牙鲆NOD2基因的表達(dá)分析及在抗遲緩愛德華氏菌感染過程中的功能*

曹丹丹 劉金相 王志剛 張全啟 齊 潔 王旭波 于海洋

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266003)

先天免疫系統(tǒng)是生物體抵抗病原微生物侵害的第一道防線，它通過模式識別受體(Pattern recognition receptor, PRR)識別多種病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecule pattern, PAMP)并傳遞信號啟動(dòng)免疫防御反應(yīng)(Janeway, 2002)。NLRs(NOD樣受體家族)是一類重要的 PRR，主要識別細(xì)胞漿內(nèi)的 PAMP(Inohara, 2003; Franchi et al, 2009)。NOD2(又稱作CARD15)基因是 NLR受體家族重要的成員之一，NOD2蛋白具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端有2個(gè)連續(xù)的CARD結(jié)構(gòu)域，C端是LRR結(jié)構(gòu)域，中間是保守性最強(qiáng)的NOD結(jié)構(gòu)域(Imagawa et al, 1991)。

在哺乳動(dòng)物中，NOD2被證實(shí)能夠特異識別肽聚糖(PGN)的降解產(chǎn)物胞壁酰二肽(MDP) (Girardin et al,2003)，在識別到配體 MDP的基礎(chǔ)上，NOD2利用CARD-CARD相互作用招募RIP2(Bertin et al, 1999;Ogura et al, 2001)，通過一系列酶聯(lián)反應(yīng)激活NF-κb和 MAPK信號通路，包括 p38、ERK(Extracellular signal-regulated protein kinase)和JNK(c-Jun N-terminal kinase)信號通路等(McCarthy et al, 1998; Navas et al,1999; Takeda et al, 2001)。在部分硬骨魚類中，NOD2基因已被克隆并進(jìn)行功能探究，比如斑馬魚(Danio rerio)(Maharana et al, 2015)、印度鯪魚(Cirrhinus mrigala) (Swain et al, 2013)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Chang et al, 2011)等，生物信息學(xué)分析證明，NOD2在硬骨魚中保守性很高。在斑馬魚中，NOD2的基因沉默會削弱斑馬魚幼魚抵抗病原微生物侵染和控制全身感染的能力(Zou et al, 2016)。在虹鱒中，過表達(dá) NOD2有效結(jié)構(gòu)域的表達(dá)基因，能夠誘導(dǎo)IL-1β等促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且增強(qiáng)IFN-β等抗病毒因子的表達(dá)(Chang et al, 2011)。Zou等(2016)對斑馬魚 NOD2的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)CARD和NACHT結(jié)構(gòu)域是NOD2激活NF-κb信號通路的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而具備LRR和NACHT結(jié)構(gòu)域時(shí)，NOD2對IFN具有激活活性。總之，魚類NOD2廣泛參與抗菌、抗病毒的炎癥反應(yīng)，其反應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，其病害防御問題也引起關(guān)注。遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一類人畜共患菌，能夠侵害各種脊椎動(dòng)物，包括從低等的魚類到高等哺乳類(Okuda et al, 2006)。作為胞內(nèi)菌，遲緩愛德華氏菌侵染生物機(jī)體后，會在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生內(nèi)化并大量繁殖。因?yàn)橛屑?xì)胞膜的保護(hù)，胞內(nèi)的遲緩愛德華氏菌會避開體液中溶菌酶的溶解作用以及吞噬細(xì)胞的吞噬作用等，引起魚類出現(xiàn)皮膚損傷、腸道積水、多種內(nèi)臟器官的膿腫出血等，并產(chǎn)生嚴(yán)重的消化道炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致魚體死亡(Srinivasa Rao et al, 2001)。在以往報(bào)道中，遲緩愛德華氏菌會使牙鲆、大菱鲆(Scophthalmus maximus)等鲆鰈魚類產(chǎn)生嚴(yán)重病害，出現(xiàn)大量致死的病例(Ling et al, 2000; Castro et al, 2006; Mohanty et al, 2007)。因此，本研究進(jìn)行了遲緩愛德華氏菌牙鲆體內(nèi)攻毒以及牙鲆鰓細(xì)胞系的遲緩愛德華氏菌免疫刺激實(shí)驗(yàn)，從體內(nèi)和體外兩方面對PoNOD2進(jìn)行表達(dá)和功能分析，探究PoNOD2在抗病原菌侵染方面的作用，將為牙鲆的抗病原菌侵染機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，為牙鲆的抗病育種提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牙鲆 本實(shí)驗(yàn)所用牙鲆體長為 20～22 cm，來源于山東省黃海水產(chǎn)有限公司，實(shí)驗(yàn)前，置于充氣海水中，22℃暫養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)期間，所有實(shí)驗(yàn)材料均按照中國海洋大學(xué)動(dòng)物管理與使用委員會(OUC-IACUC)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理和使用。

1.1.2 牙鲆鰓細(xì)胞系(FG9307) 牙鲆鰓細(xì)胞系(FG9307)來源于中國海洋大學(xué)細(xì)胞工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。該細(xì)胞用 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入 10% (v/v) FBS(Fetal bovine serum), 1% (v/v) NEAA，和100 U/ml Penicillin，24℃培養(yǎng)。

1.1.3 遲緩愛德華氏菌 實(shí)驗(yàn)所用遲緩愛德華氏菌菌株來自于中國海洋大學(xué)海洋微生物研究中心。將該菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基中，28℃活化培養(yǎng)12 h?；罨髮慰寺【浣臃N于LB液體培養(yǎng)基中，28℃搖晃培養(yǎng) 12 h。用 PBS緩沖液稀釋使其終濃度為 107CFU/ml。

1.2 方法

1.2.1 獲得 PoNOD2核心片段序列 在 NCBI和Ensembl兩個(gè)數(shù)據(jù)庫搜取可獲得的硬骨魚NOD2同源序列，包括斑馬魚 NOD2和青鳉(Oryzias latipes)NOD2。將2條序列與實(shí)驗(yàn)室已建轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對，得到PoNOD2基因的cDNA序列，根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計(jì)擴(kuò)增PoNOD2 ORF序列的特異性引物NOD2-ORF-FW/RV(表1)，利用PCR技術(shù)克隆驗(yàn)證。1.2.2 PoNOD2基因序列分析 利用SMART預(yù)測PoNOD2的蛋白結(jié)構(gòu)域，同時(shí)利用 DNAman對PoNOD2的氨基酸和核酸進(jìn)行序列比對。通過NCBI和Ensembl兩個(gè)數(shù)據(jù)庫得到尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)、斑馬魚、家犬(Canislupus familiaris)、老鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)NOD2的氨基酸序列，利用MEGALIGN和DNASTAR對牙鲆與上述5個(gè)物種的氨基酸序列進(jìn)行分析，觀察NOD2蛋白結(jié)構(gòu)域在各個(gè)物種間的保守性。為了探究NOD2在硬骨魚與其他脊椎動(dòng)物之間的進(jìn)化關(guān)系，從 NCBI和Ensembl中獲得多個(gè)物種NOD2的氨基酸序列(表2)，利用鄰位相連法(Neighbor-Joining)對NOD2蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用MEGA 6構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 PoNOD2組織表達(dá)分析 本實(shí)驗(yàn)所用組織表達(dá)分析的定量cDNA模板是3條雌魚和3條雄魚的混合模板，每條魚都經(jīng)過麻醉后解剖，取心、肝、脾、腎、腦、鰓、肌、腸8個(gè)組織。

1.2.4 牙鲆p-EGFP-NOD2質(zhì)粒構(gòu)建 為了深入探究PoNOD2基因的功能，在PoNOD2基因的ORF兩端，即 ATG處和 TAG處分別利用引物 NOD2-Fw2和NOD2-Rv2設(shè)計(jì)XhoⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)。通過雙酶切得到 PoNOD2的 ORF克隆片段，連接到p-EGFP-C1質(zhì)粒中，得到p-EGFP-NOD2重組質(zhì)粒。

1.2.5 遲緩愛德華氏菌刺激實(shí)驗(yàn) 取 224條生長狀態(tài)良好的牙鲆，分為空白對照組(4條)、對照組(130條)和實(shí)驗(yàn)組(90條)?？瞻讓φ战M牙鲆不做處理，對照組牙鲆腹腔注射 1 ml PBS，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射 1 ml濃度為 107CFU/ml的遲緩愛德華氏菌菌液。隨后將注射組和對照組分開暫養(yǎng)，在刺激1、3、5、8、12、24、48、72、96和110 h時(shí)取樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，空白對照組(1 h時(shí)取)、對照組和實(shí)驗(yàn)組分別取 4條魚，經(jīng)麻醉后解剖，取鰓、腎和脾。組織存于液氮中，-80℃保存待用。

1.2.6 免疫刺激實(shí)驗(yàn) 將狀態(tài)良好、單層培養(yǎng)的牙鲆鰓細(xì)胞系接板到12孔板，待24 h后細(xì)胞覆蓋度達(dá)到90%～95%，匯集成單層。向每個(gè)孔中加入PGN，Poly Ⅰ:C和遲緩愛德華氏菌菌液，使終濃度分別為50 μg/ml、50 μg/ml和 5×106CFU/ml。對照組加入相同濃度的PBS。分別在刺激后0、1、2、4、8和12 h時(shí)，收集細(xì)胞樣品，存于Trizol中待用。

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將狀態(tài)良好的牙鲆鰓細(xì)胞系接板到12孔板，待細(xì)胞覆蓋度達(dá)到90%左右。吸走培養(yǎng)基，PBS清洗2遍后，換上新鮮DMEM培養(yǎng)基，用Lipofectamine? 3000進(jìn)行p-EGFP-PoNOD2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，操作步驟嚴(yán)格按照說明書。對照組轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，將實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞分別用PBS清洗3次，4% PFA固定10 min，PBS再清洗3次。在每孔中加入DAPI染液，使作用濃度為 10 μg/ml，10 min后用 PBS清洗 3次，激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R)下觀察拍照。

1.2.8 抗菌檢測實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染p-EGFP-NOD2質(zhì)粒24 h以后的牙鲆鰓細(xì)胞，用800 μg/ml的G418進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選，得到 PoNOD2過表達(dá)鰓細(xì)胞。對照組轉(zhuǎn)染 p-EGFP-C1質(zhì)粒。用遲緩愛德華氏菌對鰓細(xì)胞進(jìn)行侵染，菌落數(shù)與細(xì)胞比例(MOI)為 10∶1。在侵染4 h以后，遲緩愛德華氏菌侵染到胞內(nèi)，用新鮮培養(yǎng)基緩緩清洗細(xì)胞3次，盡量洗凈胞外細(xì)菌。之后用含有 200 μg/ml慶大霉素的 DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2 h，胞外未侵染進(jìn)細(xì)胞的遲緩愛德華氏菌已被殺死。用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞 3次，換上正常DMEM繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞15 h，此時(shí)，胞內(nèi)的遲緩愛德華氏菌會在細(xì)胞內(nèi)正常生存、繁殖。此后，用正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在6 h和15 h，分別用胰酶消化細(xì)胞，EP管收集離心，取沉淀。PBS清洗沉淀3次后，用1% Triton X-100裂解細(xì)胞10 min，梯度稀釋細(xì)胞裂解液，涂LB固體培養(yǎng)基板，計(jì)數(shù)。

1.2.9 免疫調(diào)節(jié)檢測實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染p-EGFP-NOD2質(zhì)粒48 h以后的牙鲆鰓細(xì)胞，用50 μg/ml的PGN進(jìn)行刺激，對照組用PBS處理。在刺激24 h以后，收集細(xì)胞樣品，提取RNA，用qRT-PCR檢測IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)變化情況。

1.2.10 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR) 根據(jù)PoNOD2 cDNA序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，選用β-actin作為內(nèi)參基因。運(yùn)用Light Cycler 480進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃，2 min；95℃，15 s，60℃，45 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)待測樣品均設(shè)置3次重復(fù)，保證準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)采用2?ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算得到 PoNOD2的相對表達(dá)量。數(shù)據(jù)以變化倍數(shù)呈現(xiàn)，代表實(shí)驗(yàn)組與對照組之間相對表達(dá)量的比值。所有定量引物序列均在表1中列出。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析 本實(shí)驗(yàn)所涉及數(shù)據(jù)差異性分析，均利用 SPSS 20.0軟件，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行比較。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)(n=3)表示，各個(gè)組之間的差異性用*表示(*P＜0.05; **P＜0.01)。

2 結(jié)果

2.1 PoNOD2的ORF序列擴(kuò)增

以牙鲆混合組織為模板，擴(kuò)增得到 PoNOD2基因的 ORF序列，與牙鲆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中牙鲆 NOD2 ORF序列完全一致。PoNOD2的ORF長為2964 bp，編碼 988個(gè)氨基酸。通過在線蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件SMART分析發(fā)現(xiàn)，PoNOD2的蛋白結(jié)構(gòu)域與其他脊椎動(dòng)物一樣，包含3個(gè)典型結(jié)構(gòu)域：CARD、NACHT和LRR(圖1)。利用DNAman對PoNOD2核酸序列與氨基酸序列比對分析(圖1)，結(jié)果顯示，PoNOD2的N端的2個(gè)不連續(xù)CARD結(jié)構(gòu)域，其位置分別在1～93 bp、107～198 bp；中間是 NACHT結(jié)構(gòu)域，其位置在259～444 bp；C 端的多個(gè) LRR 結(jié)構(gòu)域，其位置在737～979 bp。

2.2 氨基酸多序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析

在牙鲆、尼羅羅非魚、斑馬魚、家犬、老鼠和人中，氨基酸序列比對結(jié)果顯示(圖2)，NOD2基因的3個(gè)結(jié)構(gòu)域在脊椎動(dòng)物中保守性很強(qiáng)，其中 NACHT結(jié)構(gòu)域最為保守。為了探究 NOD2在脊椎動(dòng)物中的進(jìn)化關(guān)系，本研究利用MEGA 6構(gòu)建了由不同脊椎動(dòng)物的NOD2基因組成的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，鴨嘴獸(Ornithorhynchus anatinus)NOD2被選為外類群，其中，魚類和其他脊椎動(dòng)物分別形成2個(gè)亞支。在魚類亞支中，牙鲆與紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)最為接近，它們與青鳉、虹鱒和新月魚(Xiphophorus maculatus)組成一支，區(qū)別于由斑馬魚、草魚(Ctenopharyngodon idella)、露斯塔野鯪(Labeo rohita)等組成的另外一支。

2.3 PoNOD2的組織表達(dá)

如圖4所示，PoNOD2在脾中具有最高表達(dá)量，其次是肝，隨后是腎、肌肉、鰓、心臟和腦。

2.4 PoNOD2蛋白亞細(xì)胞定位

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5)，牙鲆NOD2蛋白與其他脊椎動(dòng)物蛋白一樣，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，從圖5可以看出，牙鲆鰓細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(綠色)與細(xì)胞核(藍(lán)色)界限分明。

圖1 PoNOD2基因的核苷酸序列與氨基酸序列對應(yīng)圖Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequences of PoNOD2CARD、NACHT、LRR結(jié)構(gòu)域均用方框圈出，各結(jié)構(gòu)域名稱在圖片左側(cè)標(biāo)注All structure domain amino acid residues are marked by boxes, the CARD, NACHT, and LRR are listed in the left

2.5 遲緩愛德華氏菌侵染牙鲆中PoNOD2的表達(dá)

在遲緩愛德華氏菌侵染牙鲆成體魚的不同時(shí)期，分別取了遲緩愛德華氏菌組和對照組的鰓、腎、脾組織，探究PoNOD2在遲緩愛德華氏菌刺激下的表達(dá)，結(jié)果顯示，在各個(gè)組織中，遲緩愛德華氏菌的刺激能夠引起PoNOD2不同程度表達(dá)上調(diào)。

在腎中(圖6A)，遲緩愛德華氏菌刺激后，PoNOD2的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低再升高再降低的趨勢，3個(gè)升高點(diǎn)分別出現(xiàn)在3、48和110 h，在這3個(gè)時(shí)期，實(shí)驗(yàn)組的PoNOD2表達(dá)量分別是對照組表達(dá)量的2.6倍、3.14倍和2.15倍。在脾中(圖6B)，遲緩愛德華氏菌對 PoNOD2的誘導(dǎo)作用隨刺激時(shí)間的延長而升高，到96 h時(shí)達(dá)到最高。在鰓中(圖6C)，遲緩愛德華氏菌從5 h開始對PoNOD2發(fā)揮誘導(dǎo)作用；在96 h時(shí)，NOD2的表達(dá)量達(dá)到最高，是對照組的3.27倍。

圖2 脊椎動(dòng)物NOD2氨基酸多序列比對Fig.2 The multiple alignment of NOD2 amino acid sequences in Japanese flounder and other species相同的氨基酸以中等灰度著色。CARD、NACHT和LRR結(jié)構(gòu)域使用SMART預(yù)測，并將結(jié)構(gòu)域標(biāo)注在上方的黑色條中Identical amino acids are shaded in medium grey. CARD, NACHT and LRR were predicted by using the SMART program, and these domains are indicated as black bars above the alignment

圖3 脊椎動(dòng)物NOD2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 The phylogenetic analysis of NOD2 in different representative vertebrates based on their amino acid sequences

圖4 PoNOD2基因在不同組織的RT-qPCR分析Fig.4 Relative expression of PoNOD2 in different tissues of Japanese flounderβ-actin基因是定量分析的內(nèi)參對照，誤差線代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (n=3)β-actin gene expression was used as internal control,vertical bars represent the Mean±SE (n=3)

2.6 免疫刺激牙鲆鰓細(xì)胞中PoNOD2的表達(dá)

為更進(jìn)一步探討牙鲆 NOD2在抗病原菌侵染方面發(fā)揮的重要作用，分別用PBS、PGN、Poly I:C和遲緩遲緩愛德華氏菌刺激牙鲆鰓細(xì)胞系，并在0～12 h的不同時(shí)間點(diǎn)取樣，對牙鲆NOD2進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明，不同的刺激均使牙鲆NOD2表達(dá)上調(diào)(圖 7)。

PBS刺激時(shí)(圖7A)，PoNOD2在前5個(gè)時(shí)期表達(dá)無明顯差異，12 h時(shí)有略微上調(diào)。PGN刺激時(shí)(圖7B)，PoNOD2表達(dá)先升高后降低再升高。在4 h時(shí)，達(dá)到一個(gè)峰值，是0 h時(shí)的10.9倍，在12 h時(shí)再次升高，達(dá)到0 h的8.74倍。在Poly I:C刺激時(shí)(圖7C)，NOD2的表達(dá)在1 h時(shí)突然升高，達(dá)到0 h的4.4倍，在2 h時(shí)，NOD2表達(dá)降低，直到8 h時(shí)，達(dá)到了最高點(diǎn)，此時(shí)為0 h的8.37倍。遲緩愛德華氏菌刺激時(shí)(圖7D)，PoNOD2的表達(dá)在前4 h一直是高表達(dá)，在8 h時(shí)降低，12 h時(shí)再次升高。

2.7 PoNOD2抑制遲緩愛德華氏菌生長

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8，在6 h時(shí)，觀察到PoNOD2對胞內(nèi)菌抑制效果不明顯，與對照組相比，沒有顯著性差異。然而，隨著時(shí)間推移到細(xì)菌侵染后15 h，遲緩愛德華氏菌在牙鲆鰓細(xì)胞內(nèi)繁殖，對照組胞內(nèi)菌數(shù)目增加到 4.55×105CFU/12孔，而實(shí)驗(yàn)組胞內(nèi)菌數(shù)目為2.86×105CFU/12孔，相比對照組下降了30%。

2.8 PoNOD2調(diào)節(jié)免疫因子生成

基于獲得了 PoNOD2過表達(dá)的牙鲆細(xì)胞系，檢測了在PGN刺激24 h后FG細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖9)，相比轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1的對照組，PoNOD2的過表達(dá)能明顯上調(diào) IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)水平，表達(dá)量分別高11.6倍、4.6倍和8.76倍。

圖5 PoNOD2蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of PoNOD2 in Japanese flounder FG cells激光共聚焦顯微鏡下，PoNOD2(綠色熒光)在細(xì)胞質(zhì)中，核DNA用DAPI染色，pEGFP-C1用做陰性對照Localization of PoNOD2 in FG cells under confocal microscope. PoNOD2 was mainly detected in cytoplasm. Nuclear DNA of the cells was counterstained with DAPI. The cells transfected with pEGFP-C1 were used as negative controls

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PoNOD2蛋白具有3種典型結(jié)構(gòu)域CARD、NACHT和LRR，蛋白質(zhì)多重序列比對得知，這3類結(jié)構(gòu)域都相對保守，其中NACHT保守性最高。由此可以推測，牙鲆可能利用NOD2基因的 CARD、NACHT和LRR結(jié)構(gòu)域完成識別信號、啟動(dòng)免疫信號通路的功能(Zurek et al, 2012; Maharana et al, 2015)。

NOD2廣泛分布在哺乳動(dòng)物和魚類的各種組織中，本研究利用qRT-PCR檢測到PoNOD2在牙鲆各個(gè)組織廣泛表達(dá)，在脾臟中表達(dá)最高，其次是肝臟。在印度鯪、草魚中，類似的組織表達(dá)研究顯示，NOD2廣泛分布在各個(gè)組織，印度鯪NOD2在肝臟中表達(dá)最高(Swain et al, 2013)，草魚NOD2在腎臟中表達(dá)最高(Chen et al, 2010)，這種表達(dá)差異可能與魚種類不同有關(guān)。腎臟是魚類重要免疫器官，在魚類抵御外來病原菌入侵過程中最先產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。魚類脾的免疫功能僅次于腎，同時(shí)，承載著造血和免疫作用。肝臟是魚類重要的解毒器官，在魚類維持生理平衡、抵御異物侵染中發(fā)揮重要作用。PoNOD2在肝臟與脾中的高表達(dá)表明其具有重要的免疫功能。PoNOD2在遲緩愛德華氏菌感染的牙鲆鰓、腎和脾中的定量表達(dá)結(jié)果顯示，在腎中 PoNOD2隨著遲緩愛德華氏菌的侵染呈現(xiàn)先升高又降低再升高的趨勢；在脾和鰓中，PoNOD2隨著遲緩愛德華氏菌的侵染表達(dá)逐漸升高。PoNOD2表達(dá)模式的不同可能與組織功能不同有關(guān)，表明 PoNOD2能夠參與牙鲆抗遲緩愛德華氏菌感染的免疫反應(yīng)，NOD2具有抗胞內(nèi)菌作用。

PGN是革蘭氏陽性菌和陰性菌細(xì)胞壁的重要組成成分，NOD2能夠特異識別PGN的降解產(chǎn)物胞壁酰二肽(MDP)(Girardin et al, 2003)。Poly I:C是一種干擾素抑制劑，作為雙鏈RNA的類似物，在實(shí)驗(yàn)中常被用來模擬病毒刺激(Fujimoto et al, 2004)。本研究結(jié)果表明，PGN、Poly I:C和遲緩愛德華氏菌均能上調(diào)PoNOD2的表達(dá)，但上調(diào)的程度和時(shí)間不同。PGN與遲緩愛德華氏菌相比，能夠引起 PoNOD2更大幅度的上調(diào)，在4 h時(shí)，是對照組表達(dá)量的10倍。PGN是細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，能夠被NOD2特異識別；而遲緩愛德華氏菌刺激時(shí)，除了激活 NOD2信號通路，還會引起其他一些受體基因的先天免疫應(yīng)答。因此，PoNOD2表達(dá)上的差異可能與細(xì)胞應(yīng)對專一刺激物和活菌的反應(yīng)機(jī)制不同有關(guān)。而 PGN、遲緩愛德華氏菌與Poly I:C的不同，可能由PoNOD2對病毒和細(xì)菌的識別機(jī)制不同導(dǎo)致?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)，PoNOD2的表達(dá)能夠被細(xì)菌、病毒類似物以及細(xì)菌降解產(chǎn)物的刺激所激活，表明 PoNOD2在牙鲆免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。

圖6 遲緩愛德華氏菌刺激下PoNOD2在牙鲆組織的表達(dá)Fig.6 Expression profile of PoNOD2 mRNA in kidney,spleen and gill of Japanese flounder following E. tarda challengesβ-actin基因是定量分析的內(nèi)參對照，時(shí)間點(diǎn)0 h表達(dá)量用作參照樣品。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (n=4)表示，各個(gè)組之間的差異性用*表示(*P＜0.05; **P＜0.01)β-actin gene expression was used as internal control and the time point 0 h was used as reference sample. Vertical bars represent Mean±SE (n=4). Significant difference between E. tarda-challenged tissues and blank control (at 0 h) are indicated by asterisk (*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01)

哺乳動(dòng)物中 NOD2-RIPK2途徑可以調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)和控制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并可以誘發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答來促進(jìn)宿主抗微生物反應(yīng)(Magalhaes et al,2011)。以往在斑馬魚中的研究表明(Zou et al, 2016)，NOD2過表達(dá)并不能夠起到抑制胞內(nèi)遲緩愛德華氏菌繁殖的能力。為了探討PoNOD2是否可以發(fā)揮與哺乳動(dòng)物一樣的效果，本研究用過表達(dá)NOD2的牙鲆鰓細(xì)胞系進(jìn)行遲緩愛德華氏菌侵染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在侵染6 h后，過表達(dá)NOD2的實(shí)驗(yàn)組和對照組相比，體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量沒有顯著性降低，但在15 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組相比對照組降低了30%。這與哺乳動(dòng)物中的研究結(jié)果相一致，但與斑馬魚的研究結(jié)果不同。在斑馬魚研究中(Zou et al, 2016)，作者并沒有進(jìn)行6 h以后的跟蹤實(shí)驗(yàn)。本研究認(rèn)為，牙鲆和斑馬魚實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同可能有3種原因：PoNOD2作為一個(gè)胞內(nèi)識別受體，它通過識別胞內(nèi)菌引起系列先天免疫反應(yīng)，該反應(yīng)隨著時(shí)間的延長，抑菌效果逐漸增強(qiáng)；牙鲆NOD2和斑馬魚 NOD2在應(yīng)對遲緩愛德華氏菌侵染過程中發(fā)揮的作用不同；2個(gè)實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞系不同，本實(shí)驗(yàn)用的是牙鲆鰓細(xì)胞系，斑馬魚實(shí)驗(yàn)用的胚胎細(xì)胞系，鰓是魚類先天性免疫的重要器官，鰓細(xì)胞系對免疫應(yīng)答的表現(xiàn)可能比胚胎細(xì)胞系更加直觀和清楚。

IL-1β和IL-6等白介素家族成員是細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的重要因子(Scheller et al, 2011)。本研究利用PGN刺激轉(zhuǎn)染 p-EGFP-NOD2的牙鲆鰓細(xì)胞系，探討NOD2是否能夠抑制或者激活這些細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果表明，PoNOD2過表達(dá)能夠引起 IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)上調(diào)。其中，IL-1β和IL-8的上調(diào)程度高于 IL-6，這可能與PoNOD2對3種基因的調(diào)節(jié)作用不同有關(guān)。PoNOD2過表達(dá)能夠抑制遲緩愛德華氏菌在細(xì)胞內(nèi)的增殖，而PoNOD2過表達(dá)能夠上調(diào) IL-1β、IL-6和 IL-8等細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。因此，PoNOD2發(fā)揮抑菌作用可能通過上調(diào)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，達(dá)到抑菌的目的。

本研究克隆了 PoNOD2基因，并分別研究了PoNOD2基因在成體魚和細(xì)胞水平的表達(dá)特征，研究結(jié)果表明，該基因可能在牙鲆先天性免疫中起重要作用。同時(shí)，PoNOD2過表達(dá)能夠激活炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IL-8等的表達(dá)，參與了牙鲆的免疫應(yīng)答反應(yīng)，對胞內(nèi)遲緩愛德華氏菌的感染起到抑制作用。本研究為今后更深入研究牙鲆細(xì)菌感染的分子機(jī)制及免疫應(yīng)答機(jī)理提供了詳實(shí)的數(shù)據(jù)，奠定了理論基礎(chǔ)。

圖7 PoNOD2在免疫刺激牙鲆鰓細(xì)胞中的表達(dá)Fig.7 Expression profiles of PoNOD2 mRNA in Japanese flounder FG cells subjected under different stimuliPoNOD2的mRNA水平在不同刺激下的FG細(xì)胞的定量表達(dá)，包括PBS、PGN、Poly I：C和Edwardsiella tarda。β-actin基因表達(dá)用作內(nèi)參對照，時(shí)間點(diǎn)0 h用作參照樣品。誤差線表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)。刺激組與空白對照(0 h)之間的顯著差異由星號表示(*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01)Quantitative expression profile of PoNOD2 mRNA in FG cells following different challenges, including PBS, PGN, Poly I:C, and E. tarda. β-actin gene expression was used as internal control, and the time point 0 h was used as reference sample. Vertical bars represent Mean±SE (n=3). Significant difference between stimuli-or bacteria-challenged and blank control(at 0 h) are indicated by asterisk (*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01)

圖8 PoNOD2在牙鲆鰓細(xì)胞中的抗菌檢測Fig.8 Antibacterial assays of PoNOD2 in Japanese flounder FG cells誤差線表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)。在6 h和15 h時(shí)，pEGFP-NOD2組與pEGFP-C1組之間的顯著差異由星號表示(*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01)The results were expressed as Mean±SE of three independent experiments, with each performed in triplicate. Significant difference between pEGFP-NOD2 group and pEFFP-C1 group at different time are indicated by asterisk(*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01)

圖9 NOD2過表達(dá)對PGN刺激的FG細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)的影響Fig.9 Effect of NOD2 overexpression on the expression of pro-inflammatory cytokines in PGN-stimulated Japanese flounder FG cells誤差線表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (n=3)。pEGFP-NOD2與pEGFP-C1和對照組之間的顯著差異由星號表示(*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01)Vertical bars represent the Mean±SE (n=3). Significant difference between pEGFP-NOD2 and pEGFP-C1 and the control is indicated by asterisk (*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01)

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