二甲雙胍對結腸癌細胞增殖的影響

張斯萌 張曄 車曉芳 曲秀娟 劉云鵬

結直腸癌是世界范圍內高發(fā)病率及高死亡率的惡性腫瘤之一。在我國，根據(jù)最新的研究統(tǒng)計，結直腸癌在近年來發(fā)病率與死亡率均呈上升趨勢［1］。盡管手術治療能夠作為早期結直腸癌的根治手段，但是仍有近一半的患者會進展到晚期。藥物治療是治療轉移性結直腸癌的主要方式。然而，腫瘤的異質性以及耐藥的發(fā)生卻極大限制了藥物的作用和療效，因此，進一步篩選有效的治療藥物是解決上述問題的關鍵之一。二甲雙胍是用于治療II型糖尿病的口服雙胍類降糖藥。近來研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍除了降糖作用外，還具有抗腫瘤作用。一項薈萃分析的結果證實，二甲雙胍能夠有效改善前列腺癌與結直腸癌患者的預后［2］。在結直腸癌中，二甲雙胍抑制腫瘤的作用尚不明確，本研究通過結腸癌細胞HT29為模型，探究二甲雙胍對結腸癌細胞的抑制作用及可能機制。

資料與方法

一、主要試劑與儀器

（一）主要試劑

RPMI1640（Gibco公司）；胎牛血清（天津血液病研究所）；IGF1R、p-IFG1R、Akt、p-Akt、Erk、p-Erk、Actin抗體（美國 Cell Signalling Technology公司）；MTT（美國 Sigma公司）；羊抗鼠和羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗（北京中杉金橋技術有限公司）；ECL試劑盒（PIERCE 公司）。

（二）主要儀器

熒光顯微鏡（日本，OLYMPUS）；UP50超聲粉碎儀（德國，Dr.Hielscher公司）；TLL-C臺式高速冷凍離心機（北京四環(huán)科學儀器廠）；DYY-Ⅲ型電泳槽（北京市六一儀器廠）；Tanon EPS 300電泳儀（上海天能科技有限公司）；500型酶標儀（美國，BIO-RAD 公司）；CK 40倒置顯微鏡（日本，OLYMPUS 公司）；4 ℃/-20 ℃電冰箱（海爾集團公司）；-80 ℃深低溫冰箱（日本，SANYO公司）；超凈臺（蘇州凈化設備廠）；SYQ·MDX-280高壓鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；HH·SII-1水浴箱（北京長安科學儀器廠）。

二、實驗方法

（一）細胞培養(yǎng)

結腸癌細胞株HT29于本實驗室進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，生長于含有10%滅活胎牛血清、12 U/mL慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，0.25%胰酶消化液消化傳代，2～3天傳代一次。所有實驗均采用對數(shù)生長期細胞。

（二）MTT法檢測二甲雙胍對結腸癌細胞的抑制作用

將結腸癌細胞株HT29計數(shù)3 000個細胞，配置成200 μl 10%去除外泌體血清的條件培養(yǎng)基，混勻后種與96孔板，設置處理組及對照組，并將無細胞單獨培養(yǎng)基設置為空白對照組，每組3個副孔。待細胞貼壁后加入不同濃度的二甲雙胍（0、0.1、1、5、10 mmol/L），并放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h。取出96孔板，于每孔加入20 μl MTT溶液，輕搖混勻，置于在37 ℃培養(yǎng)箱中4小時，棄上清后每孔加入200 μl二甲基亞砜（DMSO）溶液，置于水平搖床充分混勻5～10分鐘，酶標儀在570 nm波長下檢測光密度（OD）值，根據(jù)OD值計算西妥昔單抗對HT29細胞的增殖抑制率。

（三）蛋白免疫印跡法檢測結腸癌細胞增殖信號通路變化

分別收集對照組與處理組細胞裂解于70 μl含有蛋白酶抑制劑（100 μg/mL PMSF，2 μg/mL Aprotitin） 的 RIPA裂 解 液 中［0.1%SDS，1%Triton-100，150 mmol/LNaCl，1 mmol/L EDTA（PH8.0），10 mmol/L Tris-HCl（PH 7.5）］，4 ℃裂解40 min，13 000 rpm離心20分鐘，吸取上清，考馬斯亮藍方法進行蛋白定量。與3×樣品緩沖液混合后，煮沸5分鐘。將樣品（30～50 μg/lane）在12%的SDS-聚丙烯凝膠中進行電泳2～3小時，然后轉印至PVDF膜上（電壓：2 mV/cm2；時間：120分鐘）。用5%脫脂牛奶封閉1小時后，按預染Marker標記的分子量剪裁轉印膜，分別加入兔抗人p-IGF1R（1：500）、IGF1R（1：1 000）、p-Akt（1：500），Akt（1：1 000），p-Erk（1：500），Erk（1：1 000），GAPDH（1：1 000）抗體4 ℃過夜。TTBS洗4次后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠（1：1 000）或羊抗兔二抗（1：1 000）室溫作用30 min，ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析處理。

（四）統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗結果，以均值±標準差（x±s）表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組之間比較采用t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、不同濃度的二甲雙胍對結腸癌細胞HT29增殖的影響

利用不同濃度的二甲雙胍（0、0.1、1、5、10 mmol/L）分別處理HT29 48 h，MTT實驗檢測二甲雙胍對結腸癌細胞株增殖的影響。結果發(fā)現(xiàn)，在二甲雙胍的作用下，HT29細胞株用藥組相比對照組增殖率下降且呈二甲雙胍濃度依賴性（1mM：t值=4.323，P＜0.05；5mM：t值=6.11，P＜0.01；10mM：t值=9.449，P＜0.001），說明二甲雙胍能夠抑制結腸癌細胞株HT29的增殖（圖1）。

二、二甲雙胍通過阻斷胰島素樣生長因子受體（IGF1R）抑制下游蛋白激酶B（Akt）與細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK) 信號影響結腸癌細胞增殖

利用二甲雙胍（5 mmol/L）分別處理HT29細胞0、2、4、8、16、24、48 h后，蛋白免疫印跡法檢測增殖標志蛋白Akt、Erk表達變化。結果發(fā)現(xiàn)，在二甲雙胍作用16、24、48 h，Akt與Erk磷酸化水平受到抑制，提示二甲雙胍通過抑制Akt/Erk增殖信號通路實現(xiàn)抑制結腸癌細胞增殖的作用（圖2）。為進一步探究其作用機制，利用二甲雙胍（5 mmol/L）處理HT29細胞0、24、48 h，蛋白免疫印跡法檢測Akt/Erk上游IGF1R蛋白表達變化，結果發(fā)現(xiàn)，在二甲雙胍的作用下，IGF1R磷酸化水平受到抑制且呈時間依賴性，上述結果說明，二甲雙胍通過阻斷IGF1R及下游Akt/Erk信號進而抑制結腸癌細胞增殖（圖3）。

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可改善多種腫瘤的預后。在乳腺癌中，糖尿病患者接受二甲雙胍聯(lián)合新輔助化療相比單純應用新輔助化療，具有更高的病理完全緩解（pCR）率，并且可作為pCR的獨立預測指標［3］。Chen等［4］發(fā)現(xiàn)，在接受射頻消融治療后的糖尿病肝細胞癌患者，應用二甲雙胍能夠有效延長總生存。針對結直腸癌，二甲雙胍同樣能夠提高糖尿病結直腸癌患者的生存獲益［5］。相比之下，對于非糖尿病結直腸癌人群，二甲雙胍對于預后的影響仍存在爭議［2，6］。此外，對于結腸腸癌細胞，二甲雙胍抑制腫瘤的作用機制尚不明確。本研究通過對結腸癌HT29細胞株的研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的二甲雙胍能夠抑制結腸癌細胞的增殖能力，證實二甲雙胍對于結腸癌細胞的抑制作用。另有研究指出，二甲雙胍能夠通過阻滯細胞周期并下調細胞周期蛋白D1的表達抑制結腸癌細胞SW-480增殖［7］。為進一步探究二甲雙胍抑制HT29細胞增殖的機制，利用蛋白免疫印跡法檢測HT29細胞增殖相關蛋白Akt、Erk在二甲雙胍作用下表達水平變化。結果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠下調磷酸化Akt與磷酸化Erk的表達水平，證實其通過抑制Akt/Erk信號調節(jié)結腸癌細胞增殖。

二甲雙胍作為降糖藥，能夠降低血漿中的胰島素水平，而胰島素與胰島素樣生長因子參與調節(jié)（insulin-like growth factors, IGFs）細胞生長與能量代謝［8］。IGFs與IGF1R相結合能夠激活IGFs依賴性信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移能力。既往研究發(fā)現(xiàn)，IGF1R能夠激活下游Akt、Erk信號促進胃癌細胞增殖，而阻斷IGF1R后，能夠恢腸癌細胞對化療的敏感性［9］。為進一步驗證IGF1R是否參與二甲雙胍對結腸癌細胞Akt、Erk蛋白表達的負向調控過程，利用二甲雙胍處理HT29細胞后，蛋白免疫印跡檢測IGF1R表達水平變化發(fā)現(xiàn)，IGF1R磷酸化水平受到抑制，證實二甲雙胍能夠通過阻斷IGF1R抑制下游Akt、Erk信號負向調控細胞增殖。除了上述胰島素依賴性調控機制以外，二甲雙胍還可通過其他方式調節(jié)腫瘤的生物學行為。Shackelford DB等［10］發(fā)現(xiàn)，LKB1作為抑癌基因，是激活AMP依賴性激酶（Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK）的關鍵上游分子。在LKB1缺失的非小細胞肺癌細胞中，利用二甲雙胍類似物苯乙雙胍處理能夠激活AMPK并誘導細胞凋亡。與此同時，AMPK不僅能夠負向調控腫瘤細胞的有氧糖酵解（Warburg effect）過程從而抑制腫瘤細胞生長，還能夠通過激活結節(jié)硬化復合體2與1相結合，調節(jié)mTOR活性影響細胞生長［11］。此外，二甲雙胍還可以通過依賴AMPK激活間接調節(jié)脂肪酸合成酶并影響腫瘤細胞的增殖［12］。在本研究中，二甲雙胍是否能夠通過上述機制調節(jié)結直腸癌細胞還需要進一步的探索。

圖1 MTT驗證不同濃度的二甲雙胍（0、0.1、1、5、10 mmol/L）作用HT29細胞48小時后，細胞增殖率的影響。（*t值=4.323，P＜0.05；**t值=6.11，P＜0.01；***t值=9.449，P＜0.001) 圖2 二甲雙胍（5 mmol/L）作用HT29細胞不同時間后，對p-Akt，Akt，p-Erk，Erk與Actin蛋白表達的影響 圖3 二甲雙胍（5 mmol/L）作用HT29細胞0、24、48 h后，對p-IGF1R，IGF1R與Actin蛋白表達的影響

綜上所述，二甲雙胍能夠通過阻斷IGF1R，抑制下游Akt、Erk信號負向調控結腸癌細胞增殖。本研究結果證實二甲雙胍在結腸癌細胞中的抗腫瘤作用，為深入探討二甲雙胍在結腸癌中的作用機制及進一步開展二甲雙胍的臨床研究提供了新的理論依據(jù)。

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