• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      補骨脂苷和異補骨脂苷與牛血清白蛋白相互作用研究*

      2018-06-20 11:36:42郭家鼎李夢榮王譽程劉二偉
      天津中醫(yī)藥 2018年6期
      關鍵詞:補骨脂素常數(shù)探針

      郭家鼎,郝 佳,李夢榮,王譽程,劉二偉

      中藥補骨脂為豆科植物(Psocalea corylicolia L.)的果實,具有補腎壯骨、升達脾胃、納氣止瀉的功效,其主要藥效成分是香豆素類化合物補骨脂素、異補骨脂素及其對應的糖苷類化合物補骨脂苷(PO)、異補骨脂苷(IPO),文獻報道補骨脂原藥材中PO、IPO的含量高于補骨脂素、異補骨脂素[1]。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白,可與許多內源性或外源性化合物結合[2]。開展藥物與血漿蛋白相互作用研究是每個藥物開發(fā)過程中必須進行的研究工作。牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HSA)具有極好的結構相似性,且前者易于獲取和具有高度穩(wěn)定性[3],所以在研究中常作為HSA的替代品。補骨脂素、異補骨脂素與血漿蛋白結合的研究已有相關報道[4],但其糖苷類化合物PO、IPO的相應研究還未見報道。本文利用紫外吸收光譜法和熒光光譜法首次研究PO和IPO與BSA的相互作用,為補骨脂的安全應用提供實驗支撐。

      1 儀器與試劑

      1.1 儀器 熒光分光光度計(F-7000,日立高新技術有限公司);超級恒溫水浴箱(天津歐諾儀器有限公司);紫外檢測器(Agilient 1260高效液相色譜儀);十萬分之一天平(瑞士 Mettler Toledo公司,AX-205);超純水制造機(Millipore公司,Mill-QⅡ型)。

      1.2 試劑 PO,IPO(天津西瑪科技有限公司);布洛芬Ibu、BSA、磷酸鹽緩沖液PBS(索萊寶科技有限公司);華法林鈉War(天津渤爾特科技有限公司);8-苯胺基-1-萘磺酸鈉ANS-Na(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司);其他試劑均為分析純,實驗用水均為超純化水。

      2 實驗方法

      2.1 儲備溶液配制 以PBS緩沖溶液(pH 7.4溶劑配制 1.0×10-4mol/L的 BSA標準溶液備用,PO和IPO配成1×10-2mol/L標準液備用,均在0~4℃冰箱中保存。

      2.2 紫外光譜研究 移取100 μL 1.0×10-3mol/L藥物溶液、一定量的BSA溶液于1.5 mL離心管中,以PBS緩沖溶液(pH 7.40)定容至1 mL,掃描得到190~400 nm紫外吸收光譜。

      2.3 熒光光譜研究

      2.3.1 熒光淬滅光譜 移取100 μL 5.0×10-5mol/L BSA溶液和一定量的PO與IPO溶液于1.5 mL離心管中,以pH 7.40的PBS緩沖溶稀釋至1 mL,得到不同濃度的PO和IPO待測溶液,其濃度從1到8 依次是 0、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3×10-4mol/L。實驗過程中,為了避免內濾光效應,使BSA的終濃度為5×10-6mol/L。工作液至于37℃水浴中溫育1 h,分取樣品100 μL至于96孔板中,制備4個復孔。激發(fā)波長278 nm,進行300~500 nm的全波長掃描,激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫分別是5 nm,掃描速度240 nm/min。記錄樣品在37℃條件下的熒光發(fā)射光譜。

      2.3.2 同步熒光掃描圖譜 以240 nm為激發(fā)波長,300 nm為發(fā)射波長(Δλ=60 nm),測定加入藥物后體系的同步熒光光譜。藥物濃度濃度從1到8依次是 0、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3×10-4mol/L。

      2.3.3 三維熒光掃描圖譜 激發(fā)波長的范圍240~320 nm;發(fā)射波長范圍300~450 nm,其他參數(shù)同熒光發(fā)射光譜。

      2.3.4 位點競爭實驗 固定BSA的濃度,向藥物-BSA體系分別加入一定量的競爭試劑:位點Ⅰ(SiteⅠ)的探針試劑為War,位點Ⅱ(SiteⅡ)的探針試劑為Ibu,在激發(fā)波長為278 nm,發(fā)射波長為340 nm處測定其熒光強度,所得數(shù)據(jù)用來計算藥物與BSA結合常數(shù)。

      2.3.5 疏水探針ANS 結合研究:實驗(1),將PO/IPO 加入到 BSA-ANS-Na(CBSA:CANS-Na=1∶1)體系中,PO/IPO 濃度變化范圍為 0~3×10-4mol/L,設置激發(fā)波長為375 nm,記錄ANS-Na在最大發(fā)射波長465 nm處的熒光值;實驗(2),將PO/IPO加入到BSA-ANS-Na(CBSA:CANS-Na=1∶1)體系中,PO/IPO 濃度變化范圍為 0~3×10-4mol/L,設置激發(fā)波長為 278nm,記錄BSA在最大發(fā)射波長340 nm處的熒光值,所得數(shù)據(jù)用來計算藥物與BSA鍵合常數(shù)。

      3 結果

      圖1 PO(A)和IPO(B)對BSA的紫外吸收圖譜Fig.1 UV/vis absorbance spectra of PO(A)or IPO(B)in the absence and presence of BSA

      3.1 紫外/可見吸收光譜研究 紫外/可見吸收光譜法方法簡單適用于探索結構變化和了解復合物的形成[5]。通過預實驗發(fā)現(xiàn),當固定BSA的濃度,不斷增加藥物濃度時,在BSA最大吸收波長處有干擾,因此為了考察PO、IPO與BSA相互作用,實驗固定藥物濃度,測試不同濃度BSA與一定量的藥物作用的紫外/可見吸收光譜。如圖1所示,隨著BSA濃度的增加,藥物的紫外吸收光譜呈現(xiàn)了增色效應,提示可能是因為二者發(fā)生了相互作用,導致了BSA構像發(fā)生變化。但是藥物和BSA相互作用機制還需要進一步探討,因此,進行了熒光光譜研究。

      3.2 PO和IPO對BSA的淬滅作用及其結合常數(shù)研究 如圖2A所示,當激發(fā)光波長為278 nm時,BSA熒光發(fā)射峰位置在339 nm附近,且PBS緩沖液及兩種藥物在339 nm附近無明顯的熒光發(fā)射,對實驗不造成干擾。本實驗以PBS作為參比溶液,采用背景扣除法修正參比溶液的背景熒光得到如圖2B-C熒光淬滅圖譜。由圖2B-C可知,固定BSA的濃度不變,隨著PO和IPO濃度的增加,BSA熒光強度逐漸下降,最大發(fā)射波長發(fā)生了約2 nm的輕微紅移,說明PO和IPO對BSA具有明顯的熒光淬滅作用。又如圖2B-C所示,PO和IPO對BSA的熒光淬滅圖譜中均出現(xiàn)了等發(fā)射點,表明PO和IPO與BSA的相互作用過程中產(chǎn)生了新的化合物,導致其對BSA的熒光淬滅行為。

      熒光淬滅作用分為動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅,無論是動態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅,全部遵循Stern-Volmer方程[12]:

      由Stern-Volmer方程擬合得到的圖3顯示,在一定的藥物濃度范圍內(0-3×10-4mol/L),F(xiàn)0/F與[D]線性關系良好,且由表1可知,37℃時,PO和IPO對BSA熒光淬滅速率常數(shù)均為3.1×1011L/(mol·s),大于各類熒光淬滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s),說明PO和IPO對BSA的熒光淬滅是因為新的結合物生成而引起,即靜態(tài)淬滅,這與上述熒光淬滅圖譜的結果一致。

      圖2 BSA熒光圖譜(A)及PO(B)、IPO(C)對BSA的熒光淬滅圖Fig.2 Fluorescence spectra of BSA in the absence(A)and presence of PO(B)or IPO(C)

      靜態(tài)淬滅過程也可以用修正的Stern-Volmer方程分析[6],

      根據(jù)方程(2)擬合得到線性方程F0/(F0-F)~1/[D],見圖4。由截距和斜率計算得到37℃時PO和IPO對BSA的結合常數(shù)Ka,詳見表1。

      藥物在BSA上結合位點數(shù)的推算多采用修正后的Scatchard方程[7],圖5為利用lg[(F0-F)/F]~lg[D]作圖得到的藥物-BSA體系的Scatchard圖:

      由圖5的直線斜率計算得到37℃時藥物分子在BSA上的結合位點數(shù)n并列于表1中。PO和IPO在在BSA上的結合位點數(shù)分別是1.11和0.94,說明藥物在BSA上只存在一個結合位點,即藥物與BSA以1∶1的比例進行結合。

      3.3 PO和IPO對BSA位點確定研究 HSA上至少有兩個特異的高親和藥物結合位點,分別稱為siteⅠ和siteⅡ。許多藥物對HSA的結合具有特異性[8],如War結合于siteⅠ,Ibu結合于siteⅡ,這兩個藥物可以用作位置探針。BSA與HSA結構上有極高的相似度,因此,選擇 War、Ibu 分別作為 siteⅠ、siteⅡ的探針藥物,從而研究探針藥物與PO和IPO的競爭結合情況,確定藥物在BSA上的結合位點。本實驗中,探針藥物與BSA按1∶1比例混合,同時加入到含有不同濃度的藥物溶液中。在3種探針藥物存在下,根據(jù)方程(2)分析熒光淬滅數(shù)據(jù),相關熒光參數(shù)列于表1。根據(jù)方程(3)所得的結合位點n約為1,說明探針藥物的存在并沒有改變PO和IPO在BSA上結合位點數(shù),證實了上述PO和IPO在BSA上均有一個結合位點的結論。由表1可知,探針I(yè)bu存在時,IPO對BSA的結合常數(shù)Ka變小幅度最大,表明Ibu與IPO同時競爭同一個結合位點,但是探針試劑的加入并沒有對PO的結合常數(shù)造成影響。

      圖3 PO(A)和IPO(B)對BSA的Stern-Volmer擬合圖Fig.3 Stern-Volmer curve of BSA fluorescence quenching treated with different concentrations of PO(A)or IPO(B)

      圖 4 PO(A)和 IPO(B)對 BSA 的 F0/(F0-F)~1/[D]擬合圖Fig.4 Plot of F0/(F0-F)versus 1/[D]for fluorescence quenching of BSA by PO(A)or IPO(B)

      圖 5 PO(A)和 IPO(B)對 BSA 的 lg[F0-F)/F]~lg[D]擬合圖Fig.5 Plot of lg[F0-F)/F]versus lg[D]for quenching process of PO(A)or IPO(B)with BSA

      表1 藥物-BSA體系及藥物-BSA/探針體系在PBS緩沖液(pH=7.4)中和T=37℃條件下的熒光參數(shù)Tab.1 Fluorescence parameters of drug-BSA system and Drug-BSA/probeSysteminPBSbuffer(pH=7.4)andT=37℃

      3.4 ANS置換探針 ANS在極性環(huán)境中沒有明顯的熒光發(fā)射,但是與蛋白質的疏水區(qū)域結合后熒光信號增強[8],所以本實驗選用疏水性探針試劑ANSNa研究BSA與PO/IPO之間相互作用的性質。在實驗(1)中,將不同濃度的PO/IPO加入到BSA-ANS體系,藥物濃度變化范圍0~3×10-4mol/L,記錄ANS相對熒光強度F/F0(F0:未加藥物時ANS熒光值,F(xiàn):加入不同濃度藥物時ANS熒光值)隨藥物濃度變化趨勢,得圖6,如圖所示隨著藥物濃度的增加ANS熒光值變小。ANS是一個廣譜性熒光探針,在BSA上有5個結合位點,但是當ANS與BSA濃度比為1∶1時,其主要結合位點主要位于SiteⅡ[9],因此推測PO/IPO與ANS競爭性結合BSA致使ANS熒光強度下降。利用ANS進行了第二系列實驗,ANS對PO/IPO與BSA結合常數(shù)的影響結果列于表1,發(fā)現(xiàn)ANS使PO/IPO結合常數(shù)Ka變小,再一次對PO/IPO在BSA上的結合位點是SiteⅡ的結果進行了驗證。

      3.5 PO和IPO對BSA構象影響研究 使用同步熒光光譜可以探測蛋白質氨基酸微環(huán)境的改變,而血清白蛋白的熒光發(fā)射的特性主要來自色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的貢獻,其中Trp熒光強度最大,因此Trp的熒光猝滅可以用來表征藥物與BSA的結合關系及BSA形態(tài)的變化[10]。本實驗把Trp的同步熒光光譜作為定性判斷BSA構象變化的依據(jù),見圖 7。當 Δλ=λem-λex=60 nm時,同步熒光顯示為Trp的熒光行為。如圖7所示,固定BSA的濃度不變,隨著藥物濃度的增加,BSA的熒光強度逐漸下降,最大發(fā)射波長發(fā)生了約3 nm的輕微紅移,表明藥物對BSA的構象造成了輕微的影響,使Trp所處的微環(huán)境極性略有增加。

      三維熒光圖譜可以同時改變發(fā)射波長和激發(fā)波長,從而提供熒光體的熒光特性信息[11]。圖8為BSA、PO-BSA和IPO-BSA的三維熒光圖譜。如圖8所示,峰1主要是tyr和try熒光發(fā)射行為,隨著PO和IPO的加入,峰1的熒光值下降,表明tyr和try的微環(huán)境發(fā)生了變化,PO和IPO與BSA之間的相互作用導致BSA構象發(fā)生了變化,這與同步熒光發(fā)射圖譜顯示的結果一致。

      圖6 疏水熒光探針ANS在PO/IPO作用下的相對熒光圖譜Fig.6 Displacement of fluorescent probes from HSA by drugs(PO/IPO)

      4 討論

      本實驗采用紫外-可見吸收光譜法和熒光光譜法對PO和IPO在生理狀態(tài)下對BSA的熒光淬滅方式、結合常數(shù)、結合位點數(shù)、以及PO和IPO對BSA構象的影響進行了研究。從熒光淬滅光譜、同步熒光光譜及三維熒光光譜可以看出,PO和IPO對BSA產(chǎn)生靜態(tài)淬滅作用,并且對BSA的構象產(chǎn)生了輕微影響。根據(jù)表1結果可知,PO和IPO對BSA之間有較弱的結合。根據(jù)位點競爭實驗結果可知,PO和IPO的在BSA上的主要結合位點在SiteⅡ。

      圖7 PO(A)和IPO(B)對BSA同步熒光光譜圖Fig.7 Influence of PO(A)or IPO(B)on synchronous fluorescence spectra of BSA

      圖 8BSA(A)、PO-BSA(B)和 IPO-BSA(C)的三維熒光圖譜Fig.8 Three-dimensional fuorescence spectra of BSA in the absence(A)and presence of PO(A)or IPO(B)

      [1]Wang YF,Liu YN,Xiong W,et al.A UPLC–MS/MS method for in vivo,and in vitro,pharmacokinetic studies of psoralenoside,isopsoralenoside,psoralen and isopsoralen from Psoralea corylifolia,extract[J].Journal of Ethnopharmacology,2014,151(1):609.

      [2]Müller WE,Wollert U.Human Serum Albumin as a‘Silent Receptor’for Drugs and Endogenous Substances[J].Pharmacology,1979,19(2):59-67.

      [3] Hossain M,Khan AY,Suresh KG.Interaction of the anticancer plant alkaloid sanguinarine with bovine serum albumin[J].Plos One,2011,6(4):e18333.

      [4] 何文英,姚曉軍,胡之德,等.補骨脂素和異補骨脂素鍵合人血清白蛋白的比較[J].物理化學學報,2010,26(1):221-229.

      [5] Wang YQ,Zhang HM,Zhou QH.Studies on the interaction of caffeine with bovine hemoglobin[J].European Journal of Medicinal Chemistry,2009,44(5):2100.

      [6] Mehranfar F,Bordbar AK,Parastar HA.Combined spectroscopic,molecular docking and molecular dynamic simulation study on the interaction of quercetin with β-casein nanoparticles[J].Journal of Photochemistry&Photobiology B Biology,2013,127:100.

      [7] Hao J,Zhang Y,Wang X,et al.Interaction between the Natural Components in Danhong Injection(DHI)with Serum Albumin(SA)and the Influence of the Coexisting Multi-Components on the SaB-BSA Binding System:Fluorescence and Molecular Docking Studies[J].Plos One,2015,10(6):e0128919.

      [8] Bojko B,Sufkowska A,Macia′ek-Jurczyk M,et al.Investigations of acetaminophen binding to bovine serum albumin in the presence of fatty acid:Fluorescence and1H NMR studies[J].Journal of Molecular Structure,2009(s924-926):332-337.

      [9] Jun HW,Ruenitz PC.Interaction of tricyclic antipsychotic and antidepressant drugs with 1-anilino-8-naphthalenesulfonic acid[J].Journal of Pharmaceutical Sciences,1978,67(6):861.

      [10]He LL,Wang ZX,Wang YX,et al.Studies on the interaction between promethazine and human serum albumin in the presence of flavonoids by spectroscopic and molecular modeling techniques[J].Colloids&Surfaces B Biointerfaces,2016(145):820-829.

      [11]Liu X,Ling Z,Zhou X,et al.Comprehensive spectroscopic probing the interaction and conformation impairment of bovine serum albumin(BSA)by herbicide butachlor[J].Journal of Photochemistry&Photobiology B Biology,2016(162):332.

      猜你喜歡
      補骨脂素常數(shù)探針
      關于Landau常數(shù)和Euler-Mascheroni常數(shù)的漸近展開式以及Stirling級數(shù)的系數(shù)
      幾個常數(shù)項級數(shù)的和
      多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
      萬有引力常數(shù)的測量
      BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應用
      透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置
      物理實驗(2015年9期)2015-02-28 17:36:47
      HPLC法測定補腎益腦片中補骨脂素和異補骨脂素的含量
      掃描近場光電多功能探針系統(tǒng)
      HPLC法測定補骨脂藥材中補骨脂素和異補骨脂素
      中成藥(2012年8期)2012-09-06 14:28:58
      紫外分光光度法測定曲札芪苷的解離常數(shù)
      若尔盖县| 高淳县| 扶绥县| 沁水县| 辽中县| 浙江省| 寿光市| 巫山县| 旺苍县| 长宁县| 绵阳市| 临武县| 高唐县| 延长县| 名山县| 泰和县| 卢湾区| 阿拉善右旗| 宁国市| 咸阳市| 桂东县| 包头市| 海原县| 齐河县| 西乌珠穆沁旗| 镇安县| 化州市| 永泰县| 唐山市| 石棉县| 安西县| 修水县| 阿瓦提县| 长葛市| 英吉沙县| 绥滨县| 宜宾市| 台北县| 天台县| 阳朔县| 柯坪县|