大鼠慢性不可預測溫和應激與小鼠社會挫敗抑郁癥模型的建立與行為學評價

肖 婷 馬天陽 徐祥清 王克威.2

1. 北京大學藥學院藥理學系，北京，100871，中國

2. 青島大學藥學院藥理學系，青島，266071，中國

重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是現(xiàn)代社會常見的精神疾病，主要表現(xiàn)為情緒低落，對任何事情不感興趣，充滿孤獨感以及具有自殺傾向［1］。據(jù)統(tǒng)計，到2020年，抑郁癥將成為繼心血管疾病之后影響人們生活質量的第二大疾?。?-3］。盡管重度抑郁癥給個人和社會生活帶來了嚴重負擔，針對重度抑郁癥治療的有效措施卻是有限的。究其原因主要是對重度抑郁癥的病生理機制不甚了解［4］。因此，有必要建立可靠的疾病動物模型，探究重度抑郁癥的病生理過程，發(fā)現(xiàn)關鍵的可干預的分子靶標。

重度抑郁癥動物模型必須滿足三個標準，即癥狀相符（face validity）、致病因素一致（construct validity）和能被抗抑郁藥治療（predictive validity）［5-6］。癥狀相符是指動物模型要與重度抑郁癥患者具有相同的表型，例如食欲不振，體質量減輕，快感缺失及社會交往障礙等；致病因素一致是指導致抑郁癥的物理心理因素相同，例如遺傳因素和環(huán)境因素；能被抗抑郁藥治療，是指模型動物的抑郁樣表型能被現(xiàn)階段有效的陽性抗抑郁劑所逆轉。目前能滿足這三個標準的有急性抑郁動物模型［7-10］，醫(yī)源性抑郁模型［11-12］以及慢性抑郁動物模型［13-14］。急性抑郁動物模型主要用于抗抑郁化合物的篩選，醫(yī)源性抑郁模型用于研究抑郁癥的激素和免疫系統(tǒng)的變化，而慢性抑郁模型主要用于重度抑郁癥的發(fā)病機制研究。慢性溫和不可測應激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）模型［15-17］和社會挫?。╯ocial defeat，SD）［18-21］模型符合動物模型的三個標準。不同文獻CUMS模型和SD模型的評價指標不一致，且模型重復性較差［22］，因此，有必要摸索更可靠的造模方法。

在本研究中，針對大鼠CUMS模型，采用簡便的應激因子如通宵照明、夾尾和濕籠等進行模型的建立，造模后使用禁水20 h，測試24 h的糖水偏愛實驗進行測試。小鼠SD模型連續(xù)10 d應激后進行社會交往測試，其測試時間由2.5 min延長為5 min。通過對著兩種模型的建立方法和評價指標進行反復調整，以期建立穩(wěn)定及重復性較好的慢性抑郁模型，并對兩種模型的造模特點及優(yōu)劣勢進行了比較。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

Wistar大鼠，♂，體質量（180～250） g；C57BL/6J小鼠，♂，體質量（20～25） g；CD-1小鼠，♂，7～8月退役種鼠，體質量（35～45） g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物飼養(yǎng)在（20±1） ℃環(huán)境中，飼養(yǎng)房間晝夜顛倒，晚上8點開燈，早上8點關燈。濕度40%～60%，12 h光照/黑暗循環(huán)，水和食物充足，大鼠在尾部用藍色標記筆編號，小鼠用訂制的金屬耳標編號。所有涉及本研究動物的研究均遵循2017年新修訂版《實驗動物管理條例》的指導原則，并已獲得北京大學醫(yī)學部倫理實驗動物委員會的批準。

1.1.2 實驗試劑

氟西汀，購于Sigma公司，其他所用試劑均為國產(chǎn)。氟西?。╢luoxetine）溶液，大鼠腹腔注射用劑量為10 mg·kg-1，稱取相應劑量氟西汀粉末溶于相應體積注射用生理鹽水中，超聲溶解。配制溶液4 d內用完，常溫儲存。

1.1.3 實驗儀器

大鼠游泳桶的制作尺寸為內徑 25 cm、水深45 cm。實驗所用曠場為定制的不透明塑料箱，其規(guī)格為42 cm（w）×42 cm （d）×42 cm （h）。聯(lián)合開場視頻分析系統(tǒng)（Clever Sys Inc，Leesburg，VA，USA）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型

1.2.1.1 CUMS模型 CUMS造模方法在Willner方法的基礎上加以修改［23］。造模Wistar大鼠連續(xù)28 d暴露于不可預測的溫和應激中，每天隨機兩種不同的應激方式，主要的應激因子包括通宵照明、夾尾、濕籠、擁擠、冰水游泳、禁水禁食［24］等。

1.2.1.2 SD模型 SD模型利用同種物種間不同個體的社交沖突來產(chǎn)生情緒上和心理上的刺激，從而造成社交障礙而出現(xiàn)抑郁樣表型。本研究在Golden的基礎上加以修改［20］，選用CD-1雄性小鼠作為攻擊鼠（宿主），選擇C57BL/6J作為實驗鼠（入侵者），利用雄性小鼠的領地意識，當有外來小鼠C57BL/6J入侵的時候，宿主CD-1小鼠便會自發(fā)攻擊入侵小鼠。社會挫敗刺激主要分為兩個階段，第一階段是5～10 min的身體攻擊，實驗鼠C57BL/6J進入CD-1的領地，被CD-1連續(xù)攻擊5～10 min；第二階段為 24 h 的感官接觸［25］（Fig.1）。慢性SD模型連續(xù)應激10 d，每天進行一次社會挫敗刺激。

Fig.1 Schematic diagram of social defeat stressor

1.2.2 行為學指標

1.2.2.1 糖水偏愛測試 糖水偏愛測試前，將Wistar大鼠和C57BL/6J小鼠單籠飼養(yǎng)適應環(huán)境2 d，d 1給予Wistar大鼠和C57BL/6J小鼠兩瓶0.8%的蔗糖水，d 2給予一瓶水和一瓶0.8%糖水，在時間中間點更換兩瓶位置。測試當天，Wistar大鼠或C57BL/6J小鼠禁水20 h，之后給予水和0.8%糖水各一瓶，使Wistar大鼠或C57BL/6J小鼠自由飲水24 h，時間中間點更換兩瓶位置。造模前先進行糖基線的測試，造模后不再適應環(huán)境直接禁水20 h，測試24 h評估造模是否成功。24 h后統(tǒng)計Wistar大鼠或C57BL/6J小鼠飲水情況。計算糖水偏愛率（sucrose preference），取平均值。糖水偏愛率計算公式為［26］：

1.2.2.2 強迫游泳測試 強迫游泳測試（forced swimming test，F(xiàn)ST）在 Porsolt的基礎上加以改進［27］。強迫游泳屬于抑郁癥的經(jīng)典行為學實驗，對大、小鼠皆適用，主要用來考察動物的行為絕望［28］。Wistar大鼠游泳桶尺寸為內徑25 cm、水深45 cm。將動物放于水中游泳6 min，實驗者對后4 min中Wistar大鼠在水中的不動時間進行統(tǒng)計分析，不動的標準為Wistar大鼠只將頭部露出水面漂浮于水面，身體不掙扎，不動時間越長，表明動物越絕望。實驗過程中，Wistar大鼠要彼此分開，免受視聽干擾。要求每次放下一只Wistar大鼠之前，要將水面上漂浮的糞便清理干凈，從水中撈起Wistar大鼠后，用毛巾盡可能將其毛發(fā)擦干，以防感冒。

1.2.2.3 社會交往測試 社會交往測試（social interaction test，SIT）用以評價社會挫敗模型小鼠的社會交往能力。實驗所用曠場為定制的不透明塑料箱（Fig.2），其規(guī)格為42 cm （w）×42 cm （d）×42 cm （h）。曠場分為兩個區(qū)，一是圍繞金屬籠周邊14 cm （w）×24 cm （d）的接觸區(qū)（interaction zone），另一個是與接觸區(qū)相對應的兩個9 cm （w）×9 cm （d）的角落區(qū)（corner zone）［20］。測試分為兩個階段，第一階段為無攻擊鼠階段（target absent），此時接觸區(qū)中放一個空的金屬籠子，將C57BL/6J小鼠頭朝角落區(qū)方向放于曠場最中間，然后錄像記錄5 min的活動情況；第二階段為有攻擊鼠階段（target present），此時在接觸區(qū)中換一個同樣的新金屬籠子，并且在金屬籠內放上一只陌生的CD-1攻擊鼠，然后將C57BL/6J小鼠頭朝角落區(qū)放于曠場最中間，錄像記錄5 min的活動情況。實驗結束后用視頻分析系統(tǒng)分析300 s小鼠在曠場各個區(qū)的活動時間。社會交往率（social interaction ratio，SIR） =有攻擊鼠存在時C57BL/6J小鼠在接觸區(qū)持續(xù)時間/無攻擊鼠存在時C57BL/6J小鼠在接觸區(qū)持續(xù)時間。SIR≥1，表明C57BL/6J小鼠是抵抗鼠（resilient），對此應激不敏感；SIR＜1，表明 C57BL/6J小鼠是易感小鼠（susceptible），即為造模成功小鼠。實驗中要保持絕對安靜，且每階段放C57BL/6J小鼠進曠場前，都要將糞便處理干凈并噴灑75%的酒精去除異味，以免對測試造成干擾。

Fig.2 Schematic diagram of social interaction test （SIT）

1.3 統(tǒng)計方法

所有計量資料均以均數(shù)±標準差（x-±s）表示，運用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組間比較用t檢驗，多組均數(shù)采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CUMS使Wistar大鼠糖水偏愛率顯著降低而使強迫游泳的不動時間顯著延長

經(jīng)過28 d應激，成功建立Wistar大鼠CUMS模型。實驗時將大鼠分為空白對照組（control），模型組（CUMS）和氟西汀陽性藥組（CUMS + Flu）。造模前，按照糖水偏好率基礎值和體質量平均分組，各組糖水偏愛率約80%，體質量為233 g左右。4周造模后，模型組糖水偏愛率降低為69.3%，顯著低于空白對照組的81.0%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；氟西汀陽性藥組糖水偏愛率為82.1%，表明氟西汀能夠使糖水偏愛率恢復（Fig.3C）。從造模第一周開始，CUMS模型組組和氟西汀陽性藥組的體質量顯著低于對照組（P＜0.001），且這種趨勢一直持續(xù)到第4周（Fig.3B）。4周造模后，對大鼠進行FST行為學測試，CUMS模型組不動時間為131.2 s，空白對照組不動時間為105.1 s，其不動時間明顯高于空白對照組（Fig.3D）（P＜0.05），CUMS 模型組大鼠表現(xiàn)為行為絕望。氟西汀陽性藥組不動時間為108.3 s，與空白對照組相比沒有差異，表明不動時間延長趨勢能夠被陽性藥氟西汀所逆轉。CUMS應激使Wistar大鼠糖水偏愛率顯著降低，體質量減低且FST的不動時間顯著延長，符合抑郁癥表型，認為此次模型成功（Fig.3）。

Fig.3 Behavior evaluations of CUMS in rats

2.2 慢性SD應激使C57BL/6J小鼠產(chǎn)生社交障礙并降低糖水偏愛率

Fig.4 Behavior evaluations of social defeat in C57BL/6J mice

SD模型時間流程如Fig.4A所示，C57BL/6J小鼠作為入侵者被CD-1宿主小鼠連續(xù)攻擊10 d，每天的社會挫敗刺激均為5～10 min的身體攻擊和24 h的感官接觸（Fig.1）。造模后，將社會交往率小于1的成為敏感鼠（susceptible），大于 1 的成為抵抗鼠（resilient）［20］，將敏感鼠作為SD模型成功組，以下數(shù)據(jù)將模型組（social defeat susceptible）和空白對照組（control）進行評估。造模前，對照組和SD敏感小鼠組的糖水偏愛率分別為82.7%和81.7%，經(jīng)過連續(xù)10 d的應激，對照組和SD敏感小鼠組的糖水偏愛率分別為78.6%和69.2%，SD敏感小鼠組小鼠的糖水偏愛率相比對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（Fig.4B）。在SIT行為學測試中，當曠場中無攻擊鼠時，SD敏感組小鼠在接觸區(qū)和角落區(qū)與對照組相比沒有差異（Fig.4D，4E）；而當有攻擊鼠存在時，與對照組小鼠比較，SD敏感組小鼠在角落區(qū)待的時間顯著增加（Fig.4E），在接觸區(qū)停留時間顯著減少（Fig.4D），并且 SIR 小于 1（Fig.4C），證明經(jīng)過應激的SD敏感小鼠產(chǎn)生了社交障礙，致使其減少在接觸區(qū)與CD-1小鼠的互動。SD敏感小鼠與對照小鼠的總運動路程沒有差異（Fig.4F），這表明小鼠經(jīng)過社會擊敗應激后自發(fā)活動不受影響，小鼠運動能力正常。根據(jù)以上結果，認為此次社會挫敗小鼠造模成功。

3 討論

盡管沒有動物模型真正能夠反映抑郁癥病人的癥狀，但是建立嚙齒類動物抑郁癥模型仍然非常必要。關于建立CUMS大鼠模型，每天采用兩種不同的應激因素對大鼠進行刺激，在糖水偏愛測試過程中發(fā)現(xiàn)，前幾次都采用禁水24 h，測試1 h，這種測試方式會使禁水大鼠因為口渴而選擇就近原則，不一定表現(xiàn)出偏愛糖水行為，所以之后將糖水測試時間改為禁水20 h，測試24 h，以保證大鼠有足夠的時間去選擇水或者糖水。

總結三次大鼠CUMS的造模過程，可以得出以下結論：①糖水測試次數(shù)要少，以免形成記憶；②從數(shù)據(jù)上分析，似乎糖水基礎值大的大鼠比較容易受應激的影響而成模；③由于應激使大鼠體質量下降的較多，在做實驗時最好選擇體質量大一點的大鼠進行實驗。

社會挫敗模型是另一常用的慢性抑郁模型。在社會挫敗模型中，SIR小于1成為敏感鼠，大于1則成為抵抗鼠［20］，這種分類方式能夠減少因個體差異性引起整體動物行為學的評估情況（例如CUMS中因個體天生不喜愛喝糖水而影響整體糖水偏愛率評估）。模型一開始采用10 min的身體攻擊時間，發(fā)現(xiàn)CD-1退役種鼠攻擊力太強，C57BL/6J小鼠受外傷嚴重，因此后期身體攻擊時間改為5 min，感官接觸時間仍然為24 h。連續(xù)10 d的社會挫敗應激，每天都會有C57BL/6J小鼠死亡，為了保證造模結束有足夠量的樣本，建議在實驗開始前每組至少20只。

重度抑郁癥是多向性疾病，它是由多種因素導致的疾病且具有多種抑郁樣表型［29-31］。比較兩種慢性抑郁模型CUMS模型和SD模型，CUMS模型模擬人類所受社會生活和環(huán)境等多種因素的影響，能較真實反映重度抑郁癥的病理發(fā)生發(fā)展，因此，常用作重度抑郁癥的機制研究。SD模型應激因素相對比較單一，但其能模擬人類重度抑郁癥致病最重要的因素，因此也常用作機制研究［25］。此外從本研究可以看出，CUMS模型實驗周期較長（至少4周），而社會挫敗模型實驗周期較短（僅為10 d），實驗的穩(wěn)定性和可重復性較高，并且其行為學指標除了糖水偏愛率，還增加了社會交往率，多種行為學指標的統(tǒng)一更能增加模型可信性。此外文獻報道稱［20］，社會挫敗應激的影響可以持續(xù)一個月，因此篩選抗抑郁劑和評估陽性藥引起生理變化時，可以在10 d模型后連續(xù)給藥觀察，這樣不會因造模過程中給藥帶來的外傷刺激影響模型的成敗。

CUMS模型和SD模型能使大小鼠糖水偏愛率顯著降低而引起快感缺失等抑郁樣表型，因此都常用作重度抑郁癥的疾病機制研究。本研究通過比較，認為小鼠社會挫敗抑郁模型因其實驗周期較短，穩(wěn)定性和可重復性較高等優(yōu)勢，推薦在未來的重度抑郁癥研究中首選作為其機制和抗抑郁劑篩選的動物模型。

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