異源表達(dá)WZY2-1基因提高擬南芥植株抗旱性

強(qiáng)治全，楊文博，張帥 ，于正陽，史學(xué)英，王鑫，朱維寧，張林生*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室, 陜西 楊凌712100;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；3.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安710069)

脫水素(dehydrins，DHNs)屬于胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA)第二家族[1]。該類蛋白具有3個保守的區(qū)域：K、Y和S片段。其中，K片段(EKKGIMDKIKEKLPG)是脫水素共有的，它可以形成兼性α-螺旋，在植物失水情況下，α-螺旋的形成能夠防止細(xì)胞內(nèi)蛋白變形和細(xì)胞膜損傷[2]。此外，有些脫水素K片段之間富含極性氨基酸，稱作Φ片段，它可能參與了細(xì)胞質(zhì)組分的相互作用[3]。S片段由一段串聯(lián)的絲氨酸(SSSSS)組成，可以被蛋白激酶磷酸化，與脫水素的入核有關(guān)[4]。Y片段的保守序列為(VTDEYGNP)，目前關(guān)于Y片段的功能尚不清楚。根據(jù)脫水素的K、Y和S片段組合，將脫水素分成5個亞型：YnSKm、Kn、KnS、SKn和YnKm型[5]。

近些年，在植物抗逆分子機(jī)理研究中，脫水素已成為植物耐逆程度的分子指標(biāo)。目前已經(jīng)從玉米(Zeamays)[6]、大麥(Hordeumvulgare)[7]、高粱(Sorghumbicolor)[8]、水稻(Oryzasativa)[9]等多種農(nóng)作物中克隆和分離出脫水素基因。脫水素的亞細(xì)胞定位多種多樣，但主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。通過對仙人掌(Opuntiastricta)脫水素OpsDHN1亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)OpsDHN1蛋白主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)[10]。Yang等[11]研究發(fā)現(xiàn)小麥WZY2蛋白的亞細(xì)胞定位受外界環(huán)境條件的影響，在正常情況下，小麥(Triticumaestivum)WZY2蛋白主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，但在低溫處理下，一些WZY2蛋白向細(xì)胞膜聚集。許多實(shí)驗證明脫水素可以作為酶的保護(hù)劑，Drira等[12]對小麥DHN5及突變體研究表明，低溫脅迫下DHN5及突變體可以保護(hù)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性，并且認(rèn)為K片段可能起重要作用。與此類似的還有WZY2[11]、WDHN1[13]等脫水素。脫水素在植物抵御各種逆境脅迫中具有重要作用，Saibi等[14]將大麥的脫水素基因DHN5轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsisthaliana)，獲得的轉(zhuǎn)基因株系具有較強(qiáng)的抗鹽性；Liu等[1]將番茄(Lycopersiconesculentum)的脫水素基因ShDHN過表達(dá)，增強(qiáng)了番茄對干旱、低溫、鹽等多種脅迫的耐受性；相反的，Chen等[15]將辣椒(Capsicumannuum)的脫水素基因CaDHN1缺失，獲得了對低溫、鹽和滲透脅迫敏感性植株。

小麥WZY2-1基因全長1740 bp，編碼579個氨基酸，分子量約60 kDa，含有9個保守的K片段，屬于典型的Kn型脫水素。研究表明，WZY2-1基因受干旱、低溫和鹽漬脅迫誘導(dǎo)[16]。本研究對WZY2-1蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，研究了溫度脅迫下WZY2-1蛋白對LDH酶活性的影響，并獲得了轉(zhuǎn)WZY2-1基因的擬南芥植株，對轉(zhuǎn)基因植株干旱耐逆性進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試擬南芥(生態(tài)型 Columbia)用70%乙醇表面滅菌1 min，然后用10%的NaClO溶液消毒5 min，用無菌水沖洗3次。將無菌的擬南芥種子鋪在0.5 MS固體培養(yǎng)基上(pH 5.8)，4 ℃處理3 d，移至光照培養(yǎng)箱[16 h 光照, 8 h 黑暗, (22±1) ℃]，生長7 d后，移栽至9 cm的栽培盆中，于培養(yǎng)室[16 h 光照, 8 h 黑暗, (22±1) ℃]中培養(yǎng)。

1.2 小麥WZY2-1基因亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建與亞細(xì)胞定位分析

通過對pBI121載體改造，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，涂板，37 ℃培養(yǎng)，挑單克隆，搖菌，菌液PCR檢測，用Xho I和Sal I雙酶切檢測，陽性克隆測序(上海生工生物工程有限公司)。提取構(gòu)建的亞細(xì)胞定位載體pBI121-WZY2-1-GFP(天根公司)，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3301，涂板，28 ℃培養(yǎng)，挑單克隆，搖菌，菌液PCR檢測，獲得含有pBI121-WZY2-1-GFP載體的農(nóng)桿菌。

將含有pBI121-WZY2-1-GFP農(nóng)桿菌接種含有50 μg·mL-1卡納抗生素和利福平的YEB培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至OD600到0.6，2800 r·min-1離心10 min，收集菌體，用含有200 mmol·L-1的乙酰丁香酮、10 mmol·L-1的MgCl2和0.02%的Sillwet-77的0.5 MS液體培養(yǎng)基懸浮，室溫放置4 h，作為浸染液。取新鮮的洋蔥切開鱗莖，用解剖刀挑取1 cm2的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，置于0.5 MS固體培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)24 h。將預(yù)培養(yǎng)的洋蔥表皮細(xì)胞在浸染液中浸泡30 min，濾干菌液，平放于0.5 MS固體培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱(16 h 光照, 8 h 黑暗, 25 ℃)培養(yǎng)2 d。取培養(yǎng)2 d的洋蔥表皮細(xì)胞，用1 mg·mL-1的DAPI溶液染色5 min，制片，熒光顯微鏡觀察。

1.3 LDH酶保護(hù)實(shí)驗

取20 μL將乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)(EC1.1.1.27, Sigma)分別與WZY2-1蛋白、BSA等體積混合，對混合樣品進(jìn)行不同脅迫處理。冷融脅迫：將樣品用液氮速凍30 s，25 ℃水浴解凍5 min。45 ℃處理：將樣品經(jīng)45 ℃處理30 min。取40 μL脅迫處理的樣品加入到710 μL的反應(yīng)體系[10 mmol·L-1Na3PO4，pH 7.4，10 mmol·L-1丙酮酸，0.2 mmol·L-1還原性輔酶I(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)]中，用SpectraMax M2酶標(biāo)儀測定A340吸光值的減少值。測定程序：25 ℃水浴30 s，每隔15 s測定1次，持續(xù)測定5 min。以未處理的LDH酶活性為100%，實(shí)驗重復(fù)3次。LDH酶殘留活性計算：LDH酶殘留活性=(處理Δ340/未處理Δ340)×100%。

1.4 小麥WZY2-1基因過表達(dá)載體構(gòu)建與擬南芥轉(zhuǎn)化

設(shè)計含有Xba I和Sac I酶切位點(diǎn)的引物(TGF: 5′-GCTCTAGAATGCACGACGCCGAC-3′;TGR: 5′-CGAGCTCTTAGTTCAGTCCAGGC-3′)，PCR擴(kuò)增WZY2-1基因的cDNA全長序列，回收PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物連接至pBI121載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，涂板，37 ℃培養(yǎng)，挑單克隆，搖菌，菌液PCR檢測，陽性克隆測序(上海生工生物工程有限公司)。將過表達(dá)載體pBI121-WZY2-1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3301，28 ℃培養(yǎng)，挑單克隆，搖菌，菌液PCR檢測，獲得含pBI121-WZY2-1載體的重組菌。利用花絮浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，收取T0代種子。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選和RT-PCR分析陽性植株中WZY2-1基因的表達(dá)

將收取的T0代種子鋪在含有30 μg·mL-1卡納抗生素的0.5 MS培養(yǎng)基(pH 5.8)上培養(yǎng)，將綠色幼苗轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土培養(yǎng)20 d，提取葉片基因組DNA(天根公司)。上游引物包含pBI121載體本身序列，下游引物位于WZY2-1基因序列內(nèi)部，引物序列JCF: 5′-AGCTGCCTGGACTGAACT-3′; JCR: 5′-GCCTCTTCGCTATTACGCCAGGC-3′。以提取的T1代擬南芥基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測，收取陽性植株種子，繼續(xù)培養(yǎng)篩選，直到獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因株系種子。

將消毒的野生型擬南芥和3個株系的T3代過表達(dá)WZY2-1的轉(zhuǎn)基因純合體種子鋪種在0.5 MS培養(yǎng)基上，4 ℃培養(yǎng)3 d后，于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周。按照TRIzol試劑(Invitrogen)的操作說明, 提取野生型和T4代轉(zhuǎn)基因植株幼苗總RNA。以提取的RNA為模板, 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)的操作說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以擬南芥的Actin2基因為內(nèi)參，引物序列ActF: 5′-TATCGCTGACCGTATGAG-3′; ActR: 5′-CTGAGGGAAGCAAGAATG-3′，用WZY2-1基因特異性引物(WF: 5′-CGGAGTGACCGATAAGG-3′; WR: 5′-TGCCAGTTGTTTCGTTGT-3′)進(jìn)行RT-PCR分析，PCR反應(yīng)體系25 μL, 包括2×SYBR Premix 12.5 μL, 模板2 μL, 上、下游引物各1 μL。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s, 然后95 ℃ 5 s, 55 ℃ 20 s, 39個循環(huán)。

1.6 干旱脅迫下轉(zhuǎn)WZY2-1基因擬南芥表型分析

取同一時間種植和收獲的野生型擬南芥和T3代轉(zhuǎn)WZY2-1的擬南芥3個株系種子在4 ℃放置3 d，種子消毒后，鋪于0.5 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，萌發(fā)后移栽至小花盆，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室培養(yǎng)。正常條件生長20 d后，脫水處理14 d后，觀察野生型和轉(zhuǎn)基因植株表型。

1.7 干旱脅迫下轉(zhuǎn)WZY2-1基因擬南芥生理指標(biāo)測定

將生長20 d的野生型和T3代轉(zhuǎn)WZY2-1基因的擬南芥，干旱脅迫36 h，取成熟葉片，測定其生理指標(biāo)。試驗方法見文獻(xiàn)[14,17-18]。采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量；采用分光光度法測定葉綠素和MDA的含量；相對含水量按照公式：相對含水量=[(鮮重-干重)/鮮重]×100%，實(shí)驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥WZY2-1基因載體構(gòu)建與亞細(xì)胞定位分析

對pBI121載體進(jìn)行改造，獲得pBI121-WZY2-1-GFP融合蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10中。對陽性克隆測序，測序結(jié)果表明，亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建成功，命名pBI121-WZY2-1-GFP(圖1A)。

將pBI121-WZY2-1-GFP載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3301，菌液PCR獲得陽性重組菌。通過農(nóng)桿菌浸染洋蔥表皮細(xì)胞，WZY2-1蛋白在整個細(xì)胞中的亞細(xì)胞位置如圖1B所示。通過對熒光信號分析，推測WZY2-1蛋白主要分布于細(xì)胞核和細(xì)胞膜。

圖1 WZY2-1蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.1 Subcellular localization of WZY2-1 protein (A) 亞細(xì)胞定位載體示意圖。35S-pro代表花椰菜花葉病毒的啟動子；WZY2-1代表WZY2-1蛋白編碼區(qū)去掉終止子；GFP代表綠色熒光蛋白；NOS代表胭脂堿合成酶基因終止序列。(B)WZY2-1融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞的熒光顯微觀測圖(Bar=100 μm)。GFP通道、DAPI通道(細(xì)胞核)和明場都進(jìn)行展示。 (A) Diagram of the constructs of pBI121-WZY2-1-GFP used for subcellular localization. 35S-Pro, Cauliflower mosaic virus 35S promoter; WZY2-1, the WZY2-1 coding region without the stop codon; GFP, green fluorescent protein; NOS, nopaline synthase terminator. (B) Fluorescent microscopic images of WZY2-1-GFP fusion protein in onion epidermal cells (Bar=100 μm). The GFP channel, DAPI channel (nucleus) and bright-field images were showed.

2.2 非生物脅迫下WZY2-1蛋白保護(hù)LDH酶活性

為了研究WZY2-1蛋白對LDH酶的保護(hù)作用，將 LDH酶分別與WZY2-1蛋白、BSA等體積混合，對混合樣品進(jìn)行不同脅迫處理后，測定LDH酶活性(圖2)。結(jié)果表明，凍融處理后，Na3PO4緩沖液LDH幾乎沒有保護(hù)作用，BSA和WZY2-1蛋白分別能夠維持70%和75%的LDH酶活性；45 ℃處理后，Na3PO4緩沖液同樣沒有保護(hù)作用，BSA和WZY2-1蛋白分別能夠維持71%和58%的LDH酶活性。說明WZY2-1蛋白在低溫和高溫下具有顯著的LDH酶的保護(hù)作用。

圖2 冷融及45 ℃脅迫下WZY2-1蛋白對LDH酶活力的保護(hù)Fig.2 WZY2-1 protected LDH activity from freezing-thawing and 45 ℃ stresses in vitro 柱狀圖上星號表示Buffer和BSA、WZY2-1對LDH酶活性保護(hù)的差異顯著性 (*, P<0.05; **, P<0.01)。Different asterisk on top of bars indicate the significant differences of the LDH activity between Buffer and BSA or WZY2-1 protein (*, P<0.05; **, P<0.01).

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥中WZY2-1基因的表達(dá)

圖3 WZY2-1基因在野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥表達(dá)量Fig.3 Relative expression level of WZY2-1 in the wild-type and the transgenic lines 柱狀圖上星號表示野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因(L1、L3、L6)植株WZY2-1基因表達(dá)水平的差異顯著性 (*, P<0.05; **, P<0.01)。Different asterisk on top of bars indicate the significant differences of the relative expression level between wild-type (WT) and transgenic A. thaliana(L1，L3 and L6) (*, P<0.05; **, P<0.01).

為了進(jìn)一步研究WZY2-1在植物中的功能，構(gòu)建pBI121-WZY2-1轉(zhuǎn)基因載體。通過花絮浸染法獲得了T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。通過卡納抗生素篩選和基因組DNA的PCR檢測，獲得T1代陽性植株，收取T1代種子。繼續(xù)篩選，最終獲得了T3代純合轉(zhuǎn)基因株系種子。

提取3個株系T3代轉(zhuǎn)基因純合株系的RNA，通過實(shí)時熒光定量PCR分析WZY2-1基因的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，表明WZY2-1基因能夠在轉(zhuǎn)基因株系中過表達(dá)。

2.4 干旱脅迫下轉(zhuǎn)WZY2-1基因擬南芥表型分析

將正常生長20 d的擬南芥植株脫水處理14 d后，表型觀測如圖4所示，從圖看出轉(zhuǎn)基因植株葉片萎蔫面積比野生型植株少，并且轉(zhuǎn)基因植株的葉片也比野生型大。說明異源過表達(dá)小麥WZY2-1基因可以提高擬南芥植株干旱脅迫的耐受性。

圖4 干旱脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片萎蔫程度Fig.4 The leaves wilting degree of wild-type and transgenic A. thaliana under dehydration stress

2.5 干旱脅迫下轉(zhuǎn)WZY2-1基因擬南芥生理指標(biāo)分析

實(shí)驗測定脅迫處理36 h后轉(zhuǎn)WZY2-1基因和野生型擬南芥的相對含水量、脯氨酸、葉綠素和MDA含量(圖5)。從結(jié)果可知，正常生長情況下，轉(zhuǎn)基因植株較野生型植株生理指標(biāo)差異不明顯，但在干旱脅迫36 h后，轉(zhuǎn)基因株系L1、L3、L6的相對含水量可達(dá)71.0%～71.9%，而野生型擬南芥相對含水量只有65.6%；轉(zhuǎn)基因植物脯氨酸含量比野生型擬南芥分別高33.2%、15.7%和38.5%；葉綠素含量比野生型分別高13.9%、10.3%和7.3%；相反的，轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量比野生型分別低33.7%、33.3%和33.5%。綜上結(jié)果表明，小麥WZY2-1基因可以提高擬南芥對干旱引起的氧化脅迫抵抗能力。

圖5 干旱脅迫下野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥的生理指標(biāo)Fig.5 Analysis of physiological indexes of wild-type and transgenic A. thaliana under drought stress 柱狀圖上星號表示野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因(L1、 L3 和 L6)生理指標(biāo)的差異顯著性(*, P<0.05; **, P<0.01)。Different asterisk on top of bars indicate the significant differences of the physiological indexes between wild-type(WT)and transgenic A. thaliana(L1，L3 and L6)(*, P<0.05; **, P<0.01).

3 討論

解析植物抗逆分子機(jī)制，有利于獲得優(yōu)良抗逆性狀的作物，以提高作物的產(chǎn)量。干旱是影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量的主要因素之一。脫水素作為植物抗逆蛋白的重要成員，響應(yīng)干旱、低溫、高溫等多種逆境脅迫[19]。脫水素具有較強(qiáng)的親水性，在細(xì)胞缺水的情況下，可以充當(dāng)溶劑分子，防止細(xì)胞內(nèi)蛋白的聚集失活[5]。脫水素亞細(xì)胞定位多種多樣，但主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，也有定位在線粒體、葉綠體和細(xì)胞膜等[10,20-21]。本研究將WZY2-1-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞瞬時表達(dá)，觀測結(jié)果發(fā)現(xiàn)該融合蛋白主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜。許多研究發(fā)現(xiàn)脫水素入核與S片段相關(guān)，然而WZY2-1蛋白不含S片段，這與先前研究結(jié)果一致：S片段與脫水素入核相關(guān)但不是必需的[22]。

人們研究發(fā)現(xiàn)脫水素可以結(jié)合金屬離子和其他生物大分子，像蛋白質(zhì)、核苷酸以及帶負(fù)電的磷脂分子等。認(rèn)為在逆境環(huán)境下脫水素具有酶的保護(hù)劑、離子緩沖劑、膜的穩(wěn)定劑及分子伴侶等功能[23]。脫水素作為酶的保護(hù)劑主要通過阻止逆境脅迫下的蛋白聚集，但是對于其具體機(jī)制尚不清楚。LDH酶是一種冷敏感性酶，已經(jīng)被用來研究脫水素的酶保護(hù)功能參照物。本研究表明，小麥WZY2-1蛋白具有保護(hù)溫度脅迫下LDH酶活性的功能。目前普遍認(rèn)為，脫水素保護(hù)LDH酶活性的機(jī)制，是通過在蛋白外圍形成“分子盾”保護(hù)蛋白的活性[20]。

植物遭受逆境脅迫會積累大量的超氧陰離子，引起細(xì)胞膜氧化。脯氨酸作為滲透物質(zhì)，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量往往決定植物的抗旱能力[24]。對野生型和轉(zhuǎn)WZY2-1基因的擬南芥植株脯氨酸含量的分析表明，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株脯氨酸含量較高。光合作用是植物積累有機(jī)物的重要過程，而植物進(jìn)行光合作用需要大量葉綠素。在干旱條件下，植物不僅會引起細(xì)胞膜受損，也會影響葉綠素的合成，導(dǎo)致植物光合效率降低[25]。本研究表明，轉(zhuǎn)小麥WZY2-1基因的擬南芥植株具有較高的葉綠素含量。丙二醛是膜脂過氧化的產(chǎn)物，植物體內(nèi)丙二醛含量是衡量植物遭受氧化脅迫程度的重要指標(biāo)[14]。本實(shí)驗測定結(jié)果表明，野生型擬南芥較轉(zhuǎn)基因植株具有更高的丙二醛含量。綜上結(jié)果表明，異源表達(dá)小麥WZY2-1基因可以提高擬南芥的干旱脅迫耐受性。

4 結(jié)論

通過對WZY2-1蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，WZY2-1蛋白主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜。實(shí)驗還分析了溫度脅迫下WZY2-1蛋白對LDH酶的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)WZY2-1蛋白可以保護(hù)LDH酶的活性，還獲得了轉(zhuǎn)WZY2-1基因的擬南芥植株，通過表型和生理指標(biāo)研究表明，小麥WZY2-1基因可以提高擬南芥對干旱脅迫的耐受性。

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