循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中好氧反硝化細菌的分離和應用?

陳 釗， 宋協(xié)法， 黃志濤， 李 健， 董登攀， 任 義， 江玉立

(1.中國海洋大學水產(chǎn)學院，山東 青島266003；2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071)

脫氮技術是水質(zhì)凈化、污水處理的重要手段，其中生物脫氮技術因不需要后續(xù)處理、無副產(chǎn)物產(chǎn)生而成為最經(jīng)濟的脫氮方法[13]。生物脫氮技術有著廣泛的應用，其在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中對于水質(zhì)的控制發(fā)揮著重要作用，其中氨氮和亞硝酸鹽因?qū)︷B(yǎng)殖生物具有毒性而受到嚴格控制，一般是利用生物濾池中硝化細菌的硝化作用將氨氮和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為低毒性的硝酸鹽，但硝酸鹽的持續(xù)積累最終也會導致系統(tǒng)的崩潰，所以將硝酸鹽通過反硝化作用轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮，完成氮元素由水域向大氣的轉(zhuǎn)移仍然是必要的過程。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)需要高溶氧以確保其高密度養(yǎng)殖的需求，而傳統(tǒng)的反硝化過程是在厭氧的環(huán)境下進行的[1]，這與循環(huán)水養(yǎng)殖的要求相矛盾，需要額外增加水處理環(huán)節(jié)以實現(xiàn)厭氧反硝化。厭氧反硝化會增加養(yǎng)殖成本、限制循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生產(chǎn)，所以好氧反硝化的發(fā)現(xiàn)從根本上解決了這一矛盾。針對循環(huán)水養(yǎng)殖的特點開展好氧反硝化的相關研究，對于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的脫氮、維持良好的水質(zhì)狀態(tài)具有重要意義。

生物濾池具有十分復雜的生態(tài)結(jié)構，在實現(xiàn)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)脫氮、控制養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)方面起著至關重要的作用。本研究嘗試從循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的生物濾池內(nèi)分離好氧反硝化細菌，開展相關研究，并在此基礎上進行好氧反硝化反應器的應用研究，以期為循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的脫氮技術工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 細菌分離

1.1.1 樣品來源 萊州明波公司珍珠龍膽(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinepheluslanceolatu)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)的生物濾池。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 反硝化富集培養(yǎng)基[14]：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，KNO31.0 g，人工海水(30 ‰的NaCl溶液)1 000 mL，pH≈7.4。

溴百里酚藍(BTB)分離培養(yǎng)基[15]：KNO31.0 g，C6H5Na3O2·2H2O 1.0 g，KH2PO41.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，溴百里酚藍(1 %溶于酒精)1 mL，瓊脂 20.0 g，人工海水1 000 mL，pH=7.2。

活化培養(yǎng)基：KNO31.0 g，C6H5Na3O2·2H2O 1.0 g，KH2PO41.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，人工海水1 000 mL，pH≈7.4。

反硝化性能測定培養(yǎng)基(DM)：C6H5Na3O2·2H2O 1.31 g，CH3COONa 1.10 g，KNO30.361 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO41.0 g，K2HPO45.0 g，NaCl 0.5 g，微量元素溶液1 mL，人工海水999 mL，pH≈7.4。

微量元素溶液[16]：EDTA 50.0 g，ZnSO42.2 g，CaCl25.5 g，MnCl2·4H2O 5.06 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 g，(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.61 g，去離子水1 L，pH= 7.0。

各培養(yǎng)基用前都在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.1.3 細菌富集 將從生物濾池中獲取的濾料在無菌環(huán)境下剪碎后放入裝有90 mL無菌人工海水的三角瓶中，在搖床200 r/min條件下震蕩3 h。隨后取上清液10 mL接種到90 mL富集培養(yǎng)基中，并于30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)，每隔12 h分別用二苯胺試劑和格里斯試劑定性檢驗硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，當硝酸鹽明顯降低且有亞硝酸鹽產(chǎn)生時富集下一代。如此重復富集3次獲得四代富集培養(yǎng)液。

1.1.4 細菌分離純化及鑒定 用無菌人工海水將四代富集培養(yǎng)液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-88個梯度，分別移取0.1 mL稀釋液在BTB平板上稀釋涂布，每個梯度做2個平行，之后在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，待菌落長出后，選取變藍的平板并挑取帶藍色暈圈的單菌落再次劃線(每代皆做2個平行)，如此純化3次獲得四代純化菌落。將菌落一致、生長良好的平板上的菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保藏。

提取菌株DNA進行16S rDNA序列分析，將測序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫進行Blast分析確定菌株種類。

1.2 反硝化性能測定

用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上刮取適量細菌接種到裝有100 mL活化培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，30 ℃、180 r/min條件下活化2天。移取2 mL活化培養(yǎng)液接種到100 mL反硝化測定培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，分別測定其48 h后的硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮的濃度變化。

1.3 反硝化反應器的運行與控制

1.3.1 實驗裝置 如圖1所示，人工污水通過蠕動泵以恒定流速(12.22 mL/min)由反應器底部入水口輸送進反應器，然后從反應器上部出水口流出，進入廢液缸，不再利用。反應器內(nèi)填充190 g K1濾料，濾料為直徑1 cm、高1 cm的內(nèi)十字圓筒結(jié)構，外壁附有縱向突起條帶；濾料密度約為0.96 g/cm3(堆積密度150 kg/m3)，比表面積約850 m2/m3。反應器有效水容積為2.2 L，水力停留時間(HRT)為3 h。反應器浸入配有加熱棒的水槽中施行水浴控溫(水槽內(nèi)持續(xù)充氣攪拌以實現(xiàn)均勻加熱)，溫度控制在(25+1)℃；反應器外壁貼有黑色壁紙以避光；24 h充氣。

圖1 實驗裝置圖Fig. 1 The figure of experimental apparatus

1.3.3 接種 將分離、篩選的菌株分別在25 ℃、180 r/min條件下單獨活化2天。移取每種菌的活化培養(yǎng)液(約3×1010CFU/mL)10 mL到裝有2.2 L人工污水的反硝化反應器中混合接種，24 h充氣，蠕動泵不啟動，穩(wěn)定2天。

1.3.4 水質(zhì)監(jiān)測 在接種后的48 h中，每隔12 h對反應器內(nèi)的水質(zhì)進行取樣分析，檢測硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮、總氮的濃度變化。接種2天后開啟蠕動泵，每天從反應器的進出水口取樣分析，檢測上述4個指標的變化，直至出水口水質(zhì)達到穩(wěn)定。

1.4 水質(zhì)分析方法

氨氮檢測方法為次溴酸鹽氧化分光光度法，亞硝酸鹽的檢測方法為N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，硝酸鹽檢測方法為鋅鎘還原法，總氮檢測方法為過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離

細菌富集階段，經(jīng)二苯胺和格里斯試劑定性檢測，12 h后即有亞硝酸鹽的產(chǎn)生，24 h后硝酸鹽的含量明顯降低。48 h后進行下一代富集。涂布平板后，10-3、10-4和10-53個稀釋度平板上的菌落有利于單菌落的挑取，選取此3個稀釋度平板進行下一代的純化；重復劃線，獲得四代純化菌株。最終分離出8株細菌，分別命名為Z1～Z8。

結(jié)合細菌反硝化性能測定結(jié)果，選擇Z1、Z8 2株脫氮效果較好的細菌進行16S rDNA鑒定，結(jié)果顯示Z1、Z8分別與弧菌屬(Vibrio)的V.neocaledonicus和V.azureus相似度最高，同源性均達99%以上(Genbank序列登錄號分別為KX037098、KX037099)。

2.2 細菌反硝化性能測定

圖2顯示，各菌株硝酸鹽去除率都較高，但都存在一定的亞硝酸鹽和氨氮積累。Z1、Z2、Z3、Z4、Z8菌株亞硝酸鹽、氨氮積累較少，硝酸鹽去除率90%左右、無機氮去除率87 %左右，效果良好；Z5、Z6、Z7亞硝酸鹽、氨氮積累比較嚴重，且硝酸鹽和無機氮去除率相對較低。

圖2 48 h反硝化性能測定結(jié)果Fig. 2 The results of 48h denitrification test

2.3 反硝化反應器的脫氮效果

2.3.1 接種后48 h反應器內(nèi)水質(zhì)變化 將分離、篩選菌株Z1、Z8各自活化后混合接種入反應器。反應器接種后保持24 h充氣，每隔12 h對反應器內(nèi)污水進行取樣分析，檢測硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮和總氮的變化，結(jié)果如圖3所示，相應硝酸鹽和總氮的去除率見圖4。

圖3 反應器接種后48 h內(nèi)水質(zhì)變化Fig. 3 The changes of water quality in the bioreactor during the 48 h after inoculation

圖4 反應器接種后48 h內(nèi)硝酸鹽和總氮去除率變化 Fig. 4 The changes of nitrate and total nitrogen removal rates in the bioreactor during the 48 h after inoculation

由圖3和4可知，48 h內(nèi)硝酸鹽的濃度大幅降低，最終去除率為56.26 %，但從誤差線幅度可知，3個反應器之間差異較大；總氮去除效果微弱，48 h總氮去除率13.98 %；亞硝酸鹽存在顯著積累現(xiàn)象，且積累速率較快，12 h達到峰值(10.88 mg/L)后開始緩慢降低，并有趨于穩(wěn)定的趨勢；氨氮也存在積累現(xiàn)象，最終濃度達到6.87 mg/L。

圖5 生物反應器進出水口亞硝酸鹽變化Fig. 5 Nitrite concentrations change of inlet and outlet water from the bioreactor

圖6 生物反應器進出水口氨氮變化Fig. 6 Ammonia concentrations change of inlet and outlet water from the bioreactor

圖7 生物反應器進出水口硝酸鹽變化Fig. 7 Nitrate concentrations change of inlet and outlet water from the bioreactor

圖8 生物反應器進出水口總氮變化

圖9 生物反應器對硝酸鹽和總氮的去除率Fig. 9 Nitrate and total nitrogen removal rates of the bioreactor

系統(tǒng)啟動一天后，亞硝酸鹽積累十分嚴重，達到37.41 mg/L，說明反硝化過程的的第一階段十分活躍，大量硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽；之后亞硝酸鹽濃度迅速降低，最低濃度為0 mg/L(第14天)，在經(jīng)歷2次波動之后，逐漸趨于穩(wěn)定，實驗結(jié)束時亞硝酸鹽濃度為0.18 mg/L。與反應器接種后48h相比，系統(tǒng)啟動后氨氮積累情況大幅減弱，第一天氨氮濃度為0.69 mg/L，之后出現(xiàn)多次波動，第7天達到峰值2.75 mg/L，最低濃度為0.04 mg/L(第13天)，20 d后逐漸趨于穩(wěn)定，實驗結(jié)束時氨氮濃度為0 mg/L。反應器對硝酸鹽的去除效率非常高，系統(tǒng)啟動后第一天去除率即達到79.04 %，此后歷經(jīng)幾次起伏；9天后達到理想狀態(tài)，除第18～20天去除率在95 %左右，其它時間硝酸鹽去除率都在98 %以上?？偟谙到y(tǒng)啟動初去除效果較弱，第一天去除率只有20.94 %，此后迅速提升，第3天即達到去除率峰值83.17 %，此后歷經(jīng)多次波動，慢慢趨于穩(wěn)定，實驗結(jié)束時總氮去除率為74.40 %。總體來看，反硝化反應器對人工污水的脫氮效果良好，硝酸鹽及總氮去除效果理想，氨氮和亞硝酸鹽積累情況在后期穩(wěn)定后較弱，具有一定的應用價值。

3 討論

Vibrioneocaledonicus、Vibrioazureus都屬于變形菌門(Proteobacteria)伽馬變形菌綱(r-Proteobacteria)弧菌目(Vibrionales)弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬(Vibrio)；Vibrioneocaledonicus是Chalkiadakis[20]等學者于2013年發(fā)現(xiàn)的一株細菌，具有將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的代謝特性；Vibrioazureus是Yoshizawa等學者[21]2009年發(fā)現(xiàn)的一株細菌，同樣具有將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的能力。好氧反硝化細菌一般存在于假單胞菌屬(Pseudomonas)；產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)；副球菌屬(Paracoccus)；芽孢桿菌屬(Bacillus)等[3]，但弧菌屬好氧反硝化細菌鮮有報道。

實驗期間生物反應器出水口水質(zhì)出現(xiàn)多次波動，而且從對應時間的誤差線幅度也可以看出3個反應器在波動期會出現(xiàn)較大差異。反硝化細菌屬于異養(yǎng)微生物，而人工污水C/N較高，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，利于微生物的繁殖；另一方面，反應器直接暴露在室內(nèi)，自然環(huán)境中的微生物也會在其中大量繁殖，使得反應器內(nèi)的群落結(jié)構變得十分復雜，再加上反應器容積太小，很容易受到外界環(huán)境的影響。實驗期間觀察到反應器內(nèi)濾料表面生物膜逐漸增多，后期濾料表面附著了大量生物膜，微生物生命周期短，大量死亡后可能導致水質(zhì)惡化，引起水質(zhì)波動。

4 結(jié)語

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