七子益腎理沖湯對DOR大鼠卵巢儲備的影響*

錢穎儀 ，劉雁峰

卵巢儲備功能低下（DOR），或稱卵巢儲備功能不足，是指卵巢內(nèi)存留的可募集卵泡數(shù)量減少，卵子成熟能力減弱，卵泡質(zhì)量下降，導(dǎo)致女性生育能力下降及性激素缺乏的疾??；此病患者約占不孕婦女的10%[1]。卵巢的儲備功能減退是一個漸進性的過程，早期發(fā)現(xiàn)及診斷卵巢儲備功能減退，及時進行干預(yù)，可以改善女性的生殖潛能，提高受孕能力及妊娠結(jié)局。

七子益腎理沖湯為當(dāng)代名老中醫(yī)、婦科名家肖承悰教授所創(chuàng)，是治療卵巢儲備功能低下及卵巢早衰的經(jīng)驗方。前期臨床研究顯示，七子益腎理沖湯改善卵巢早衰婦女月經(jīng)周期、經(jīng)期、經(jīng)色、經(jīng)質(zhì)，亦改善患者烘熱汗出、陰道干澀等腎虛血瘀的臨床癥狀[2]。本研究旨在探討七子益腎理沖湯在卵巢儲備功能低下的情況下調(diào)治卵巢儲備及促進卵泡發(fā)育的作用。實驗以檢測卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）及抗穆勒氏管激素（AMH）水平評估七子益腎理沖湯對卵巢儲備功能的影響；病理學(xué)改變觀察七子益腎理沖湯對模型大鼠卵巢組織損傷的修復(fù)情況，評估七子益腎理沖湯對卵泡凋亡及卵泡發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級SD大鼠，雌性，8周齡，200～220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2012-0001。動物適應(yīng)環(huán)境 7 d，自由飲水飲食，室溫（21±2）℃，濕度（40±10）%，光照周期12/12 h。進行陰道涂片，檢查動情周期，連續(xù)觀察2個動情周期正常納入實驗。

1.2 實驗藥物 七子益腎理沖湯（組成：女貞子15 g，枸杞子 15 g，菟絲子 15 g，沙苑子 15 g，覆盆子15 g，桑椹 15 g，香附 15 g，桑寄生 15 g，續(xù)斷 15 g，巴戟天 15 g，熟地黃 15 g，白芍 15 g，黃芪 15 g，黃精15 g）實驗藥物為濃縮中藥顆粒，由培力（香港）有限公司生產(chǎn)的農(nóng)本方中藥顆粒,臨用前加雙蒸水配成低、中、高濃度的混懸液；脫氫表雄酮（DHEA）為美國GNC公司生產(chǎn)的25 mg DHEA,由香港牛奶有限公司旗下萬寧購買。DHEA藥片研磨，溶于生理鹽水配成混懸液。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 實驗動物共分為6組，分別為空白組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組及西藥組（DHEA組）。每組實驗動物各10只。

1.3.2 動物模型的建立 將所有大鼠編號，使用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為兩組：空白對照組(空白組)10只、DOR造模組50只。DOR造模組大鼠，每日于9時定時腹腔注射脫氧乙烯基環(huán)己烯（VCD），VCD稀釋至濃度約8 mg/mL備用，每只大鼠根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量，每100 g體質(zhì)量注射1 mL，連續(xù)用藥15天。

1.3.3 給藥方法 低、中、高劑量組的劑量：七子益腎理沖湯每天臨床人類的臨床用量為0.6 g/kg；而實驗中的低、中、高劑量組的劑量分別相當(dāng)于臨床等效劑量的0.5、1、2倍。大鼠用量計算根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”折算。實驗藥物臨用前加雙蒸水配成低、中、高濃度的混懸液,灌胃給藥，每只大鼠按每100 g灌1 mL，每天1次，連續(xù)15 d（約為3個大鼠動情周期）。西藥組：DHEA用量6.75 mg/kg，經(jīng)計算用量后，以DHEA藥片研磨及溶于生理鹽水至濃度為0.675 mg/mL，組內(nèi)大鼠根據(jù)體質(zhì)量灌胃給藥，每100 g灌1 mL，每天1次，連續(xù)15 d?？瞻讓φ战M及模型組：按體質(zhì)量每100 g予1 mL生理鹽水灌胃,每天1次，連續(xù)15 d。

末次給藥2 h后，稱取體質(zhì)量；大鼠摘眼球取血，待血液凝固后，室溫下以3 000 r/min離心15 min，取上清液，分裝于Eppendorf管，－80℃保存?zhèn)溆?；處死大鼠，摘取雙側(cè)卵巢及子宮，分別測量卵巢及子宮的體積，在天平上稱濕質(zhì)量后，一側(cè)卵巢組織液氮保存，另一側(cè)放于固定液中，石蠟包埋，切片備用。

1.4 指標(biāo)檢測 1）計算卵巢指數(shù)：卵巢指數(shù)=雙側(cè)卵巢濕質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%。2）卵巢組織病理切片：一側(cè)卵巢包埋切片后，制作蘇木精-伊紅（HE）病理切片，后在顯微鏡下 40×、100×及 200×觀察卵巢顯微結(jié)構(gòu)，并參考卵泡分級標(biāo)準(zhǔn)，由專業(yè)人員閱片，采用單盲法獨立統(tǒng)計,100×顯微鏡下進行大鼠卵巢切片標(biāo)本中的各級卵泡總數(shù)、成熟卵泡數(shù)及黃體計數(shù)。每組觀察統(tǒng)計6個卵巢，每個卵巢觀察統(tǒng)計5張切片。3）血清FSH、E2、AMH水平的測定：對大鼠外周血血清，運用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測，使用商業(yè)化的放射免疫試劑盒測定每個動物血清樣本的FSH、E2、AMH指標(biāo)。每項化驗重復(fù)進行，計算平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢指數(shù)及體積 模型組較對照組，卵巢指數(shù)明顯降低（P<0.01），卵巢體積明顯減?。≒<0.01）；給藥組較模型組、卵巢指數(shù)升高，且有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；低劑量組較模型組，卵巢體積增大，但無統(tǒng)計學(xué)差異;中劑量組，高劑量組和西藥組較模型組，卵巢體積明顯增大，且存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）；與西藥組比較，中劑量組及高劑量組的卵巢指數(shù)及體積，均無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 各組大鼠卵巢指數(shù)及體積情況（x±s）Tab.1 Ovarian index and ovarian volume of rats in each group（x±s）

2.2 各組大鼠卵巢組織病理切片鏡下觀察 從卵巢組織HE病理切片鏡下觀察可見，空白對照組卵巢皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，可見有許多原始卵泡、各級卵泡，卵泡形態(tài)大小各異，卵泡內(nèi)卵母細胞大而圓，輪廓清晰并見大量黃體分布，形態(tài)正常；模型組部分卵巢皮質(zhì)有萎縮，原始卵泡減少，閉鎖卵泡增多，黃體減少；中藥高劑量組卵巢皮質(zhì)中原始卵泡較模型組有所增加，中藥低、中、高劑量組閉鎖卵泡數(shù)量較模型組有所降低，黃體數(shù)量有所增加；西藥組原始卵泡較模型組增多，但低于對照組，閉鎖細胞較模型組降低，且低于對照組，黃體數(shù)量較模型組增多，且多于對照組。見圖1。

2.3 各組大鼠血清性激素FSH、E2水平 模型組較對照組血清中FSH明顯升高，而血清中E2則明顯下降，且均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；中西藥給藥組較模型組血清中FSH明顯降低（P<0.05），而血清中E2則明顯升高（P<0.05）；中藥低、中、高劑量組之間相互比較，高劑量組較中劑量組及低劑量組，F(xiàn)SH下降、E2升高明顯。可見七子益腎理沖湯能有效調(diào)節(jié)模型大鼠性激素水平，使得FSH水平下降，E2水平上升。見表2。

2.4 各組大鼠血清AMH水平 模型組較對照組，血清中AMH明顯下降，且均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；中西藥給藥組較模型組，血清中AMH則明顯升高（P<0.05）；中藥低、中、高劑量組之間相互比較，高劑量組較中劑量組及低劑量組的AMH明顯升高，均具有統(tǒng)計學(xué)差異；而對比西藥組，高劑量組AMH水平未見明顯差異。見表3。

圖1 HE卵巢組織病理切片圖(40×)Fig.1 HE slides of ovarian samples(40×)

表2 不同組間大鼠FSH、E2檢測結(jié)果（x±s）Tab.2 FSH、E2level of rats in each group（x±s）

表3 不同組間大鼠AMH檢測結(jié)果比較（x±s）Tab.3 AMH level of rats in each group（x±s）ng/mL

3 討論

3.1 卵巢指數(shù)、卵巢顯微組織病理學(xué)、各級卵泡及黃體數(shù)量改變與卵巢儲備的關(guān)系 本研究以卵巢指數(shù)、觀察光鏡下顯微組織病理學(xué)改變和觀察光鏡下各級卵泡并黃體的比例，用于觀察七子益腎理沖湯對DOR模型大鼠卵巢組織損傷的修復(fù)情況，并研究七子益腎理沖湯維護大鼠各級卵泡凋亡、促進卵泡發(fā)育、及黃體生成的作用，從而探討七子益腎理沖湯對卵巢功能恢復(fù)提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。在HE病理切片中可見模型組各級卵泡及黃體數(shù)量大幅減少、閉鎖卵泡增多，并見卵泡發(fā)育不良，生長卵泡內(nèi)顆粒細胞明顯減少。各中西藥組大鼠經(jīng)過治療,在HE切片中可見卵泡發(fā)育較正常，各級卵泡及黃體均較模型組增多而閉鎖卵泡減少,推測用藥透過調(diào)節(jié)HPOA生殖軸及卵巢局部微環(huán)境,使卵泡發(fā)育漸獲恢復(fù)，重建卵巢正常的生理功能。

3.2 FSH、E2與卵巢儲備的關(guān)系 血清FSH升高是DOR的典型內(nèi)分泌特征之一，隨著卵巢儲備功能的下降，卵泡顆粒細胞分泌抑制素減少，卵泡數(shù)量的減少使卵泡對FSH敏感性降低，以致卵泡發(fā)育受限，顆粒細胞產(chǎn)生的抑制素（INH）減少導(dǎo)致早卵泡期的基礎(chǔ)FSH水平升高。卵泡期FSH水平會逐漸升高，促進一定數(shù)量竇卵泡的發(fā)育生長，此影響所分泌的E2水平。而過多卵泡的丟失造成雌激素合成受阻，血清中E2水平降低。減少雌激素調(diào)節(jié)卵母細胞的成熟和顆粒細胞的增殖與分化、促進卵泡發(fā)育的功能。循環(huán)中的低雌激素水平又再對下丘腦、垂體產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用而致下丘腦促性腺激素釋放激素至FSH分泌增加，持續(xù)高水平的FSH對卵泡自身受體的下調(diào)使殘留卵泡的功能處于抑制狀態(tài),因此基礎(chǔ)狀態(tài)下的FSH和E2水平某種程度上可以反映卵巢的儲備功能。臨床上當(dāng)40 mU/mL＞基礎(chǔ)FSH＞10 mU/mL時提示女性人體卵巢儲備功能低下[3]。本研究結(jié)果顯示，模型組、各中西藥治療組FSH水平較空白組均明顯升高，及則E2明顯下降，說明模型組大鼠因VCD直接影響模型大鼠的生殖系統(tǒng)，對其卵巢造成損傷，加速了卵泡閉鎖以致卵泡數(shù)急劇下降從而造成卵巢儲備功能不良。

3.3 AMH與卵巢儲備的關(guān)系 AMH屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族成員之一，在卵巢中的AMH主要由竇前卵泡和竇狀卵泡的顆粒細胞所分泌，其作用是開啟卵泡發(fā)育和選擇性生長的過程，具有抑制雄性穆勒管發(fā)育，調(diào)節(jié)兩性生殖細胞和性腺發(fā)育的重要功能。AMH在人類卵泡生長過程中發(fā)揮著重要的作用，可以作為預(yù)測卵巢儲備功能及促排卵過程中卵巢反應(yīng)性的血清學(xué)標(biāo)記物[4-5]。Seifer等[6]首次證實卵泡早期血清AMH與獲得的卵泡數(shù)目即最終成熟的卵泡數(shù)成正相關(guān)，認為血清AMH可以反映始基卵泡庫的大小，可能成為預(yù)期IVF促排卵中獲卵數(shù)的標(biāo)志物。La Marca等[7]及Tsepelidis等[8]研究指出，AMH在整個月經(jīng)周期的波動極小，呈相對穩(wěn)定狀態(tài)，而且AMH獨立于下丘腦－垂體－卵巢軸，比其他卵巢儲備功能預(yù)測指標(biāo)更具有優(yōu)勢。

3.4 七子益腎理沖湯與卵巢儲備的關(guān)系 肖承悰教授認為卵巢儲備功能低下，其主要病機是腎虛沖血不足、血?？仗?，而臨床上亦以腎虛血瘀證最為多見，故以“腎主生殖”基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，以補腎活血為法，運用益腎填精的中藥，從整體對女性下丘腦-垂體-卵巢-子宮生殖軸進行調(diào)理，并用補血養(yǎng)肝之藥物調(diào)理沖脈，使血海充盈而經(jīng)調(diào)，總結(jié)經(jīng)驗而獨創(chuàng)七子益腎理沖湯[9]。七子益腎理沖湯中“七子”，啟發(fā)于五子衍宗丸，“七子”所指中藥材為女貞子、枸杞子、菟絲子、沙苑子、覆盆子、香附（子）、桑椹（子），于腎中陰陽并補，使腎中陰陽互根互長，以期陽中有陰，陰中有陽，以奏益腎之功。此方于“七子”以上,還加上續(xù)斷、桑寄生、巴戟天，能補腎助陽兼安胎，熟地黃、白芍、黃精、黃芪，能補氣養(yǎng)血，滋陰柔肝，全方補腎活血并用，補益腎中精氣同時注重活血養(yǎng)肝，調(diào)理沖脈血海，其組方合理，配伍巧妙，用藥精良。

本實驗中VCD的化學(xué)毒作用傷害模型組大鼠原始卵泡及初級卵泡，加速原始和初級卵泡的閉鎖，而致卵泡閉鎖增多，卵巢內(nèi)殘留卵泡減少，促使竇前卵泡和竇狀卵泡的顆粒細胞所分泌之AMH水平下降,卵巢儲備能力降低,相應(yīng)影響FSH升高及E2降低。中藥高劑量組經(jīng)七子益腎理沖湯治療后,原始卵泡數(shù)量增加和閉鎖卵泡減少,FSH水平下降及E2回升，在一定幅度上恢復(fù)卵巢儲備能力。中藥高劑量組AMH上升亦反映七子益腎理沖湯對始基卵泡庫有修復(fù)作用，效果與DHEA相若。

[1] 吳麗婷.七子益腎理沖湯治療肝腎陰虛型卵巢早衰臨床療效觀察[D]．北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2017．

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