卷丹百合提取物對4 ℃有氧冷藏草魚肉片中優(yōu)勢腐敗菌的抑菌效果

李樹紅，鐘海霞，李松，楊娟，蔣光陽，林靈，白稚子，吳睿，李美良

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)2(達州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川 達州，635000)

草魚(Ctenopharyngodonidellus)作為我國主要淡水經(jīng)濟魚類，年養(yǎng)殖量達507萬t，同時因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，產(chǎn)量和消費量都位居我國淡水魚首位[1]。淡水魚小包裝生鮮制品食用方便，需求量大，深受廣大消費者的喜愛，顯示出巨大的市場潛力，加工前景廣闊。然而影響淡水魚初級加工生鮮制品品質(zhì)的因素，除原料的新鮮度外，主要還包括加工方式、貯藏條件及銷售方式等。由于魚具有明顯的易腐性，淡水魚生鮮制品的貯藏條件就顯得尤為重要。GENNARI[2]等研究表明在高于凍結(jié)溫度的條件下，魚肉隨著細(xì)菌的生長繁殖易于腐敗變質(zhì)。根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果，在特定條件下，魚體所含微生物只有部分參與腐敗過程，這些適宜生存且大量繁殖并產(chǎn)生異味代謝產(chǎn)物的微生物，被稱作特定腐敗菌(specific spoilage organisms, SSO)[3-4]。而魚肉片在有氧低溫貯藏時，同樣是有利于少數(shù)特定優(yōu)勢菌群生存繁殖并產(chǎn)生腐敗相關(guān)代謝產(chǎn)物。研究表明有氧低溫貯藏(1～15 ℃)條件下淡水魚原料魚肉的特定腐敗菌主要有假單胞菌(Pseudomonasspp.)、腐敗希瓦氏菌(Shewanellaspp.)、氣單胞菌屬(Aeromonas)和乳酸菌(Lactobacillus)等[5-8]。王發(fā)祥等[9]通過BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)，初步鑒定出未去皮草魚肉塊，4 ℃冷藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌主要為：鄉(xiāng)間不丘氏菌(Buttiauxellagaviniae)、草莓假單胞菌(Pseudomonasfragi)、熱殺索絲菌(Brochothrixthermosphacta)等。魚類生鮮初級加工制品，其處理方式有多種。在對魚片進行分割冷藏時，分不去皮和去皮魚片。目前對草魚有氧冷藏優(yōu)勢腐敗菌的研究報道，集中在原料魚和不去皮魚片方面。對去皮魚片有氧冷藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌的研究尚未見報道。而魚類皮膚表面通常攜帶大量來自于水體環(huán)境的微生物，因此去皮魚片有氧冷藏下的優(yōu)勢腐敗菌可能與原料魚和不去皮魚片存在一定的差異為了進一步分析4 ℃有氧冷藏去皮草魚肉片中腐敗菌的種群特征，本研究將傳統(tǒng)的生理生化鑒定方法與16S rDNA分子鑒定方法相結(jié)合，對4 ℃有氧冷藏去皮草魚肉片貨架期終點的優(yōu)勢腐敗菌進行了分離及鑒定，并通過回接實驗，分析比較各腐敗菌的致腐能力。

另一方面，卷丹百合(LiliumlancifoliumThunb.)在長江流域廣為栽培，是一種藥食兩用的百合科百合屬類植物[10-11]。目前對卷丹百合的利用，主要是食用其球莖部分，而花葉、花蕾等均成為廢棄物。此外，李紅娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，卷丹百合丙酮提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌具有抑菌活性，但還未發(fā)現(xiàn)針對卷丹百合花葉、花蕾的體外抑菌活性方面的報道。為此，本實驗在分離純化、鑒定4 ℃有氧冷藏去皮草魚肉片的特定優(yōu)勢腐敗菌基礎(chǔ)上，研究了卷丹百合花葉、花蕾提物對優(yōu)勢腐敗菌的抑菌情況。

實驗結(jié)果進一步明確了4 ℃有氧冷藏過程中去皮草魚肉片的優(yōu)勢腐敗菌，可為靶向抑制草魚腐敗相關(guān)微生物，確定目標(biāo)。而研究卷丹百合廢棄組織提取物對腐敗菌的抑制作用，可以為有效利用卷丹百合資源、開發(fā)天然新型抑菌保鮮劑，延長4 ℃有氧冷藏下分割草魚生鮮去皮肉片的保鮮期，奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮活草魚，購于四川省雅安市鑫禧水產(chǎn)市場，每尾約(1.5±0.15)kg；卷丹百合花葉、花蕾洗凈后真空冷凍干燥，粉碎過篩，備用。

TaqDNA聚合酶、DNA Marker III、Taq buffer、dNTP、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒-離心柱型，天根生化科技北京有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鐵瓊脂培養(yǎng)基，上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司；CFC培養(yǎng)基、AMB培養(yǎng)基，青島海博生物科技有限公司；過氧化氫、鹽酸四甲基對苯二胺、氯化鈉，成都市科龍化工試劑廠；酵母浸粉，英國Oxoid；16S rDNA細(xì)菌通用引物，上海英駿生物技術(shù)有限公司。

其中，16S rDNA細(xì)菌通用引物序列如下：正向引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MyCyclerTM Thermal Cycler PCR儀、水平電泳槽及電泳電源、Dio-Gel-2000凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad；CX21FS1顯微鏡，日本Olympus；手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-98AB恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒儀器有限公司；真空冷凍干燥機，Labconco公司；中草藥打粉機，天津市泰斯特儀器有限公司

1.3 試驗方法

1.3.1 草魚去皮肉片生鮮制品的加工及有氧冷藏

用4 ℃清水將鮮活草魚洗凈，擊暈后去鱗、去頭、剖腹去內(nèi)臟等，4℃清水洗凈血污。沿脊骨剖片后將魚肉片去皮。去皮魚片切成60～70 g/塊，再進行挑刺、修補、整型。加工完成的魚肉塊，置于PP一次性冷鮮肉塑料托盤，然后用食品級保鮮膜封口包裝，置于4 ℃冷藏。

1.3.2 草魚去皮魚肉片貨架期終點優(yōu)勢腐敗菌的分離純化

待草魚去皮肉片到達貨架期終點，從腐敗魚肉片中分離純化優(yōu)勢腐敗菌。取樣參照GB/T 4789.20—2003：食品微生物學(xué)檢驗水產(chǎn)品檢驗方法[13]。

在無污染的環(huán)境中用高溫滅菌冷卻后的手術(shù)刀剪取腐敗草魚魚肉25 g，放入已滅菌的研缽內(nèi)用無菌剪刀剪碎，加入無菌玻璃砂后研磨，再放入盛有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，振蕩搖勻，梯度稀釋后，通過平板傾注法制成計數(shù)平板且每個梯度2個平行，用無菌生理鹽水做空白對照，每個實驗3個重復(fù)。在冰箱(4±1)℃條件下培養(yǎng)7 d。選取菌落總數(shù)在30～100 CFU(Colony-Forming Units)且無蔓延菌落生長的平板，計菌落總數(shù)。通過鏡檢及形態(tài)特征分離所選平板上的菌株，挑取其中數(shù)量比例較大的優(yōu)勢菌株，對優(yōu)勢菌株進行純化(3次平板劃線)。將目的菌株分別進行純化，將得到的純化菌株用40%甘油保存，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 腐敗菌的鑒定

(1)形態(tài)特征鑒定：革蘭氏染色后觀察記錄細(xì)菌形態(tài)，顏色質(zhì)地及有無芽孢等。

(2)理化特征鑒定：參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[14]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]對分離純化的細(xì)菌進行理化實驗。

(3)腐敗菌分子生物學(xué)鑒定：將分離純化的菌株活化2次，30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，參照說明書方法采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取模板DNA。以通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行擴增。

PCR擴增反應(yīng)體系包括：2 μL DNA模板，引物27F 0.5 μL，引物1492R 0.5 μL，TaqDNA Polymerase 0.4 μL，ddH2O 12.6 μL，Super Pure dNTP 4 μL，TaqBuffer(10×)5 μL。

PCR擴增程序為：95 ℃變性5 min，接著30個循環(huán)(94 ℃變性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸1.5 min)。最終72 ℃延伸10 min，取適量PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，而后將擴增產(chǎn)物進行測序，將PCR擴增產(chǎn)物送至上海立菲生物技術(shù)有限公司進行測序，將測得的16S rDNA序列在 NCBI數(shù)據(jù)庫中進行在線BLAST同源性匹配，以相似度最高的種作為內(nèi)群，而后選取同屬細(xì)菌作為外群。對比后用MEGA 6.06軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行Bootstrap 1000檢驗。

1.3.4 腐敗菌致腐能力的確定

1.3.4.1 TVB-N值的測定

用無菌水將分離純化的優(yōu)勢菌株分別制成菌懸液，菌體濃度105CFU/mL。根據(jù)HERBER等的方法[16]，制備無菌魚塊。按肉片與菌懸液1∶0.1(g∶mL)在魚塊表面回接菌懸液。在4 ℃冰箱貯藏，并進行揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定。揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定參照SC/T 3032—2007：水產(chǎn)品中揮發(fā)性氮值的測定[17]。

1.3.4.2 菌落總數(shù)的測定

氣單胞菌：采用AMB培養(yǎng)基30 ℃有氧培養(yǎng)48 h；假單胞菌：采用CFC培養(yǎng)基25 ℃有氧培養(yǎng)48 h；腐敗希瓦氏菌：采用鐵瓊脂培養(yǎng)基25 ℃有氧培養(yǎng)48 h。

參照GB/T 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》進行[18]。

1.3.4.3 感官評價

由6名經(jīng)過訓(xùn)練的專業(yè)人員組成感官評定小組，對去皮草魚肉片進行感官評分。以魚肉的色澤、氣味、指壓后魚肉彈性為主要評分指標(biāo)。采用3分法進行評分[19]，0為具有新鮮魚肉特有的氣味、色澤和彈性，品質(zhì)最佳，1為固有鮮味減弱，彈性降低，0-1為高品質(zhì)期，2為出現(xiàn)色澤暗淡、帶有明顯異味和臭味、無彈性，即為可接受的界限。當(dāng)半數(shù)或過半的評價人員評價2時，為該產(chǎn)品貨架期終點。

1.3.5 卷丹百合花葉、花蕾提取物的制備

水提取物的制備：稱取百合花葉、花蕾干粉各20 g，分別加入200 mL超純水，采用超聲波法(功率200 W)40 ℃提取4 h。離心取上清，用微濾除菌器過濾除菌，并分裝成2mL/瓶，隨后進行真空冷凍干燥。使用前用無菌水200 μL/瓶復(fù)溶。

醇提物的制備：稱取百合花葉、花蕾干粉各20 g，分別加入200 mL 60%乙醇，采用超聲波法(功率200 W)40 ℃提取1h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸成膏狀。根據(jù)干粉重/g：60%乙醇/mL為1∶1的比例，最終將膏狀物溶解于20 mL的60%乙醇中，用微濾除菌器過濾除菌，分裝成2 mL/瓶于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 抑菌活性的檢測

采用濾紙片法測定百合花葉、花蕾提取物對優(yōu)勢腐敗菌的抑菌活性。將篩選的3種優(yōu)勢腐敗菌置入無菌水中制成菌懸液，濃度為105CFU/mL。取0.1 mL菌懸液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上[11]，將濾紙片(直徑6 mm)放置于上述已涂布細(xì)菌的平板上，在濾紙片上分別滴加經(jīng)無菌處理的5、10、15、20 μL/片的卷丹百合花葉、花蕾提取物。于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢腐敗菌的分離和鑒定

通過鏡檢及菌落形態(tài)特征一致性，將從貨架期終點分離純化的106株菌分成3組。每組菌分別命名為JZ-C、JC-L、JZ-BB。每組的菌落特征見表1。并根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[14]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]相關(guān)方法對上述各組中每株菌進行生理生化鑒定，如表2初步確定為3個屬。

表1 JZ-C, JZ-L與JZ-BB的細(xì)菌菌落特征分析Table 1 Feature analysis of JZ-CB, JZ-L and JZ-BB

表2 優(yōu)勢腐敗菌的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results ofdominant spoilage bacteria

注：“+”表示反應(yīng)為陽性，“—”表示反應(yīng)為陰性。

2.2 腐敗菌的分子生物學(xué)鑒定

分離篩選出的3株優(yōu)勢腐敗菌經(jīng)引物27F，1492R16SrDNA細(xì)菌通用引物PCR擴增后，在瓊脂糖電泳膠上呈現(xiàn)與預(yù)期分子量大小相符的條帶(1 500 bp)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的建立構(gòu)建

根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，可見JZ-C與腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)聚集在同一分支，相似度在99%以上(圖3)；JZ-BB和草莓假單胞菌(Pseudomonasfragi)屬于同一類群(圖4)；JZ-L與中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)屬于相同類群(圖5)。因此進一步可結(jié)合形態(tài)學(xué)及理化實驗結(jié)果，確定分離純化得到的3類菌分別為腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)，草莓假單胞菌(Pseudomonasfragi)，中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)。

王發(fā)祥[9]等初步鑒定未去皮草魚分割肉塊4 ℃有氧冷藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌主要為鄉(xiāng)間不丘氏菌(Buttiauxellagaviniae)、草莓假單孢菌(Pseudomonasfragi)、熱殺索絲菌(Brochothrixthermosphacta)等。而本研究在貨架期終點的4 ℃有氧冷藏去皮草魚肉片中分離的優(yōu)勢腐敗菌也包括了草莓假單胞菌(Pseudomonasfragi)，該結(jié)果與上述研究一致，同時還鑒定出了腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)，這與候溫甫[20]等通過草魚肉片4 ℃貯藏期間微生物生長曲線的變化趨勢而初步推斷的優(yōu)勢腐敗菌結(jié)果相似。中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)與WANG等[21]人報道的氣單胞菌是4 ℃冷藏草魚肉片的主要腐敗菌結(jié)論相符。此外，本實驗的研究結(jié)果，4 ℃有氧冷藏草魚去皮肉片貨架期終點優(yōu)勢腐敗菌為腐敗希瓦氏菌、草莓假單胞菌、中間氣單胞菌與WANG等[21]人報道的4 ℃有氧冷藏草魚未去皮肉片貨架期終點的優(yōu)勢腐敗菌為假單胞菌和氣單胞菌存在差異，這可能是與去皮和不去皮有關(guān)。

圖3 菌株JZ-C系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of JZ-C

圖4 JZ-BB系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of JZ-BB

圖5 JZ-L系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of JZ-L

2.4 腐敗菌致腐能力的初步分析

根據(jù)圖6可知，4 ℃冷藏過程中3組回接優(yōu)勢菌的草魚去皮肉片，TVB-N值一直呈明顯的上升趨勢，在冷藏2 d內(nèi)3組的TVB-N值均小于15 mg/100g，魚片處于一級鮮度。在第5天時接有腐敗希瓦氏菌的魚肉片TVB-N值已經(jīng)達到27.19 mg/100g，說明接有該菌的魚肉開始出現(xiàn)進入腐敗；而接有草莓假單胞菌和中間氣單胞菌的組第6天時TVB-N值分別為25.12 mg/100g和25.07 mg/100g，開始出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象。由此可知，3種優(yōu)勢菌均不同程度加快了魚肉片的腐敗速度，且接有腐敗希瓦氏菌的組腐敗速度明顯快于其他兩組。

同時結(jié)合回接實驗的感官評分，3組接菌草魚去皮肉片，接有腐敗希瓦氏菌的去皮草魚魚肉片在第5天色澤暗淡，產(chǎn)生異味，彈性損失嚴(yán)重，5位評價人員評分為2，而接有草莓假單胞菌和中間氣單胞菌的組直到第6天，其去皮草魚魚肉片才產(chǎn)生異味，色澤暗淡，失去彈性，4人評分達到2。其評定結(jié)果與TVB-N值的變化結(jié)果一致。

由圖7可見，3組回接優(yōu)勢菌的草魚去皮肉片在冷藏0～7d內(nèi)菌落總數(shù)一直呈上升趨勢，但腐敗希瓦氏菌生長變化明顯比草莓假單胞菌和中間氣單胞菌快。

綜上，說明腐敗希瓦氏菌的致腐力最強，可以明確判斷腐敗希瓦氏菌為4 ℃有氧冷藏條件下去皮草魚魚肉片貨架期終點的最優(yōu)勢腐敗菌。張璟晶[22]等證實了在冰鮮鯧魚的腐敗變質(zhì)過程中，熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)的致腐能力是最強的。許振偉[23-24]等研究發(fā)現(xiàn)大黃魚在有氧低溫貯藏條件下腐敗希瓦氏菌的致腐能力最強，對冷藏鯉魚和羅非魚研究時發(fā)現(xiàn)，假單胞菌的致腐能力最強。本實驗表明草魚魚肉在4 ℃有氧條件下冷藏腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)的致腐能力最強，結(jié)果上的差異可能與魚種、養(yǎng)殖環(huán)境及魚片加工操作的環(huán)境等有一定關(guān)系。

圖6 回接各種腐敗菌對TVB-N值的影響Fig.6 Effect of putrefying bacteric on TVB-N value

圖7 回接各腐敗菌魚肉片菌數(shù)的變化Fig.7 The changes of bacteria in fish fillets after putrefying bactericinoculated back

2.5 抑菌活性的測定

A：空白對照(無菌水)20 μL B：花葉水提物20 μL圖8 卷丹百合花葉水提液對腐敗希瓦氏的抑菌效果Fig.8 Inhibitory effect from Lily extracts to Shewanella putrefaciens

A:空白對照(60%乙醇)20 μL；B:花蕾提取液5 μL；C:花蕾提取液10 μL；D:花蕾提取液15 μL；E:花蕾提取液20μL圖9 卷丹百合花蕾醇提液對草莓假單孢的抑菌效果Fig.9 Inhibitory effect from Lily extracts to Pseudomonas fragi

A-空白對照(60%乙醇)10 μL；B-花蕾提取液5 μL；C-花蕾提取液10 μL；D-花蕾提取液15 μL；E-花蕾提取液20 μL圖10 卷丹百合花蕾醇提液對中間氣單孢的抑菌效果Fig.10 Inhibitory effect from Lily extracts to Aeromonas media

抑菌實驗發(fā)現(xiàn)，百合花葉水提物對腐敗希瓦氏菌有明顯的抑菌效果，當(dāng)加量為20 μL，其抑菌圈直徑為32 mm(如圖8)。而百合花蕾60%乙醇提取物對草莓假單胞菌和中間氣單胞菌體現(xiàn)了明顯抑菌效果，當(dāng)加量為20 μL時，其抑菌圈直徑分別為10 mm(如圖9)和26 mm(如圖10)。勒磊等[25]證實了野百合鱗莖的甲醇提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌有一定的抑制作用。周英等[11]研究發(fā)現(xiàn)卷丹百合的水、乙醇、乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌、黃霉菌以及糞腸球菌都具有一定程度的抑制效果。牛立新等[26]研究表明百合鱗莖甲醇提物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌均具有明顯的抑菌活性。本研究發(fā)現(xiàn)卷丹百合花葉的水提物對腐敗希瓦氏菌具有抑菌活性，卷丹百合花蕾60%乙醇提取物對草莓假單胞菌和中間氣單胞菌具有抑菌活性。

3 結(jié)論

對4 ℃有氧冷藏草魚去皮肉片貨架期終點的腐敗微生物進行了分離鑒定，并且研究了卷丹百合花葉、花蕾提取物對貨架期終點的優(yōu)勢腐敗菌的抑制作用。確定了去皮草魚肉片中主要的腐敗菌有3種，分別為腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)、草莓假單胞菌(Pseudomonasfragi)和中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)且腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)的致腐能力最強。該結(jié)果可為靶向抑制草魚腐敗菌，確定目標(biāo)。抑菌研究證實了卷丹百合花葉、花蕾提取物對上述3種優(yōu)勢腐敗菌有明顯的抑制作用，該結(jié)果可以為有效利用卷丹百合資源、開發(fā)天然新型抑菌保鮮劑，延長有氧4 ℃冷藏下分割草魚生鮮去皮肉片的保鮮期，提供參考。

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