢測(cè)在直腸癌細(xì)胞中，Tiam1可增加來源于上皮的腫瘤細(xì)胞的入侵，同時(shí)Tiam1在乳腺癌[10]、腎細(xì)胞癌[11]等組織中也呈高表達(dá)。Tiam1已成為惡性腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物[12]。

中醫(yī)學(xué)無鼻咽癌的病名，在古籍中關(guān)于“失榮”“鼻淵”“惡核”“瘰疬”“上石疽”等病證的記載包含了現(xiàn)代鼻咽癌的病癥特點(diǎn)和治療方法。如《外科正宗》記載“日久漸大，堅(jiān)硬如石，推之不移，按之不動(dòng)，半載一年，方生陰痛，氣血漸衰，形容瘦削，破爛紫斑，滲流血水”，《瘡瘍?nèi)珪诽岬缴鲜摇皾⒓捶叛?，三日?nèi)斃”等，其病因及臨床表現(xiàn)均與現(xiàn)代鼻咽癌相似。鼻咽癌在中醫(yī)中的病機(jī)主要為正氣虧虛、臟腑功能失調(diào)，外加毒邪入體、氣血凝結(jié)，進(jìn)一步演變?yōu)闊岫聚帐?、臟腑虧虛，最終導(dǎo)致正氣衰竭而亡。中醫(yī)治療腫瘤主要側(cè)重扶正祛邪，治以補(bǔ)氣養(yǎng)血、滋陰溫陽、清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)為主。益氣解毒方是治療鼻咽癌的基礎(chǔ)方，本方以黃芪、黨參等補(bǔ)氣藥為重，輔以白花蛇舌草和黃連以清熱、解毒、化瘀、祛邪，以茯苓、天花粉養(yǎng)陰健脾。本方起到氣陰雙補(bǔ)、扶正祛邪及補(bǔ)瀉并施的治療作用，對(duì)鼻咽癌療效顯著。鮑錫金[13]對(duì)晚期大腸癌患者通過健脾益氣解毒方聯(lián)合化療與單純化療對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療效果明顯；謝晶日等[14]研究顯示，益氣養(yǎng)陰化瘀解毒方對(duì)慢性萎縮性胃炎癌前病變氣陰兩虛夾毒患者有明顯的治療效果；許軍等[15]研究顯示，益氣養(yǎng)陰解毒方聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)治療原發(fā)性肝癌在保護(hù)患者肝功能、改善生活質(zhì)量及延長(zhǎng)其生存時(shí)間方面優(yōu)于單純肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)。以上研究均證實(shí)了益氣解毒方在腫瘤方面的治療效果。

本研究觀察益氣解毒方對(duì)鼻咽癌細(xì)胞標(biāo)志物Tiam1的影響，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出，益氣解毒方能顯著降低Tiam1和Rac1的蛋白和mRNA表達(dá)，且效果優(yōu)于5-Fu注射液。

綜上，益氣解毒方可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲，通過降低Tiam1和Rac1在鼻咽癌組織中的表達(dá)而發(fā)揮抗癌作用，為其臨床治療鼻咽癌提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-07-24）

（修回日期：2017-09-06；編輯：華強(qiáng)）