豬冠狀動脈微栓塞后心肌細胞凋亡與內質網應激相關蛋白CHOP表達的關系

林崇強 劉濤 唐中力 劉陽春 李浪

[摘要]目的 探討豬冠狀動脈微栓塞（CME）后心肌細胞凋亡與內質網應激相關蛋白C/EBP同源性蛋白（CHOP）表達的關系。方法 將選取的50頭小型豬隨機分為Sham組和CME組，每組25頭。采用介入法經冠脈內注入微栓塞球建立CME模型，Sham組經冠脈內注入等量生理鹽水。根據術后觀察時間點進一步分為3 h組、6 h組、12 h組、24 h組、48 h組，每組5頭。應用超聲心動圖檢測心功能，HE染色觀察心肌組織病理學變化，蘇木素堿性復紅苦味酸（HBFP）染色檢測心肌微梗死面積，缺口末端標記（TUNEL）法檢測心肌細胞凋亡，Western blot檢測心肌組織CHOP、Caspase-3蛋白表達。結果 與相應Sham組比較，CME后各時間點心功能均不同程度下降（P<0.05），CME后12 h心功能下降最明顯。CME后各時間點均可見多發(fā)局灶性微梗死心肌，以心內膜下及左心室為多，無大片壞死，各組間微梗死面積比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與相應Sham組比較，CME組各時間點心肌細胞凋亡指數不同程度增加（P<0.05），CME后12 h心肌細胞凋亡達高峰。凋亡心肌細胞主要位于微梗死區(qū)及其邊緣區(qū)。與相應Sham組比較，CME組各時間點CHOP、Caspase-3蛋白表達不同程度上調（P<0.05），呈動態(tài)變化，CME后12 h達高峰。結論 CME后CHOP蛋白表達上調可能參與內質網應激誘導的心肌細胞凋亡。

[關鍵詞]冠狀動脈微栓塞；凋亡；C/EBP同源蛋白；內質網應激

[中圖分類號] R543.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）4（c）-0009-05

The relationship of myocardial apoptosis and endoplasmic reticulum stress-related protein CHOP in swine following coronary microembolization

LIN Chong-qiang1 LIU Tao2 TANG Zhong-li3 LIU Yang-chun4 LI Lang4

1.Department of Cardiovasolar Medicine，People′s Hospital of Cenxi City in Guangxi Zhuang Autonomous Region，Cenxi 543200，China；2.Department of Cardiovasolar Medicine，Minzu Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530001，China；3.Department of Cardiovasolar Medicine，People′s Hospital of Dao County in Hunan Province，Dao County 425300，China；4.Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530001，China

[Abstract]Objective To investigate the relation of myocardial apoptosis and endoplasmic reticulum stress-related （CME） protein C/EBP homologous protein （CHOP） in swine following coronary microembolization.Methods Fifty swine were selected and randomly divided into the Sham group （n=25） and the CME group （n=25）.Five subgroups were assigned according to time points （3，6，12，24，48 h），5 cases in each group.The CME model was established through injecting microspheres into the coronary artery，while swine in the Sham group received the same dose of normal saline instead.Cardiac function was measured with echocardiography.Histopathological changes were detected with HE.Microinfarction and apoptotic index were detected with hematoxylinbasic fuchsinpicric acid （HBFP） and TUNEL stainings，respectively.The expressions of CHOP and Caspase-3 proteins were determined with Western blot.Results Compared with the Sham groups，the cardiac function was decreased in varying degrees in the corresponding CME groups （P<0.05）.The cardiac function of 12 h following CME was the worst.Microinfarction rather than massive necrosis was found each time points following CME，mainly located in left ventricle and subendocardial myocardium.The difference，however，was not statistically significant （P>0.05）.Compared with the Sham groups，the apoptotic index in the corresponding CME groups were increased in varying degrees （P<0.05）.It peaked 12 h following CME.Apoptotic cardiomyocytes were mainly located in microinfarct area and its border area.Compared with the Sham groups，CHOP protein expression in the corresponding groups following CME enhanced in varying degrees （P<0.05），showing dynamic changes.It peaked 12 h following CME.Conclusion CME induces cardiomyocyte apoptosis and cardiac dysfunction，in which enhanced CHOP and caspase-3 expression may be involved.

[Key words]Coronary microembolization；Apoptosis；CHOP；Endoplasmic reticulum stress

經皮冠狀動脈介入治療（PCI）是目前治療急性ST段抬高型心肌梗死的首選方法[1-2]。然而，即使解除心外膜冠狀動脈阻塞或狹窄，仍有部分患者未能達到心肌水平灌注，稱之為無復流現象。無復流現象是患者遠期預后不良的獨立預測因子，較之PCI術后再灌注良好者，發(fā)生無復流的患者早期梗死后并發(fā)癥（惡性心律失常、心包積液、心包填塞、充血性心力衰竭）、左心室重構、晚期因心衰再次住院率及短期和長期死亡率明顯升高[3]。研究顯示，冠狀動脈微栓塞（CME）是導致PCI術中發(fā)生無復流現象的主要原因之一[4]。PCI術中機械性操作致粥樣斑塊碎片和（或）血栓性碎屑隨前向血流流入遠端微循環(huán)，引起冠狀動脈微循環(huán)堵塞，從而導致心肌微梗死、冠脈血流儲備下降及心臟收縮功能障礙，而目前臨床上對預防CME發(fā)生并無十分有效的措施[5]。目前的研究顯示，心肌細胞凋亡是CME致心肌損傷的重要機制之一[6-7]。除線粒體途徑和死亡受體途徑外，內質網途徑亦被證實參與細胞凋亡調控[8]。CME可導致鈣穩(wěn)態(tài)失衡及氧化應激反應，進而產生內質網應激。當應激持續(xù)存在或較強烈，損傷了內質網功能，且這些反應不足以恢復內質網穩(wěn)態(tài)時，則可激活內質網凋亡通路。C/EBP同源蛋白（CHOP）為內質網應激介導的細胞凋亡的經典標志物之一[9]。關于CHOP在CME后心肌組織表達的動態(tài)變化，目前國內外鮮有研究報道。本實驗擬經冠脈內注射微栓塞球建立豬CME模型，觀察CME后不同時間點心肌細胞凋亡及內質網應激相關蛋白CHOP的表達變化，以探討兩者之間的關系。

1對象與方法

1.1主要儀器與試劑

42 μm微栓塞球（Dynospheres；Dyno Particles；Lillestrom，Norway）；6F JL4.0指引導管（CordisInc.USA）；0.014英寸Runthrough指引導絲（Terumo Medical Corporation，Japan）；1.8F微導管（CordisInc.USA）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，中國）；兔抗豬CHOP、caspase-3抗體（abcam，USA）；兔抗豬GAPDH抗體（Cell Signaling Technology，USA），羊抗兔熒光二抗（LICOR，USA），TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒（Roche，USA）。

1.2 CME模型建立及實驗分組

選取健康巴馬系小型豬50頭，雌雄不限，體質量25～30 kg，由廣西大學動物科學技術學院提供（許可證號：SCXK桂2007-0003）。將其隨機分為Sham組及CME組，每組25頭。以氯胺酮（山西太原藥業(yè)有限公司，國藥準字 H14022824，20 mg/kg）和阿托品（河南天方藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H41020290， 2 mg/頭）誘導麻醉成功后，以地西泮（山西太原藥業(yè)有限公司，國藥準字 H14021957）靜脈注射維持鎮(zhèn)靜。對右側腹股溝區(qū)行常規(guī)消毒鋪巾，2%利多卡因（山東圣魯制藥有限公司，國藥準字 H20063986）局部麻醉。分離并穿刺右側股動脈，成功后置入6F橈動脈鞘管，鞘內注入肝素（北京雙鶴藥業(yè)有限公司，國藥準字 H110 20963）200 U/kg達肝素化，繼以100 U/kg/h維持。經鞘管送入6F JL指引導管并行冠脈造影確定前降支，而后在指引導絲支撐下送入1.8F微導管至前降支中段，經微導管于40 min內注入10萬個微栓塞球（懸浮于生理鹽水中，濃度為1×104個/ml）10 ml，Sham組經冠脈內注入等量生理鹽水，術畢肌內注射青霉素（桂林南藥股份有限公司，國藥準字 H45021515）80萬單位預防感染。每組實驗動物按觀察時間點不同進一步分為3 h組、6 h組、12 h組、24 h組及48 h組，每組5頭。

1.3觀察指標及檢測方法

1.3.1心功能檢測 各組動物分別于術后相應時間點行心功能檢查。右側臥位固定，使用GE VIVID 7型超聲心動圖儀，探頭頻率1.5～4.3 MHz，分別沿胸骨旁左室長軸及短軸切面檢測左室射血分數（LVEF）、左室舒張期末徑（LVEDD）、短軸縮短率（FS）及心排血量（CO）。所有圖像采集均由一名超聲科?？漆t(yī)生完成。

1.3.2心肌組織取材 檢測心功能后，經耳緣靜脈注入10 ml 10%氯化鉀（桂林南藥股份有限公司，國藥準字 H45020099），使心臟停博于心室舒張期，迅速取出心臟，生理鹽水沖洗干凈。取材部位為前降支中段以遠所支配的心肌組織。部分心肌組織立即轉移至-80℃冰箱保存，用于Western blot檢測，其余用4%多聚甲醛固定后用于組織病理學檢測。

1.3.3蘇木素堿性復紅苦味酸（HBFP）染色檢測心肌微梗死面積 HBFP是一種檢測早期心肌缺血及梗死的重要方法。正常心肌組織染成黃色，缺血心肌呈紅色。每組選取5張切片行HBFP染色，每張片隨機選取5個視野（×100），使用DMR+Q550病理圖像分析儀（Leica，Germany）觀察，采用Leica Qwin分析軟件（Leica，Germany）以平面法測量紅色梗死區(qū)域，梗死面積表示為總分析切片面積的百分比，取平均值。

1.3.4缺口末端標記（TUNEL）染色檢測心肌細胞凋亡 嚴格按照TUNEL檢測試劑盒說明操作。切片常規(guī)脫蠟，胰蛋白酶K37℃孵育30 min，加入TUNEL反應液，37℃孵育60 min，加入轉化劑（POD）37℃孵育30 min及DAB底物溶液室溫孵育3 min，封片后于400倍光學顯微鏡下隨機選取10～15個不重疊視野觀察。TUNEL陽性信號定位于細胞核，正常細胞呈淡藍色，凋亡細胞呈棕黃色，同時結合形態(tài)學特征（細胞體積縮小、核染色質致密及核碎裂）判斷凋亡心肌細胞，計算心肌細胞凋亡指數（凋亡指數=凋亡細胞/總細胞數×100%）。

1.3.5 Western blot檢測CHOP、Caspase-3蛋白表達 應用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑PMSF）提取心肌組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，每孔50 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，半干轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜（anti-CHOP抗體，1∶1000；anti-Caspase-3抗體，1∶1000），熒光二抗（1∶5000）室溫避光孵育1 h，使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件（Bio-Rad，USA）測量條帶灰度值，以內參GAPDH校正后的灰度值比值表示蛋白相對表達水平。

1.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson相關性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組不同時間點心功能變化的比較

與Sham組比較，CME組各時間點心功能均不同程度下降，表現為LVEF、FS、CO下降及LVEDD增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Sham組內不同時間點的心功能指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。CME組內比較：LVEF 12 h組、FS 12 h組、LVEDD 12 h組與其余時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；LVEF 6 h組、FS 6 h組與24 h組及48 h比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

表1 各組不同時間點心功能指標動態(tài)變化的比較（x±s）

與Sham組相應時間點比較，aP<0.05；與CME后3、6、24、48 h比較，bP<0.05；與CME后24、48 h比較，cP<0.05

2.2 CME后心肌組織病理學改變分析

HE染色示微栓塞球沿微血管走行分布，周圍可見心肌微梗死灶，多為楔形，呈局灶性分布，微梗死灶內心肌細胞核溶解或消失，胞質紅染，周圍心肌水腫，炎性細胞浸潤明顯（圖1）。HBFP染色示Sham組偶見心內膜下缺血，無明顯心肌梗死。CME組各時間點均可見明顯多發(fā)性局灶性心肌微梗死，非透壁性，以心內膜下及左心室多見。CME組各時間點心肌微梗死面積比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖2）。

a b

a：Sham組12 h；b：CME組12 h

與Sham組比較，CME組可見明顯微梗死灶，周圍炎性細胞浸潤。箭頭所指為微栓塞球

圖1 豬CME后12h心肌組織病理學改變（HE染色，×100）

a b

a：Sham組12 h；b：CME組12 h

正常組織呈黃色，缺血或梗死組織呈紅色。黑色箭頭所指為微栓塞球，白色箭頭所指為紅染的微梗死灶

圖2 豬CME后心肌組織微梗死（HBFP染色，×100）

2.3 CME后心肌細胞凋亡變化分析

采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，陽性染色信號定位于心肌細胞核內，凋亡細胞呈棕黃色，正常心肌細胞核呈淡藍色。Sham組心內膜下少許散在分布的凋亡細胞，各時間點比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與相應Sham組比較，CME組各時間點心肌細胞凋亡指數均不同程度上升（P<0.05）。凋亡心肌細胞主要位于微梗死灶內及其周邊。CME后3 h心肌細胞凋亡指數升高，6 h升高更明顯，12 h達高峰，24 h呈下降趨勢，48 h已明顯下降，但仍較Sham組為高（圖3）。

a～f分別為sham組12 h、CME組3 h、CME組6 h、CME組12 h、CME組24 h及CME組48 h與Sham組各時間點比較，aP<0.05；與CME后3、6、24、48 h組比較，bP<0.05；與CME后6、24、48 h組比較，cP<0.05

圖3 不同時間點心肌細胞凋亡指數（×400）

2.4 CME后心肌組織CHOP、Caspase-3蛋白表達變化

Sham組不同時間點的CHOP、Caspase-3蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與相應Sham組比較，CME組各時間點的心肌組織CHOP、Caspase-3蛋白表達均不同程度升高（P<0.05），呈動態(tài)變化，CME后12 h表達達高峰（圖4、圖5）。

與相應時間點Sham組比較，aP<0.05；與CME組3、6、24、48 h組比較，bP<0.05；與CME組3、48 h組比較，cP<0.05

圖4 Western blot 檢測sham組及CME組不同時間點CHOP蛋白相對表達水平

與相應時間點Sham組比較，aP<0.05；與CME組3、6、24、48 h組比較，bP<0.05；與CME組3、6、48 h組比較，cP<0.05

圖5 Western blot 檢測Sham組及CME組不同時間點Caspase-3蛋白相對表達水平

2.5相關性分析

CME組各時間點心肌細胞凋亡指數與CHOP、Caspase-3蛋白表達呈正相關關系（分別為r=0.615，P<0.05；r=0.901，P<0.05），與主要心功能指標LVEF呈負相關關系（r=-0.509，P<0.05）。

3討論

本實驗研究結果提示，豬CME后心功能下降，心肌細胞凋亡指數增加，CHOP蛋白表達上調，呈動態(tài)變化。相關性分析提示心肌細胞凋亡指數與CHOP蛋白表達呈明顯正相關。心肌細胞凋亡可能與CME后內質網應激相關蛋白CHOP表達上調有關。

CME是PCI術中常見且棘手的并發(fā)癥，可導致無復流現象的發(fā)生，是患者遠期預后不良的強烈預測因子[10-11]。臨床研究及動物實驗研究提示，CME可導致惡性心律失常，冠脈血流儲備下降，心功能進行性惡化，血清心肌損傷標志物升高，組織病理學提示心肌微梗死及細胞凋亡[12]。凋亡是受多基因嚴格調控的自主的程序性細胞死亡，心肌細胞凋亡參與多種心血管疾病病理生理過程，包括急性心肌梗死、慢性心力衰竭及心肌缺血再灌注損傷等[13]。筆者近期的研究提示，CME后存在心肌細胞凋亡，抑制心肌細胞凋亡可改善CEM后心功能，提示凋亡為CME致心肌損傷重要機制之一[14-15]。

目前已知的3條凋亡調控通路中，內質網應激介導的凋亡途徑是新近發(fā)現的凋亡信號通路，且愈發(fā)受到關注[16]。內質網是蛋白折疊、鈣體內平衡及脂質生物合成的細胞器。多種病理因素（如氧化應激、缺血、Ca2+耗竭、蛋白轉運異常等）刺激內質網腔未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的聚集導致內質網功能障礙，即內質網應激。細胞通過啟動未折疊蛋白反應以減少蛋白合成、增加未折疊蛋白降解，從而使細胞適應內質網應激。然而，如果內質網應激過強或持續(xù)存在，細胞便可啟動凋亡信號通路，如誘導促凋亡轉錄因子CHOP表達、活化c-Jun氨基末端激酶（JNK）及胱天蛋白酶-12（Caspase-12）。目前的研究提示，未折疊蛋白反應及內質網介導的細胞凋亡參與多種心血管疾病病理生理過程，如心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷及動脈粥樣硬化[17-18]。CHOP是內質網凋亡途徑中關鍵的轉錄因子之一，在生理狀態(tài)下，CHOP表達極低[19-20]。Thorp等[21]的研究發(fā)現，CHOP-/-小鼠與CHOP+/+小鼠及Ldlr-/-小鼠雜交后代比較，斑塊的壞死及凋亡均顯著減少，提示內質網應激啟動的CHOP表達上調與斑塊的壞死、凋亡密切相關。本實驗研究結果顯示，豬CME后3 h CHOP蛋白表達上調，6 h上調更顯著，12 h達高峰，24～48 h呈持續(xù)性下降，但仍較相應時間點假手術組為高。其動態(tài)變化規(guī)律與CME后心肌細胞凋亡動態(tài)變化符合，提示CHOP介導的內質網應激可能參與CME致心肌細胞凋亡。

綜上所述，CME急性期心肌細胞凋亡呈動態(tài)變化，12 h達高峰，內質網應激相關蛋白CHOP表達上調可能參與CME致心肌細胞凋亡。CHOP有望成為防治CME致心肌損傷的新靶點。

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（收稿日期：201711-10 本文編輯：祁海文）