藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體基因多態(tài)性對伊立替康治療結(jié)直腸癌患者所致嚴(yán)重不良反應(yīng)的影響

馬超 金焰 段希斌 曹巍 邢國臣 易善永 李學(xué)民 王曉飛

結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和致死率均較高［1-2］。目前，外科手術(shù)是治療結(jié)直腸癌有效的手段之一，但多數(shù)患者就診時(shí)己是中晚期，失去手術(shù)治療時(shí)機(jī)，一般選擇化療。伊立替康聯(lián)合氟尿嘧啶是臨床上治療晚期結(jié)直腸癌的一線化療方案，其有效率較高，但同時(shí)不良反應(yīng)也較高，這限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，因此，探討伊立替康毒性及療效的預(yù)測因素對提高伊立替康的安全性和有效性具有重要意義［3］。

伊立替康是一種前體藥物，在肝臟內(nèi)經(jīng)羧酸酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物SN-38，繼而發(fā)揮抗腫瘤活性。SN-38經(jīng)肝臟尿苷二磷酸葡醛酰轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphate glucuronyltransferase，UGT）滅活，生成葡萄糖醛酸化SN-38 （SN-38G）［4］，從而保護(hù)健康細(xì)胞免受伊立替康毒性的影響。一少部分SN-38G、伊立替康及其代謝物隨尿液排出體外，但大部分SN-38G經(jīng)膽汁分泌進(jìn)入腸道，并在腸道β-葡萄糖醛酸酶的作用下重新轉(zhuǎn)換為SN-38，從而引起腸道黏膜損害，導(dǎo)致遲發(fā)性腹瀉的發(fā)生［5］。UGT1A1影響伊立替康活性產(chǎn)物SN-38與滅活產(chǎn)物SN-38G的相互轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致毒性的個(gè)體差異，這一方面已有大量文獻(xiàn)進(jìn)行研究。而ABC（ATP-bindingcassette transporter，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族主要負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的伊立替康、SN-38 及代謝物轉(zhuǎn)至胞外，因此推測，其遺傳多態(tài)性也是造成伊立替康毒性個(gè)體差異的原因之一。但有關(guān)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體遺傳多態(tài)性對伊立替康毒性的影響研究相對較少。本研究主要選用治療方案包含伊立替康的結(jié)直腸癌患者，分析ABCB1-3435C＞T和ABCC2-24C＞T基因多態(tài)性與3級以上遲發(fā)性腹瀉和中性粒細(xì)胞減少發(fā)生率之間的關(guān)系，探討伊立替康嚴(yán)重毒性反應(yīng)的遺傳因素，為結(jié)直腸癌患者使用伊立替康進(jìn)行個(gè)體化治療提供依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選取2014年1月至2016年12月鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院腫瘤科及胃腸外科收治的晚期結(jié)直腸癌患者91例，全部接受伊立替康治療，且在實(shí)驗(yàn)前簽署知情同意書。受試者在化療前進(jìn)行如下檢查：骨髓造血功能，肝、腎功能和Karnofsky評分?；熐?，抽取患者外周靜脈血2～3 ml，用EDTA抗凝。該研究方案獲得鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①不可切除或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者；②年齡范圍：20～80歲；③入組前四周內(nèi)未經(jīng)歷外科手術(shù)、化療和放療；④預(yù)計(jì)生存期＞3個(gè)月；⑤臟器功能達(dá)到基線水平，即白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞4×109/L，血小板計(jì)數(shù)＞1×1011/L，血紅蛋白＞9×103g/L，中性粒細(xì)胞數(shù)＞2×109/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）＜35 U/L，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）＜40 U/L，血清肌酸酐＜1.5 g/L，總膽紅素＜1.5 g/L。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重的傳染病或并發(fā)癥（如肺纖維化或間質(zhì)性肺炎，不可控制的糖尿?。虎趪?yán)重的胸腔積液或腹腔積液；③慢性腹瀉、麻痹性腸梗阻或腸梗阻；④有藥物過敏史。

二、研究方法

（一）外周血基因組DNA提取

參照血液基因組DNA提取試劑盒說明書，采用柱提取法提取患者外周血基因組DNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）基因分型采用PCR擴(kuò)增目的片段，產(chǎn)物直接測序分析

1. ABCB1-3435C＞T基因分型

PCR擴(kuò)增引物序列為：正向引物序列5′-TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3′，反向引物序列 5′-ACATTAGGCAGTGACTCGATGAAGGCA-3′，25 μl PCR反應(yīng)體系包括：8.5 μl滅菌超純水，12.5 μl 2×Taq PCR Master Mix，1 μl上游引物（10 μM），1 μl下游引物（10 μM），2 μl DNA模板。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。

2. ABCC2-24C＞T基因分型

PCR擴(kuò)增引物序列為：正向引物序列5′-CTGTTCCACTTTCTTTGATGA-3′，反向引物序列5′-TCTTGTTGGTGACCACCCTAA-3′，25 μl PCR 反應(yīng)體系包括：8.5 μl滅菌超純水，12.5 μl 2×Taq PCR Master Mix，1 μl上游引物（10 μM），1 μl下游引物（10 μM），2 μl DNA模板。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃12 min；93 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，依據(jù)PCR產(chǎn)物片段大小，初步檢測PCR的特異性，符合標(biāo)準(zhǔn)后，直接測序，分析ABCB1-3435C＞T和ABCC2 -24C＞T 基因型。

三、病例資料收集

觀察并記錄患者發(fā)生遲發(fā)性腹瀉、中性粒細(xì)胞減少等不良反應(yīng)的發(fā)生情況，根據(jù)美國國立癌癥研究院（National Cancer Institute，NCI）提出的腫瘤藥物不良反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)NCI-CTC（4.0）對藥物毒性進(jìn)行評價(jià)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17. 0 軟件分析數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s精確概率法比較各基因型之間的不良反應(yīng)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ABCB1-3435C＞T和ABCC2 -24C＞T基因分型結(jié)果

本研究共包括結(jié)直腸癌患者91例，其中男性59例，女性32例，年齡范圍36～77歲，平均年齡62.4歲；體重范圍46～80 Kg，平均體重59.1 Kg。ABCB1-3435C＞T基因分型結(jié)果為：CC型44例、CT型34例和TT型13例；ABCC2-24C＞T基因分型結(jié)果為：CC型65例、CT型23例和TT型3例。91例受試者，有50例為首次使用包含伊立替康的治療方案，41例為非首次使用包含伊立替康的治療方案。ABCB1-3435C＞T和ABCC2-24C＞T基因型和等位基因分布頻率見表1，所有單核苷酸多態(tài)性（SNPs）分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

二、ABCB1-3435C＞T和ABCC2-24C＞T基因多態(tài)性與伊立替康所致嚴(yán)重不良反應(yīng)的關(guān)系

本研究選取91例使用伊立替康治療的結(jié)直腸癌患者，其中14例發(fā)生3～4級遲發(fā)性腹瀉，36例發(fā)生3～4級中性粒細(xì)胞減少。在使用伊立替康的患者中，有50例患者為首次使用該藥，41例患者為非首次使用該藥，兩者之間嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.583，P=0.445；χ2=0.276，P=0.599）。

表1 受試者ABCB1-3435C＞T和ABCC2 -24C＞T基因型及等位基因分布頻率

ABCB1-3435C＞T 三個(gè)基因型CC、CT和TT，3～4級遲發(fā)性腹瀉和中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.237，P=0.888；χ2=2.139，P=0.343）。

ABCC2-24C＞T 三個(gè)基因型CC、CT和TT，3～4級遲發(fā)性腹瀉的發(fā)生頻數(shù)分別為6、7和1；3～4級中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生頻數(shù)分別為22、12和2。在比較嚴(yán)重化療毒性的發(fā)生差異時(shí)，由于TT型例數(shù)較少，僅有3例，我們將突變純合子TT型和突變雜合子CT型合并后，與野生純合子CC型比較，結(jié)果顯示遲發(fā)性腹瀉的發(fā)生情況在兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.067，P=0.024），而中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生情況在兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.107，P=0.078），見表2。

討 論

在我國，隨著人們飲食習(xí)慣、生活習(xí)性及居住環(huán)境的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢［6］。結(jié)直腸癌具有早期癥狀隱匿、臨床表現(xiàn)缺乏特異性及易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移等特征，這造成了15～25%的患者在初次就診時(shí)就已經(jīng)屬于晚期且合并肝轉(zhuǎn)移［7］，錯(cuò)過了根治性手術(shù)治療的最佳時(shí)期。目前，伊立替康聯(lián)合氟尿嘧啶是臨床上治療晚期結(jié)直腸癌標(biāo)準(zhǔn)的一線化療方案，有效率在40%以上，可顯著延長患者的生存期。但該方案的應(yīng)用受到嚴(yán)重不良反應(yīng)的限制，且個(gè)體間差異較大［8］，這種毒副作用通常被認(rèn)為與遺傳因素有關(guān)。近些年研究的焦點(diǎn)集中在伊立替康活性代謝產(chǎn)物的主要代謝酶UGT1A1，其基因多態(tài)性可使酶的活性存在差異，前期我們也做了這方面的相關(guān)研究。此外，由于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的伊立替康、SN-38 及其它代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，我們推測ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因多態(tài)性可能也會影響伊立替康轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的能力，從而影響藥物毒性。

表2 ABCB1-3435C＞T和ABCC2 -24C＞T基因多態(tài)性與伊立替康所致嚴(yán)重不良反應(yīng)的關(guān)系

P-糖蛋白是人體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有較廣泛的作用底物，在藥物代謝過程中起重要作用。當(dāng)其編碼基因ABCB1發(fā)生變異時(shí)，則引起P-糖蛋白表達(dá)與活性的改變［9-10］。ABCB1-3435C＞T基因多態(tài)性在中國人群中具有較高的突變頻率。曾有研究報(bào)道，野生純合子CC型P-糖蛋白的表達(dá)量較突變純合子TT型高出2倍［11-12］；還有研究結(jié)果顯示，CC型個(gè)體在接受化療后具有更好的臨床療效，ABCB1基因多態(tài)性通常被認(rèn)為與伊立替康的藥效學(xué)和藥動學(xué)有關(guān)［13-15］。Lin等［16］研究表明，ABCB1-3435C＞T突變純合子TT型能夠顯著降低ABCB1蛋白的表達(dá)，具有TT基因型的患者藥物轉(zhuǎn)出細(xì)胞的能力較弱，從而導(dǎo)致伊立替康毒性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)降低。還有一項(xiàng)關(guān)于伊立替康毒性的研究結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致［17］，研究者認(rèn)為，攜帶ABCB1-3435C＞T多態(tài)性T等位基因的患者，發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)低于C等位基因。但Glimelius等的研究與之相反，他們的研究結(jié)果顯示，ABCB1-3435C＞T TT型能夠顯著增加伊立替康早期毒性的風(fēng)險(xiǎn)［18］。在本研究中，我們對91例治療方案包含伊立替康的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行研究，比較ABCB1-3435C＞T不同基因型之間嚴(yán)重化療毒性的發(fā)生情況，結(jié)果顯示，三個(gè)基因型之間3級以上遲發(fā)性腹瀉和中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生情況均無顯著性差異，這可能是由于臨床上為了避免伊立替康引起嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，有意降低伊立替康劑量，從而造成ABCB1-3435C＞T突變對其伊立替康毒性的影響結(jié)果不一致。Ⅱ期臨床研究顯示，大約40%的患者可能夠耐受更高的伊立替康劑量達(dá)500～700 mg/m2［19］，這就迫切需要找到能夠精準(zhǔn)預(yù)測伊立替康嚴(yán)重毒性反應(yīng)的標(biāo)志物，篩選出少數(shù)僅能使用較低劑量的人群和多數(shù)可使用較高劑量的人群，從而提高臨床療效，降低毒性。

多藥耐藥相關(guān)蛋白 2（MRP2），也叫ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由ABCC2基因編碼。這是一種ATP 結(jié)合盒外排性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對底物化合物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用。因此，ABCC2 基因單核苷酸多態(tài)性可能是引起許多臨床藥物反應(yīng)個(gè)體差異的重要因素。Innocenti等［20］對85個(gè)使用伊立替康治療的癌癥患者進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABCC2-24C＞T多態(tài)性T等位基因?qū)σ亮⑻婵邓巹訉W(xué)與藥效學(xué)均有顯著影響。本研究結(jié)果顯示，ABCC2-24C＞T基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌患者伊立替康所致嚴(yán)重腹瀉有關(guān)，這可能是由于ABCC2-24C＞T突變造成ABCC2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力減弱，伊立替康及代謝物在細(xì)胞內(nèi)大量聚集，導(dǎo)致毒性增強(qiáng)所致。此外，ABCC2-24C＞T三個(gè)基因型CC、CT和TT之間中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生頻率也有差異，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.078），這可能與樣本例數(shù)較少有關(guān)。在今后的研究中，如果能加大樣本量，可以更好的確定ABCC2-24C＞T基因多態(tài)性對伊立替康所致中性粒細(xì)胞減少的影響。

由于伊立替康在臨床上的普遍應(yīng)用，其毒性一直受到廣泛關(guān)注。近年來大家聚焦的中心在于其主要代謝酶UGT1A1基因多態(tài)性對其毒性的影響，也普遍認(rèn)為UGT1A1*28和*6對結(jié)直腸癌患者伊立替康毒性反應(yīng)影響較大，我們前期的研究也能夠證明此觀點(diǎn)［21］。此外，參與伊立替康處置過程的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCB1和ABCC2的影響仍不可忽視。本研究結(jié)果顯示，ABCC2-24C＞T基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌患者伊立替康所致遲發(fā)性腹瀉有關(guān)，但由于目前該方面相關(guān)文獻(xiàn)較少，我們?nèi)孕柽M(jìn)行大樣本量多中心的驗(yàn)證。

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