缺血前預(yù)處理改善腦缺血后再灌注損傷預(yù)后的效果研究

謝凱勝 盤慶飛 黃賢 李圣海 何秀麗

[摘要]目的 探討缺血前預(yù)處理改善腦缺血后再灌注損傷預(yù)后的效果。方法 隨機(jī)選取75只健康雄性小鼠分為3組，包括假手術(shù)組（15只）、對(duì)照組（28只）、觀察組（32只），其中假手術(shù)組小鼠僅結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，對(duì)照組、觀察組小鼠均以線栓法建立小鼠腦缺血模型，并在小鼠缺血2 h后進(jìn)行再灌注24 h，對(duì)照組灌注前給予生理鹽水處理，觀察組使用頭孢曲松處理，觀察三組小鼠腦組織梗死的容積、神經(jīng)功能缺陷評(píng)分以及組織內(nèi)白介素1β（IL-1β）炎性因子的水平情況。結(jié)果 觀察組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分高于對(duì)照組，皮層腦內(nèi)IL-1β水平低于對(duì)照組，腦梗死容積小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組紋狀體炎性因子水平及梗死容積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；假手術(shù)組神經(jīng)功能評(píng)分高于對(duì)照組與觀察組，IL-1β水平低于對(duì)照組與觀察組，梗死容積小于對(duì)照組與觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 臨床在腦缺血再灌注前使用頭孢曲松進(jìn)行預(yù)處理，能夠降低腦內(nèi)IL-1β炎性因子的表達(dá)、分泌，有效減少腦梗死容積，減輕腦神經(jīng)功能損失。

[關(guān)鍵詞]預(yù)處理；損傷；缺血再灌注；腦組織

[中圖分類號(hào)] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）4（c）-0116-03

Effect study of ischemic pretreatment on improving the prognosis of reperfusion injury after cerebral ischemia

XIE Kai-sheng1 PAN Qing-fei1 HUANG Xian1 LI Sheng-hai1 HE Xiu-li2

1.Department of Emergency，Shiyan People′s Hospital of Shenzhen City in Guangdong Province，Shenzhen 518100，China；2.Department of Emergency，Luohu People′s Hospital of Shenzhen City in Guangdong Province，Shenzhen 518100，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of ischemic pretreatment on improving the prognosis of cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods A total of 75 healthy male mice were randomly divided into 3 groups：sham operation group （n=15），control group （n=28） and observation group （n=32）.In the sham operation group，only right common carotid artery was ligated.In the observation and control groups，the cerebral ischemic model in mice was established by suture method.The mice were reperfused 24 hours after ischemia for 2 hours.In the control group，saline was used before perfusion，while in the observation group，ceftriaxone was applied.The infarct volume，neurological deficit scores and interleukin-1β （IL-1β） inflammatory cytokines levels in the three groups of mice were observed.Results The score of neurological function in the observation group was higher than that in the control group.The level of IL-1β in the cortex was lower than that in the control group.The volume of cerebral infarction was smaller than that in the control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.The levels of inflammatory cytokines and infarcted volume of corpus striatum were not displayed statistical differences （P>0.05）.The scores of neurological function in the sham operation group were higher than those in control group and observation group.The IL-1β level and infarct volume in the sham operation group were also lower than those in the other two groups，，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion Application of ceftriaxone for pretreatment before cerebral ischemia-reperfusion can decrease the expression and secretion of IL-1β inflammatory factor，effectively reduce the volume of cerebral infarction，and alleviate neurological deficit.

[Key words]Pretreatment；Injury；Ischemia-reperfusion；Cerebral tissue

腦是人體中重要的功能性器官之一，也是最為耗氧的器官，但近幾年腦卒中、腦梗死等疾病發(fā)病率明顯上升，患者發(fā)病時(shí)腦部均會(huì)有不同程度的缺血，研究提示腦缺血是造成患者神經(jīng)功能障礙、死亡的主要原因[1]。為有效減輕腦疾病患者的腦缺血，臨床需及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)域的血液灌注，但大量研究提示缺血再灌注會(huì)對(duì)患者腦組織造成二次損傷，不僅無法起到良好的治療效果，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡，危及患者的生命安全[2]。有學(xué)者提出對(duì)腦缺血患者再灌注前可行預(yù)處理，以減輕腦組織損失，避免腦梗死的面積擴(kuò)大[3]。本研究觀察頭孢曲松預(yù)處理小鼠的神經(jīng)損傷情況，旨在為后期臨床腦缺血再灌注的治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所選取的動(dòng)物均購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重（192.25±19.12）g，合格證號(hào)：SCXK（軍）2016-0001。

1.2主要儀器與試劑

兔抗大鼠 OX-42（北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司）、兔抗大鼠 IL-1β[派普泰克生物科技（蘇州）有限公司]、兔抗大鼠 GFAP（上海谷研科技有限公司）、頭孢曲松（南昌立健藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20023084）、小鼠抗大鼠 NeuN（Chemicon）、IL-1βELISA 試劑盒（上海吉泰依科賽生物科技有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

合格健康實(shí)驗(yàn)小鼠30只，體重221～254 g，術(shù)前所有小鼠禁食12 h。所有小鼠稱重后，以10%水合醛3.5 ml/kg于小鼠腹腔注射，麻醉后在小鼠頸正中處做切口，游離頸內(nèi)外動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈，在充分暴露血管后將頸總動(dòng)脈、外動(dòng)脈近心端結(jié)扎，于總動(dòng)脈分叉下方做小切口，將尼龍栓線蘸取適量肝素鈉后置入，并緩慢推進(jìn)，深度在19～20 mm時(shí)停止（假手術(shù)組推進(jìn)深度為9 mm），將頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端扎緊，建立腦缺血模型。后在對(duì)照組及觀察組小鼠右側(cè)股靜脈做切口置管，連接微量注射泵，在栓塞2 h后拔出尼龍栓線恢復(fù)再灌注24 h，此時(shí)對(duì)照組泵入生理鹽水，觀察組泵入頭孢曲松，所有小鼠術(shù)中用保溫毯維持體溫在38℃左右。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1觀察指標(biāo) 觀察三組小鼠腦組織梗死容積、神經(jīng)功能缺陷評(píng)分以及腦內(nèi)IL-1β炎性因子的水平情況。梗死容積=（對(duì)側(cè)腦組織-患側(cè)正常腦組織）/對(duì)側(cè)腦組織×100%；神經(jīng)功能缺陷評(píng)分：小鼠再灌注24 h后，將其提起觀察小鼠動(dòng)作，小鼠四爪屈伸無變化計(jì)0分，對(duì)側(cè)前爪伸展不完全計(jì)1分，小鼠向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分，小鼠向?qū)?cè)傾倒計(jì)3分，小鼠無法行走、意識(shí)喪失計(jì)4分，小鼠死亡計(jì)5分。

1.4.2檢測(cè)方法 腦梗死容積測(cè)定：再灌注24 h后，先對(duì)小鼠動(dòng)作進(jìn)行觀察，后麻醉小鼠斷頭處死，打開其顱骨蓋，剝?nèi)ツX膜，取出整個(gè)大腦，以PBS溶液清洗后立即置于-20℃冷凍10 min。將冷凍后的腦組沿冠狀面切成厚度2.0 mm 左右的薄片6張，將切片置于2% TTC 溶液中，并在37℃水浴下避光孵育 10～20 min，最后以4%多聚甲醛固定腦切片，時(shí)間1～3 d，將切片用數(shù)碼相機(jī)拍下腦梗死圖片后，以圖像分析軟件計(jì)算小鼠的梗死容積。

小鼠IL-1β檢測(cè)：本次檢測(cè)采用雙抗體夾心ELISA 法，于酶標(biāo)板上加入抗小鼠 IL-1β單抗，將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品中IL-1β與單抗結(jié)合，并加入生物素化抗大鼠 IL-1β，以于酶標(biāo)板上形成免疫復(fù)合物，將Streptavidin（辣根過氧化物酶標(biāo)記）與生物素結(jié)合，最后加入底物液，在顯藍(lán)色后加終止液硫酸，觀察酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)吸光值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IL-1β濃度，取平均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，三組比較采用F檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1三組小鼠腦梗死容積的比較

假手術(shù)組小鼠未出現(xiàn)腦梗死情況，觀察組皮層梗死容積小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組紋狀體梗死容積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），觀察組梗死總面積顯著小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1、圖1）。

表1 三組小鼠腦梗死容積的比較（%，x±s）

A：假手術(shù)組，腦梗死總?cè)莘e為0.00%；B：對(duì)照組，腦梗死總?cè)莘e（38.15±1.60）%；C：觀察組，腦梗死總?cè)莘e（22.40±1.75）%

圖1 小鼠腦梗死情況

2.2三組小鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分的比較

對(duì)照組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分為（8.31±0.26）分，觀察組為（12.54±0.32）分，假手術(shù)組為（17.63±1.20）分，假手術(shù)組小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分高于其他兩組，同時(shí)觀察組小鼠的評(píng)分高于對(duì)照組（F=1239.13，P<0.05）。

2.3三組小鼠腦內(nèi)IL-1β炎性因子水平的比較

假手術(shù)組小鼠腦內(nèi)IL-1β水平低于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；觀察組皮層IL-1β水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

表2 三組小鼠腦內(nèi)IL-1β炎性因子水平的比較（pg/ml，x±s）

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05

3討論

臨床對(duì)于腦缺血患者治療重點(diǎn)在于及時(shí)有效恢復(fù)缺血區(qū)域的血液灌注，但近幾年隨著臨床深入研究，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注時(shí)會(huì)對(duì)患者的腦組織造成二次損害，導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡，原因?yàn)樵俟嘧r(shí)腦細(xì)胞腫脹、破裂、壞死，而壞死腦細(xì)胞會(huì)刺激腦組織，造成大量炎性分子分泌，隨著炎性因子浸潤(rùn)組織，引發(fā)炎癥反應(yīng)，誘發(fā)腦梗死、造成神經(jīng)元損傷，進(jìn)而危及患者的生命安全[4-6]。

缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)是引發(fā)損傷的主要原因之一，因此如何有效避免再灌注時(shí)腦部炎性細(xì)胞激活、抑制炎性因子釋放，是減輕缺血再灌注損傷的關(guān)鍵，有學(xué)者提出在再灌注前使用藥物進(jìn)行預(yù)處理，可以抑制灌注時(shí)炎性因子水平上升，減輕腦損傷[7]。頭孢曲松是臨床常用的抗菌藥物，但研究表明此藥不僅有滅菌、消炎效果，還能發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用，故有學(xué)者提出將其用于預(yù)處理，以減輕腦損傷[8-9]。本研究結(jié)果顯示觀察組小鼠的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示頭孢曲松能起到一定的神經(jīng)保護(hù)作用。這可能是由于此藥能促使細(xì)胞內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體RNA（信使mRNA）表達(dá)，增加轉(zhuǎn)運(yùn)體含量，降低腦內(nèi)谷氨酸水平，從而減少神經(jīng)毒性，達(dá)到減輕腦組織損傷的目的[10-11]。研究提示谷氨酸是人體內(nèi)神經(jīng)興奮性遞質(zhì)，大量谷氨酸釋放聚集，可導(dǎo)致神經(jīng)興奮性毒性，造成細(xì)胞腫脹誘發(fā)腦部病變，而頭孢曲松能在損傷早期清除興奮性谷氨酸，故能減輕神經(jīng)損傷[12]。同時(shí)本研究顯示觀察組小鼠皮層較對(duì)照組腦梗死容積小、腦內(nèi)IL-1β水平低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而在紋狀體兩組炎性因子水平及梗死容積無明顯差異（P>0.05），結(jié)果提示頭孢曲松可保護(hù)缺血半暗帶皮層，逆轉(zhuǎn)部分梗死容積、IL-1β表達(dá)。研究提示再灌注損傷早期炎性細(xì)胞激活釋放IL-1β，且隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)炎性細(xì)胞開始逐漸釋放一系列如腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎性介質(zhì)[13-14]。由于IL-1β為缺血損傷早期產(chǎn)生因子，可放大炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子聚集在損傷腦組織血管周圍，同時(shí)IL-1β可促使機(jī)體谷氨酸釋放，加重腦組織缺血、損傷，而頭孢曲松可抑制炎性細(xì)胞活化，阻礙IL-1β釋放，從而達(dá)到保護(hù)腦組織的目的[15]。

綜上所述，臨床在腦缺血再灌注前使用頭孢曲松進(jìn)行預(yù)處理，能降低腦內(nèi)IL-1β炎性因子表達(dá)、分泌，有效減少腦梗死容積、減輕腦神經(jīng)功能損失，對(duì)腦組織起保護(hù)效果。

[參考文獻(xiàn)]

[1]戚翔，賈建麗，蔡勁松，等.不同劑量右美托咪定預(yù)處理對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷炎性反應(yīng)的影響[J].臨床外科雜志，2015，23（11）：852-854.

[2]秦浩，顧麗澤，高麗，等.硫化氫預(yù)處理對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2013， 35（3）：249-253.

[3]楊克紅，劉浩，吳華璞，等.姜黃素預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（10）：1432-1436.

[4]邢東，吳志新，董輝，等.電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血損傷后腦內(nèi)炎癥反應(yīng)及NF-κB的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2017， 46（9）：1155-1158，1195.

[5]肖愛嬌，康明非，張毫，等.艾灸預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠大腦皮質(zhì)caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J].天津醫(yī)藥，2014，42（6）：544-546.

[6]石瑤，郭倩，周也涵，等.白藜蘆醇通過Sirtuins 1通路促進(jìn)自噬減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，35（4）：496-501.

[7]徐正虎，王君.阿托伐他汀預(yù)處理和缺血預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中華老年心腦血管病雜志，2015，17（3）：310-312.

[8]朱芳蕓，張霞婧，朱蕭玲，等.谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2在電針預(yù)處理減輕小鼠全腦缺血再灌注損傷中的作用[J].中華麻醉學(xué)雜志，2013，33（2）：223-227.

[9]李國(guó)福，賈佳，符加紅，等.異氟烷預(yù)處理或后處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的影響[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2014，26（6）：431-435.

[10]王焰斌，楊建安，陳偉新，等.烏司他丁預(yù)處理對(duì)深低溫停循環(huán)主動(dòng)脈手術(shù)患者腦缺血再灌注損傷的影響[J].中華胸心血管外科雜志，2013，29（10）：614-616，626.

[11]方芳，李珍，王烈成，等.白藜蘆醇預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血/再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用和機(jī)制[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（11）：1544-1548.

[12]徐德友，印衛(wèi)兵，沈華超，等.脈血康聯(lián)合阿司匹林預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷的影響[J].江蘇醫(yī)藥，2013， 39（19）：2244-2246.

[13]何丹，楊勢(shì)赫，金志成，等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2015，34（5）：714-720.

[14]陳立英，王會(huì)軍，陶小雪，等.不同預(yù)處理方式對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2015，13（3）：312-314.

[15]任悅義，董河，王世端，等.嗎啡對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦含水量及S100 β的影響[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17（6）：5-7.

（收稿日期：2017-11-22 本文編輯：閆 佩）