發(fā)酵工藝初步優(yōu)化提高釀酒酵母工程菌株環(huán)磷酸腺苷產(chǎn)量

仇申珅，丁娟娟，曲淑玲，張軼群，陸海燕，鄒少蘭*

1(天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津，300350)2(系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300350) 3(中國(guó)石油大港油田團(tuán)泊洼開(kāi)發(fā)公司，天津，301607)

環(huán)式3’,5’-單磷酸腺嘌呤核苷(3’,5’-cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，簡(jiǎn)稱(chēng)環(huán)磷酸腺苷，是普遍存在于生物機(jī)體內(nèi)并在生物機(jī)體的功能調(diào)節(jié)中起著重要作用的生理活性物質(zhì)，被稱(chēng)為第二信使[1]?；赾AMP的特殊作用和地位，cAMP一方面被作為重要的心血管系統(tǒng)藥物長(zhǎng)期用于臨床治療[2-3]，一方面被證明在動(dòng)物生產(chǎn)領(lǐng)域也有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值[4]。

目前已知臨床用cAMP均來(lái)自化學(xué)法合成法[5]。此法原料受限，存在較為嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題。相比之下，發(fā)酵法具有可實(shí)現(xiàn)持續(xù)生產(chǎn)、工藝簡(jiǎn)單、能利用廉價(jià)的碳源、毒副作用小等多種優(yōu)勢(shì)。而釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)不僅具有工業(yè)化應(yīng)用技術(shù)成熟、抗逆性強(qiáng)、為食品安全性GRAS微生物的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)作為最早實(shí)現(xiàn)全基因組測(cè)序的微生物菌種，又是分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的最重要模式生物之一[6]。因此，通過(guò)遺傳工程手段的改造實(shí)現(xiàn)以釀酒酵母為菌種的cAMP發(fā)酵法生產(chǎn)，預(yù)測(cè)會(huì)具有特殊的優(yōu)勢(shì)。

釀酒酵母胞內(nèi)嘌呤核苷酸的合成途徑有從頭合成途徑(de novo synthesis)和補(bǔ)救途徑(salvage pathway)，見(jiàn)圖1。在從頭合成途徑中，以PRPP為前體物經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)生成IMP進(jìn)而生成AMP和GMP；同時(shí)，在補(bǔ)救途徑中，培養(yǎng)基中的次黃嘌呤(hypoxanthine)、腺嘌呤(adenine)或鳥(niǎo)嘌呤(guanine)被細(xì)胞運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)，分別直接參與合成IMP、AMP或GMP。研究證明酵母嘌呤核苷酸代謝的調(diào)控機(jī)制極為復(fù)雜[1,7-8]，上述前體物的胞外供應(yīng)情況也直接影響胞內(nèi)2個(gè)途徑之間的協(xié)同、平衡。而cAMP通過(guò)cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮第二信使作用，其在細(xì)胞內(nèi)的含量水平(涉及合成與降解過(guò)程)更受到極為嚴(yán)謹(jǐn)、精細(xì)、協(xié)同、及時(shí)的調(diào)控[9]。激發(fā)酵母中cAMP合成的一大刺激源是胞外葡萄糖和蔗糖含量水平[9]；另一方面如圖1所示，嘌呤核苷酸合成所需的起始原料5’-磷酸核糖(5-P-Ribose)經(jīng)EMP和HMP途徑生成，嘌呤核苷酸合成所需的還原力和大量能量(ATP)主要由TCA提供(圖1)[10]，因此，EMP、HMP和TCA循環(huán)代謝流水平也必然影響到胞內(nèi)cAMP合成水平。

作為最重要的模式生物之一，釀酒酵母cAMP相關(guān)基礎(chǔ)研究—以cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為核心的、被cAMP調(diào)控和調(diào)控cAMP的途徑及其機(jī)制研究非常多，發(fā)表論文數(shù)以千計(jì)，但將其用于發(fā)酵生產(chǎn)cAMP則未見(jiàn)報(bào)道[1,7-9]。本課題組成員進(jìn)行了大量有關(guān)釀酒酵母cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，構(gòu)建得到一系列不同基因修飾、不同遺傳背景的菌株，并首先關(guān)注到釀酒酵母可以大量積累胞外cAMP，進(jìn)而比較系統(tǒng)地研究胞外cAMP濃度的影響因素和變化規(guī)律[8,11-12]。已有代謝工程研究證明：細(xì)胞途徑的修飾(合成)→修飾后細(xì)胞表型的嚴(yán)格評(píng)價(jià)(表型表征)→根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果設(shè)計(jì)進(jìn)一步的修飾(優(yōu)化設(shè)計(jì))，是一個(gè)不斷循環(huán)和遞進(jìn)的菌種改進(jìn)與生物過(guò)程整體優(yōu)化的過(guò)程[13]。本研究擬基于圖1所示代謝途徑網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)代謝調(diào)控機(jī)制的分析，初步評(píng)價(jià)釀酒酵母工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)胞外cAMP的能力及其關(guān)鍵影響因素，嘗試考察通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件而調(diào)控代謝流、進(jìn)一步提高cAMP產(chǎn)量的潛力，為下一步的菌株改造、發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化和最終充分發(fā)揮釀酒酵母平臺(tái)cAMP生產(chǎn)潛力打下基礎(chǔ)。

圖1 釀酒酵母嘌呤代謝及cAMP合成途徑Fig.1 Purine metabolism and cAMP synthesis pathway in Saccharomyces cerevisiae

1 材料與方法

1.1 材料

G2為本室前期工作中構(gòu)建的、已證明有一定胞外cAMP生產(chǎn)能力的釀酒酵母基因修飾工程菌株[11]。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物10，蛋白胨20，D-葡萄糖20，固體培養(yǎng)基則還需添加瓊脂粉15。酵母菌株活化和種子液培養(yǎng)：固體培養(yǎng)為30 ℃培養(yǎng)箱倒置2～3 d至菌落生長(zhǎng)至合適大?。灰后w培養(yǎng)為30 ℃、190 r/min過(guò)夜。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：一般情況下為酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20～100，自然pH值。需要時(shí)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加其他組分如前體物次黃嘌呤、腺嘌呤。發(fā)酵條件：一般情況下為30 ℃、190 r/min、72～168 h。

1.3 發(fā)酵評(píng)價(jià)

種子液培養(yǎng)：挑取固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落，接入裝有5 mL YPD培養(yǎng)液的試管中，30 ℃下190 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)，所得菌液用作種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：上述新鮮種子液接種到裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，控制初始OD600值在0.3左右，30 ℃、190 r/min下發(fā)酵，間隔12或24 h取樣進(jìn)行分析。

發(fā)酵液的分析：1.OD600測(cè)定：將發(fā)酵樣品適當(dāng)稀釋后測(cè)定OD600，檢測(cè)生長(zhǎng)情況；2.HPLC分析胞外cAMP和腺嘌呤濃度：將發(fā)酵樣品在13 000 r/min、2 min條件下離心，取上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)每讖?.22 μm的濾膜過(guò)濾，濾液用于色譜檢測(cè)：美國(guó)Waters公司W(wǎng)aters Alliance2695高效液相色譜儀，檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm，Thermo Syncronis C18色譜柱，流動(dòng)相組分為：(5.78 g/L KH2PO4，2.72 g/L四丁基溴化銨，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.3)∶乙腈=85∶15，流速1 mL/min，柱溫35℃；3.HPLC分析葡萄糖和乙醇質(zhì)量濃度：發(fā)酵樣品的處理同前，色譜檢測(cè)條件為：安捷倫公司示差檢測(cè)器，Bio-Rad公司Aminex HPX-87H柱，流動(dòng)相為4 mmol/L H2SO4，流速為0.4 mL/min，柱溫40 ℃。

2 結(jié)果與分析

如前言所述，包括cAMP在內(nèi)的嘌呤核苷酸合成要消耗大量能量，因此足量的供氧和溶氧是必需的；cAMP的特殊地位決定了它的活躍合成和分泌必需有足量的、高活性的細(xì)胞生成，而大量前期工作也證明了較高水平的胞外cAMP生產(chǎn)是以一定的生物量積累為前提，菌體生長(zhǎng)不佳時(shí)，胞外cAMP水平必然低；對(duì)比分析cAMP的分子式C10H12N5O6P和釀酒酵母菌體有機(jī)成分含量(碳46%～52%，氮6.0%～8.5%)，要同時(shí)滿(mǎn)足生物量合成和cAMP合成的需要，培養(yǎng)基碳氮比的控制是必要和關(guān)鍵的；葡萄糖是經(jīng)cAMP-PKA途徑刺激cAMP合成的刺激源，葡萄糖濃度效應(yīng)也有待觀察。

因此，本研究以釀酒酵母常用的培養(yǎng)基YPD(酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，D-葡萄糖20 g/L)和好氧培養(yǎng)條件30 ℃、190 r/min為基礎(chǔ)，首先考察葡萄糖濃度對(duì)工程菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)生胞外cAMP的影響。

2.1 葡萄糖對(duì)G2菌株生長(zhǎng)和生產(chǎn)胞外cAMP的影響

結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：100、50 g/L葡萄糖下的生長(zhǎng)彼此沒(méi)有明顯差異，最大OD600值分別為48.25(96 h)和49.60(96 h)，而20 g/L葡萄糖下最大OD600值為33.35(48 h)；與生長(zhǎng)相應(yīng)，20 g/L葡萄糖下48 h達(dá)到cAMP濃度最大值(935.3 μmol/L)，100、50 g/L葡萄糖下cAMP生產(chǎn)都在48～72 h時(shí)表現(xiàn)出停頓，至96 h繼續(xù)上升(濃度分別為1 942.0、1 526.8 μmol/L)；50、20 g/L葡萄糖搖瓶發(fā)酵都在24 h基本耗盡葡萄糖的同時(shí)，乙醇濃度達(dá)到最大(1.817、0.568 g/L)，而100 g/L葡萄糖發(fā)酵則在96 h時(shí)仍有1.498 g/L的殘?zhí)?，乙醇質(zhì)量濃度在48 h達(dá)最大值1.808 g/L，后下降。

圖2 不同葡萄糖濃度下的生長(zhǎng)(A)、CAMP濃度(B)、葡萄糖濃度(C)和乙醇濃度(D)曲線Fig.2 The growth(A), cAMP(B), glucose(C) and ethanol(D) curves at different glucose concentrations

這些結(jié)果初步暗示了細(xì)胞生長(zhǎng)與cAMP生產(chǎn)既相互關(guān)聯(lián)又相對(duì)獨(dú)立的復(fù)雜關(guān)系；大量副產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)生也必然消耗碳源、降低底物轉(zhuǎn)化率。

需要說(shuō)明的是：在上述條件下，作為對(duì)照設(shè)置的實(shí)驗(yàn)室菌株W303-1A發(fā)酵液的胞外cAMP有時(shí)檢測(cè)不到，有時(shí)低至1～3 μmol/L。

2.2 接種方式對(duì)G2菌株生產(chǎn)胞外cAMP的影響

由2.1結(jié)果可知：YPD培養(yǎng)基、30 ℃、190 r/min下的種子液培養(yǎng)亦會(huì)產(chǎn)生較高水平的胞外cAMP。為考察發(fā)酵體系起始cAMP水平對(duì)發(fā)酵的影響，兼顧觀察種子液殘余培養(yǎng)基成分的影響，設(shè)置了2種方式接種：種子液直接接種和種子液先離心收集細(xì)胞再用無(wú)菌水重懸接種。結(jié)果見(jiàn)表1，發(fā)酵葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L，其余發(fā)酵條件同前。結(jié)果顯示二者沒(méi)有明顯差異。

2.3 次黃嘌呤對(duì)G2菌株生產(chǎn)cAMP的影響

根據(jù)圖1所示代謝途徑，考察了添加前體物次黃嘌呤的效果。次黃嘌呤溶解度低，設(shè)計(jì)的最大添加量2 g/L。結(jié)果見(jiàn)表2。發(fā)酵葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L，其余發(fā)酵條件同前。

表1 接種方式對(duì)菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響Table 1 Effect of inoculation method on strain growthand fermentation

表2結(jié)果表明次黃嘌呤對(duì)菌株生長(zhǎng)基本沒(méi)有影響的同時(shí)，僅能有限地提高cAMP產(chǎn)量。

2.4 腺嘌呤和酵母粉/蛋白胨含量對(duì)G2菌株生產(chǎn)cAMP的影響

與次黃嘌呤不同，預(yù)實(shí)驗(yàn)證明腺嘌呤有明顯的提高cAMP產(chǎn)量的效果；但濃度過(guò)高的情況下，會(huì)明顯抑制生長(zhǎng)從而最終影響到cAMP產(chǎn)量，同時(shí)發(fā)酵結(jié)束時(shí)會(huì)有大量腺嘌呤剩余、不能被利用，增加了發(fā)酵成本。另一方面，對(duì)比圖2中100和50 g/L葡萄糖下的生長(zhǎng)和發(fā)酵情況，分析酵母粉、蛋白胨相對(duì)于葡萄糖含量偏低構(gòu)成了100 g/L葡萄糖下生長(zhǎng)與發(fā)酵的制約。因此，這里同時(shí)考察添加腺嘌呤和提高酵母粉、蛋白胨含量的效果：1.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定腺嘌呤的添加量為0.625 g/L(在圖3中標(biāo)注為A 0.625)；2.將前面實(shí)驗(yàn)采用的10 g/L酵母粉、20 g/L蛋白胨含量簡(jiǎn)稱(chēng)為1*YP，將含量翻倍后的20 g/L酵母粉、40 g/L蛋白胨含量簡(jiǎn)稱(chēng)為2*YP。結(jié)果見(jiàn)圖3和表3。

表2 次黃嘌呤對(duì)菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響Table 2 The effects of hypoxanthine on the growth and fermentation

圖3 腺嘌呤和1*YP或2*YP中的生長(zhǎng)(A)和發(fā)酵(B)曲線Fig.3 The growth(A) and fermentation(B) curves in the media with adenine and 1*YP or 2*YP

次黃嘌呤終質(zhì)量濃度/(g·L-1)1 (1?YP,A0)2 (1?YP,A0.625)3 (2?YP,A0)4 (2?YP,A0.625)最大OD600值50.23±2.7446.10±1.8456.60±3.1154.80±4.3396 h cAMP濃度/(μmol·L-1)1 972.0±122.52 712.7±214.32 374.4±121.13 422.2±102.7最大cAMP濃度/(μmol·L-1)1 972.0±122.53 387.3±277.84 311.2±308.34 678.1±238.6相對(duì)于樣品1最大濃度的比值11.7182.1862.372相對(duì)于樣品3最大濃度的比值11.085

由圖3和表3可知：維持100 g/L葡萄糖質(zhì)量濃度不變的情況下，將酵母粉、蛋白胨含量加倍能將cAMP濃度提高到4 311.2 μmol/L，為對(duì)照的2.186倍；在此基礎(chǔ)上添加腺嘌呤能繼續(xù)提高產(chǎn)量8.5%，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1*YP培養(yǎng)基中添加腺嘌呤的增產(chǎn)效果(71.8%)；添加0.625 g/L腺嘌呤仍然表現(xiàn)出了輕微的生長(zhǎng)抑制；生長(zhǎng)和cAMP產(chǎn)量之間仍然表現(xiàn)出既相互關(guān)聯(lián)又相對(duì)獨(dú)立的復(fù)雜關(guān)系。

3 討論

如前言所述，cAMP在胞內(nèi)的含量受到極為嚴(yán)格的控制。在基因修飾調(diào)控相關(guān)代謝及其調(diào)節(jié)機(jī)制的情況下，提供菌株良好的環(huán)境條件、考察和優(yōu)化生長(zhǎng)和發(fā)酵工藝參數(shù)，是進(jìn)一步提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量、充分發(fā)揮其生產(chǎn)潛能的必需和重要的一環(huán)，也是下一輪菌種改造和發(fā)酵優(yōu)化的基礎(chǔ)。本研究基于文獻(xiàn)報(bào)道(圖1)代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制研究，以及實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)，將工作重點(diǎn)放在培養(yǎng)基組分上，選擇碳源葡萄糖、氮源酵母粉/蛋白胨和前體物次黃嘌呤/腺嘌呤進(jìn)行生長(zhǎng)和發(fā)酵觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面證實(shí)了優(yōu)化碳氮比的顯著效果，一方面暗示了細(xì)胞生長(zhǎng)與cAMP發(fā)酵之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系；前體物腺嘌呤添加到1*YP和2*YP培養(yǎng)基中增產(chǎn)效應(yīng)上的顯著差異，推測(cè)是嘌呤合成2種途徑——從頭合成途徑和補(bǔ)救途徑之間平衡因碳氮比和碳氮比所至菌體生長(zhǎng)差異而變化的反映。

因此，下一步的工作有必要通過(guò)正交設(shè)計(jì)深入考察葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和腺嘌呤之間在糖耗-生長(zhǎng)-cAMP發(fā)酵-乙醇產(chǎn)生關(guān)系上更為精細(xì)、全面的相互作用，在此基礎(chǔ)上增加溶氧和代謝流分析，以更深入了解發(fā)酵過(guò)程調(diào)控和優(yōu)化最核心的問(wèn)題之一——實(shí)施生長(zhǎng)與cAMP發(fā)酵分階段控制的必要性、可能臨界點(diǎn)和敏感參數(shù)。

另一方面，本工作雖然是發(fā)酵工藝部分參數(shù)的初步優(yōu)化考察，但結(jié)果已經(jīng)清楚顯示出了酵母與其他微生物(尤其是細(xì)菌)在cAMP代謝及其調(diào)控、生產(chǎn)優(yōu)化措施上的顯著差別[1,9,14-16]。添加次黃嘌呤前體物可將節(jié)桿菌cAMP產(chǎn)量從0.43 g/L提高到4.08 g/L，效應(yīng)極為顯著[15]；其他對(duì)節(jié)桿菌增產(chǎn)有效的措施(包括添加腺嘌呤前體物)[15]，在本研究中則觀察到效果有較大的出入(部分結(jié)果沒(méi)有顯示)。事實(shí)上，對(duì)cAMP信號(hào)通路及其調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)、研究的程度制約著對(duì)它的利用水平。作為最重要的模式生物之一，釀酒酵母cAMP相關(guān)研究一直未曾間斷過(guò)[7,9,17-19]；而細(xì)菌到目前為止還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)有類(lèi)似酵母cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中依賴(lài)于cAMP的蛋白質(zhì)激酶PKA[1,16]。本研究首次報(bào)道了釀酒酵母生產(chǎn)cAMP發(fā)酵工藝的初步優(yōu)化，結(jié)果一方面如前提供了進(jìn)行下一步工作的線索，另一方面則進(jìn)一步提示了在迄今為止對(duì)生物cAMP代謝途徑網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)代謝調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上不斷循環(huán)和遞進(jìn)的菌種改進(jìn)與生物過(guò)程整體優(yōu)化的必要性和艱巨性。唯有不斷循環(huán)和遞進(jìn)改造菌種和優(yōu)化過(guò)程，才能最終充分發(fā)揮釀酒酵母平臺(tái)cAMP生產(chǎn)潛力，開(kāi)辟微生物發(fā)酵生產(chǎn)cAMP新途徑，真正推動(dòng)高值醫(yī)藥產(chǎn)品的綠色清潔生產(chǎn)。

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