磺胺類抗生素對(duì)不同革蘭氏陰性菌的毒物興奮效應(yīng)研究

程逸飛, 曾鴻鵠, 于洋, 王大力, 孫昊宇, 林志芬, 莫凌云,*

1. 桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，桂林 541004 2. 污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092 3. 環(huán)境保護(hù)部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心，北京 100029

Hormesis是指生物體在不同劑量化學(xué)物質(zhì)刺激下產(chǎn)生的、以雙相劑量-反應(yīng)曲線為特征的一種適應(yīng)性反應(yīng)，即有毒化學(xué)物質(zhì)對(duì)生物體在高劑量時(shí)表現(xiàn)負(fù)面影響，但在低劑量時(shí)卻表現(xiàn)為有益作用的現(xiàn)象[1]，其中的低劑量通常為低于NOAEL(no observed adverse effect level)的劑量區(qū)間[2-3]。Hormesis效應(yīng)在對(duì)毒物有不同敏感性的個(gè)體和類型之間有著相似的定量特征[4]，Calabrese和Baldwin[5]將其概括為很小的刺激反應(yīng)幅度，很窄的刺激反應(yīng)范圍。最大的刺激反應(yīng)幅度一般不會(huì)超過對(duì)照組的2倍。通常情況下，這種反應(yīng)只比對(duì)照組高30%～60%[3]。有文獻(xiàn)中表明，6%的促進(jìn)率即可認(rèn)為是hormesis效應(yīng)[6]。

目前，在各類生物(包括動(dòng)物、植物、微生物)、各類毒物(包括致癌物和非致癌物)及各類生命現(xiàn)象(包括腫瘤形成、生殖、生長(zhǎng)、壽命及代謝等)中都發(fā)現(xiàn)了hormesis現(xiàn)象。其范圍幾乎涵蓋了包括重金屬化合物、氰化物、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、有機(jī)砷化合物以及農(nóng)藥和一些抗生素在內(nèi)的大量有毒物質(zhì)[7]。Calabrese[8]由此預(yù)測(cè)，hormesis效應(yīng)是一種普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象，并呼吁將hormesis模型替代線性模型與閾值模型而作為劑量-效應(yīng)評(píng)價(jià)的缺省模型。因此，研究hormesis效應(yīng)對(duì)有毒物質(zhì)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。

抗生素自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，被大量用于人類醫(yī)療保健、動(dòng)物養(yǎng)殖和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中，具有種類多、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)?；前奉惪股?SAs)作為一種典型抗生素，它的濫用引起的環(huán)境問題和耐藥性問題日益受到人們的重視[9-15]。在我們前面的研究中發(fā)現(xiàn)，SAs可以對(duì)費(fèi)氏弧菌(Aliivibriofischeri)的發(fā)光產(chǎn)生hormesis效應(yīng)，并且認(rèn)為可能與其群體感應(yīng)(quorum-sensing)系統(tǒng)密切相關(guān)[16]。群體感應(yīng)這個(gè)術(shù)語(yǔ)由Fuqua等[17]在1994年被提出，其定義為當(dāng)細(xì)菌的數(shù)量達(dá)到一定的密度(quorum)時(shí)才能發(fā)生的感應(yīng)現(xiàn)象(sensing)。群體感應(yīng)最早由美國(guó)的Nealson等[18]在A.fischeri中觀察到的，在該細(xì)菌中群體感應(yīng)控制著生物發(fā)光現(xiàn)象。直到20世紀(jì)90年代的研究發(fā)現(xiàn)，類似于發(fā)光菌A.fischeri的群體感應(yīng)現(xiàn)象存在于其他的革蘭氏陰性菌中，如植物腫脹病菌(Agrobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)等[19](如圖1)。

圖1 大腸桿菌和費(fèi)氏弧菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)注：C6、C8、AinS、AinR、LuxR、LuxI、SdiA、FtsZ分別是信號(hào)分子C6、信號(hào)分子C8、AinS蛋白、AinR蛋白、LuxR蛋白、LuxI蛋白、SdiA蛋白、FtsZ蛋白。Fig. 1 Quorum sensing system of Escherichia coli and Aliivibrio fischeriNote：C6, C8, AinS, AinR, LuxR, LuxI, SdiA, FtsZ are respectively N-3-oxo-hexanoyl homoserine lactone, octanoyl homoserine lactone, AinS protein, AinR protein, LuxR protein, LuxI protein, SdiA protein, FtsZ protein.

但是不同的革蘭氏陰性菌其QS系統(tǒng)不同。比如典型的革蘭氏陰性菌A.fischeri，它可以通過自身合成信號(hào)分子，按照信號(hào)分子的不同分為2類：AHL信號(hào)分子和AI-2信號(hào)分子。其中AHL信號(hào)分子根據(jù)碳鏈的長(zhǎng)度不同分為C6和C8 2種，分別由LuxR/LuxI和AinR/AinS調(diào)節(jié)，相互作用共同調(diào)節(jié)A.fischeri的發(fā)光[16]。而對(duì)于另一種革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)，E.coli無(wú)法通過自身產(chǎn)生AHL信號(hào)分子，但其存在著LuxR蛋白的同源蛋白SdiA[20]，其下游蛋白為FtsZ[21]。外源的 AHL能作用于E.coli的SdiA蛋白，促進(jìn)下游蛋白FtsZ的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)[22]。那么具有不同的QS系統(tǒng)的E.coli和A.fischeri，SAs是否對(duì)它們都具有hormesis效應(yīng)呢？

本文以大腸桿菌(Escherichiacoli)為受試生物，選取了4種典型的磺胺類抗生素——磺胺氯噠嗪 (SCP)、磺胺吡啶 (SPY)、磺胺甲氧噠嗪 (SMP)、磺胺多辛 (SDX)為受試化合物，測(cè)定了4種抗生素對(duì)E.coli的0～24 h 的毒性作用，以O(shè)D600作為測(cè)試終點(diǎn)進(jìn)行毒性表征?？疾炝瞬煌瑵舛扰囵B(yǎng)基下磺胺類抗生素對(duì)大腸桿菌是否能產(chǎn)生hormesis效應(yīng)；對(duì)比了不同磺胺對(duì)同為革蘭氏陰性菌的大腸桿菌和費(fèi)氏弧菌的hormesis效應(yīng)，并基于2種菌的QS系統(tǒng)對(duì)hormesis效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行了分析。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑和生物

本實(shí)驗(yàn)所用的4種磺胺類藥物，即SCP、SPY、SMP、SDX均購(gòu)買自 Sigma-Aldrich Co. LLC (上海)，具體試劑信息如表1。進(jìn)行毒性測(cè)試所用化合物配制使用助溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli)MG1655購(gòu)買自Biovector 生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基的配方如下：1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸膏和1%NaCl，pH調(diào)節(jié)到7.0～7.2。Mueller-Hinton (MH)培養(yǎng)基，其配方如下：0.3%的牛肉粉、1.75%酸水解酪蛋白和0.15%淀粉，pH調(diào)節(jié)至7.2～7.4。配好后，放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌21 min。

1.3 抗生素對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)抑制的測(cè)定

大腸桿菌接種到5 mL的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至OD600(600 nm 處的光密度)到0.5左右。將此菌液稀釋1×105倍后，加入100孔板中。孔板中每個(gè)孔按照“80 μL培養(yǎng)基+80 μL藥物+40 μL菌液”的方式配制成200 μL的體系。然后將200孔板放入37 ℃、180 r·min-1的自動(dòng)檢測(cè)儀中，連續(xù)檢測(cè)24 h的吸光度(600 nm)情況。單一毒性計(jì)算方式按照下式：

表1 實(shí)驗(yàn)藥品信息Table 1 Experimental drug information

(1)

式(1)中，Inhibition為第i組實(shí)驗(yàn)濃度下的抑制率；OD600,0為對(duì)照組的吸光度；OD600，i為抗生素濃度為i時(shí)大腸桿菌的OD600。

1.4 Hormesis效應(yīng)曲線的擬合

本實(shí)驗(yàn)的擬合模型選用Deng等[23]提出的Hormesis擬合模型，即：

(2)

式(2)中，x表示受試化合物的濃度；m表示效應(yīng)底值；a表示最低劑量點(diǎn)的中值；b表示a點(diǎn)處的斜率；p表示最高劑量點(diǎn)的中值；q表示p點(diǎn)處的斜率。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 SAs在原倍MH培養(yǎng)基下對(duì)E. coli的hormesis效應(yīng)

為了考察磺胺類抗生素對(duì)E.coli的hormesis效應(yīng)，我們首先測(cè)定了磺胺多辛 (SDX)對(duì)E.coli的生長(zhǎng)的影響，并對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間進(jìn)行了差異顯著性檢驗(yàn)，在24 h下的劑量-效應(yīng)曲線和差異顯著性檢驗(yàn)如圖2所示(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異顯著性分別由*(P<0.05)，**(P<0.01)，***(P<0.005)表示。

從圖2可以看出，SDX在原倍MH培養(yǎng)基的條件下對(duì)E.coli生長(zhǎng)的劑量-效應(yīng)曲線表現(xiàn)為傳統(tǒng)的S型劑量-效應(yīng)曲線，在低濃度段沒有表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用。但是，Vichi等[24]的研究表明，只有在部分消耗的培養(yǎng)基中，阿霉素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)才存在hormesis效應(yīng)。Belz等[25]也發(fā)現(xiàn)，銀膠菊堿對(duì)萵苣根生長(zhǎng)的hormesis效應(yīng)只發(fā)生在低于最大濃度的培養(yǎng)條件下。以此推測(cè)，培養(yǎng)基的濃度對(duì)E.coli的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生影響，改變培養(yǎng)基的濃度或許會(huì)導(dǎo)致SAs對(duì)E.coli生長(zhǎng)存在hormesis效應(yīng)。

2.2 SAs在不同濃度MH培養(yǎng)基下對(duì)E.coli的hormesis效應(yīng)

我們考察了在不同濃度培養(yǎng)基條件下(0.4倍、0.6倍、0.8倍MH培養(yǎng)基)SDX對(duì)E.coli生長(zhǎng)的影響，在24 h下的劑量-效應(yīng)曲線如圖3所示。

從圖3中可以看出，在0.4MH和0.6MH培養(yǎng)基中，SDX對(duì)E.coli的生長(zhǎng)均存在顯著的促進(jìn)作用，SDX對(duì)E.coli生長(zhǎng)的最大促進(jìn)率(Emax)約為22.33%；而在0.6倍的MH培養(yǎng)基中，Emax約為17.78%；在0.8倍的MH培養(yǎng)基中，SDX對(duì)E.coli的生長(zhǎng)促進(jìn)作用則十分微弱且不顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過改變培養(yǎng)基的濃度，SDX對(duì)E.coli可以產(chǎn)生hormesis效應(yīng)。且隨著培養(yǎng)基濃度的減小，產(chǎn)生的hormesis效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，在0.4MH培養(yǎng)基下產(chǎn)生的hormesis效應(yīng)最強(qiáng)。

圖2 原倍MH培養(yǎng)基下，SDX對(duì)E. coli生長(zhǎng)的劑量-效應(yīng)曲線和顯著性檢驗(yàn)Fig. 2 Dose-response curve and significance test of SDX on Escherichia coli growth under MH medium

圖3 不同濃度MH培養(yǎng)基下，SDX對(duì)E. coli生長(zhǎng)的劑量-效應(yīng)曲線和顯著性檢驗(yàn)注： a、b、c分別為0.8MH、0.6MH、0.4MH下，SDX對(duì)E.coli生長(zhǎng)的劑量-效應(yīng)曲線和顯著性檢驗(yàn)。Fig. 3 Dose-response curves and significance test of SDX on growth of E. coli under different concentrations of MH mediaNote: a, b, c are respectively dose-response curve and significance test of SDX on E. coli growth under 0.8, 0.6, 0.4-fold dilutions of MH media.

除了培養(yǎng)條件外，時(shí)間也是決定hormesis是否發(fā)生的一個(gè)重要因素。Calabrese等[7]指出，hormesis只可能在暴露發(fā)生后或發(fā)生過程中的某些特定時(shí)間發(fā)生?？梢?，hormesis效應(yīng)的產(chǎn)生受到培養(yǎng)條件、時(shí)間等多因素的影響，所以這種因培養(yǎng)條件改變而引起horemsis效應(yīng)改變的現(xiàn)象可能同樣存在于其他的化合物暴露的情況中。

2.3 SAs在0.4MH培養(yǎng)基下對(duì)E. coli的hormesis效應(yīng)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SAs對(duì)E.coli生長(zhǎng)的促進(jìn)作用是否具有普遍性，接下來(lái)我們選取了另外3種SAs對(duì)E.coli在0.4MH培養(yǎng)基下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，在0.4MH培養(yǎng)基的條件下，SCP、SPY和SMP對(duì)E.coli均存在顯著的促進(jìn)作用，Emax分別為13.23%、18.72%和15.37%。即在0.4MH培養(yǎng)基的條件下，3種SAs對(duì)E.coli均存在hormesis效應(yīng)，且最大促進(jìn)率均在10%和20%之間。

那么對(duì)于與E.coli具有不同QS系統(tǒng)的A.fischeri，SAs是否對(duì)它具有hormesis效應(yīng)呢？如果有，SAs對(duì)E.coli與對(duì)A.fischeri的hormesis之間是否存在什么聯(lián)系？這樣的聯(lián)系能否延伸到所有革蘭氏陰性菌？

圖4 0.4倍MH培養(yǎng)基下，SAs對(duì)E. coli生長(zhǎng)的劑量-效應(yīng)曲線和顯著性檢驗(yàn)注：a、b、c分別為0.4MH培養(yǎng)基下，SCP、SPY、SMP對(duì)E. coli的生長(zhǎng)劑量-效應(yīng)曲線和顯著性檢驗(yàn)。Fig. 4 The dose-response curve and significance test of SAs to E. coli growth under 0.4-fold dilutions of MH mediaNote: a, b, c are respectively dose-response curve and significance test of SCP, SPY, SMP on E. coli growth under 0.4-fold dilutions of MH media.

圖5 SAs對(duì)Aliivibrio fischeri發(fā)光的劑量效應(yīng)曲線Fig. 5 The dose-response curve of SAs on A. fischeri luminescence

2.4 SAs對(duì)E. coli與對(duì)A. fischeri的hormesis效應(yīng)的比較

為了找到SAs對(duì)E.coli與對(duì)A.fischeri的hormesis效應(yīng)之間的聯(lián)系，我們對(duì)比了本文SAs作用E.coli的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期SAs作用A.fischeri的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[26](圖5)。

根據(jù)圖5可知，6種SAs對(duì)A.fischeri的最大促進(jìn)率達(dá)到75%左右，而SAs對(duì)E.coli的最大促進(jìn)率僅為15%左右(圖4)。綜上所述，SAs對(duì)E.coli和A.fischeri都存在hormesis效應(yīng)，但對(duì)E.coli的hormesis效應(yīng)明顯要弱于對(duì)A.fischeri的hormesis效應(yīng)。

同作為革蘭氏陰性菌，是什么導(dǎo)致了hormesis效應(yīng)上的差異？

檢測(cè)終點(diǎn)不同可能是導(dǎo)致hormesis效應(yīng)差異的重要原因之一[26]。A.fischeri是以其發(fā)光值作為測(cè)試終點(diǎn)，是分子水平上的檢測(cè)；而E.coli是以細(xì)菌密度為測(cè)試終點(diǎn)，是個(gè)體水平上的檢測(cè)。兩者相比，發(fā)光值作為分子水平上的檢測(cè)會(huì)更加敏感，這可能導(dǎo)致了2種菌之間hormesis效應(yīng)上的差異。

除了檢測(cè)終點(diǎn)的不同之外，E.coli與A.fischer之間存在著不同的群體感應(yīng)系統(tǒng)可能是導(dǎo)致hormesis效應(yīng)差異的另一重要原因。在低劑量時(shí)，SAs主要通過以下3個(gè)途徑促進(jìn)A.fischer的發(fā)光：1) SAs與LuxR結(jié)合，形成LuxR～SA復(fù)合物，該復(fù)合物啟動(dòng)細(xì)菌的QS現(xiàn)象最終促進(jìn)A.fischeri發(fā)光[23]。2) SAs可以促進(jìn)LitR蛋白的生成，進(jìn)而促進(jìn)luxR的表達(dá)，產(chǎn)生更多的LuxR蛋白，促進(jìn)發(fā)光[16]。3) SAs可以促進(jìn)細(xì)菌內(nèi)LuxI的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)菌體內(nèi)自誘導(dǎo)物AHL的產(chǎn)生，自誘導(dǎo)物AHL與LuxR蛋白結(jié)合，促進(jìn)下游熒光素酶的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)A.fischeri發(fā)光[27]。

在E.coli中存在著LuxR的同源蛋白SdiA[28]。根據(jù)Sun等[29]的研究可知，SAs可以通過作用于E.coli的SdiA蛋白，導(dǎo)致了sdiA mRNA的表達(dá)量增加，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)菌生長(zhǎng)。此過程類似于SAs作用于A.fischeri的LuxR/LuxI群體感應(yīng)系統(tǒng)。但相比之下，A.fischeri的群體感應(yīng)系統(tǒng)更加復(fù)雜，因此可能導(dǎo)致SAs對(duì)于A.fischeri的hormesis效應(yīng)比對(duì)E.coli更強(qiáng)。

可見，SAs對(duì)于此2類不同的測(cè)試生物，不同的測(cè)試終點(diǎn)，只要在合適的條件下都可以產(chǎn)生hormesis效應(yīng)。本研究通過SAs作用A.fischeri和E.coli的0～24 h慢性毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了SAs對(duì)于這2種不同的革蘭氏陰性菌均存在hormesis效應(yīng)，進(jìn)而通過分析2種菌的QS系統(tǒng)，推測(cè)在合適的條件下，SAs可以通過作用于QS系統(tǒng)，使所有與A.fischeri和E.coli存在類似的QS系統(tǒng)的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生Hormesis效應(yīng)。本研究的結(jié)果為抗生素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供了依據(jù)，并且對(duì)未來(lái)關(guān)于hormesis效應(yīng)的研究和關(guān)于革蘭氏陰性菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

通訊作者簡(jiǎn)介：莫凌云(1973-)，女，碩士生導(dǎo)師，副研究員，主要研究方向?yàn)榛旌衔廴疚锒纠韺W(xué)。

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