降膽固醇乳酸菌的篩選鑒定及其耐酸耐膽鹽性能研究

陳儀婷，張紅星，謝遠(yuǎn)紅，金君華，劉順

(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京，102206)

高膽固醇水平是導(dǎo)致心血管疾病的重要因素，據(jù)世衛(wèi)組織預(yù)測，到2030年，心血管疾病仍將是導(dǎo)致死亡的主要原因，世界各地約有2 360萬人受到影響[1]，與正常血脂含量的群體相比，高膽固醇血癥患者的心臟病發(fā)作風(fēng)險高出3倍。雖然通過飲食管理、定期運動和藥物治療可以有效降低機體膽固醇含量[2]，但是這些藥物價格昂貴并且伴有嚴(yán)重的副作用[3]。早在2001年，世界衛(wèi)生組織就提出，益生菌可以有效治療高膽固醇血脂癥[4]。 WILLIAMS等發(fā)現(xiàn)益生菌在腸道內(nèi)定殖達(dá)一定數(shù)量時即可發(fā)揮降膽固醇作用[5-6]。LIONG和JONES利用體內(nèi)和體外實驗證明了益生菌可降低機體中膽固醇和血脂中膽固醇含量[7-11]。而益生菌制品要想在人體內(nèi)發(fā)揮降膽固醇功效，活菌數(shù)至少維持在106CFU/mL以上。所以益生菌必須克服人體的生理屏障，包括胃酸、小腸中的膽鹽以及胃腸道內(nèi)各種消化酶。本實驗在體外篩選具有降膽固醇功效，且能耐受人體胃腸道系統(tǒng)的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

12株乳酸菌分離自天然發(fā)酵食品，由本實驗室保存。

1.1.2 儀器與材料

高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；冷凍離心機，北京博宇寶威實驗設(shè)備公司。

無水乙醇，國藥集團；膽固醇，美國Sigma公司；色譜乙腈，韓國Duksam公司；牛膽鹽，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；人工胃液、人工小腸液，北京欣華綠源科技有限公司；MRS肉湯，北京路橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化

將-80 ℃甘油保藏的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，連續(xù)活化2代。

1.2.2 降膽固醇乳酸菌篩選

CHOL-MRS培養(yǎng)基的配置：加熱MRS培養(yǎng)基至50 ℃，取10 g/L的膽固醇乙醇溶液1 mL過0.22 μm濾膜趁熱加入100 mL MRS液體培養(yǎng)基，邊加邊搖晃。使其最終質(zhì)量濃度為0.1 g/L。

將活化的乳酸菌以10%體積比分別接種于CHOL-MRS培養(yǎng)基，以不接種乳酸菌的CHOL-MRS培養(yǎng)基作為對照，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用高效液相色譜法檢測CHOL-MRS培養(yǎng)基中膽固醇的殘留量，每組3次平行[12]。

1.2.3 膽固醇降解率測定

根據(jù)HANSBURY和SCALLEN[13]的方法改良。將乳酸菌發(fā)酵液于4 ℃，7 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液過0.22 μm濾膜，上樣分析。

液相條件：色譜柱：TC-C18柱(5 μm ，4.6 mm×250 mm, Agilent)；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈；流速：1.5 mL/min；波長：210 nm；進樣量：5 μL。

建立膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線：取膽固醇母液分別稀釋到質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/L，各取1 mL過0.22 μm濾膜，上樣分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可定量檢測樣品中膽固醇含量，見公式(1)。

(1)

1.2.4 乳酸菌16S rDNA鑒定

1.2.4.1 乳酸菌基因組DNA提取

將乳酸菌YXB23和YDA12接種于MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h后,8 000 r/min離心1 min收集菌體,采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒方法提取乳酸菌基因組DNA。提取的基因組DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4.2 乳酸菌16S rDNA序列擴增

以提取得到的乳酸菌基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA序列通用擴增引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行乳酸菌16S rDNA序列的PCR擴增,擴增條件:95 ℃, 5 min；95 ℃, 30 s，55 ℃, 30 s，72 ℃, 90 S，34個循環(huán)；72 ℃, 5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析并送生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定。

1.2.5 耐酸性試驗

植物乳桿菌YXB23和乳酸片球菌YDA12以107CFU/mL活菌數(shù)分別接入pH 2.5、pH 3.0和pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)8 h，每2 h取樣測定其活菌數(shù)，每組3次平行。

1.2.6 耐膽鹽試驗

植物乳桿菌YXB23和乳酸片球菌YDA12以107CFU/mL活菌數(shù)分別接入膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8 h，每2 h取樣測定其活菌數(shù)，每組3次平行[14]。

1.2.7 模擬胃腸道試驗

植物乳桿菌YXB23和乳酸片球菌YDA12以107CFU/mL活菌數(shù)接入pH 3.0，以胃蛋白酶和胃酸為主要成分的人工胃液中，37 ℃培養(yǎng)3 h，每1 h取樣測定其活菌數(shù)。3 h后充分混勻，以2%體積比將其轉(zhuǎn)接入pH 8.0，以胰蛋白酶為主要成分的人工小腸液中，37 ℃培養(yǎng)8 h，每2 h取樣測定其活菌數(shù)，每組3次平行[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 降膽固醇乳酸菌的篩選

2.1.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用液相色譜法測定膽固醇含量，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為：Y=1.055 6X+1.821 1，R2為0.999，線性關(guān)系良好，可用于降膽固醇能力的測定。

2.1.2 降膽固醇乳酸菌的篩選

經(jīng)過高效液相色譜法檢測，12株乳酸菌的膽固醇降解率分別如圖1所示。其膽固醇降解率在12.67%～35.33%之間，其中乳酸菌YXB23與YDA12的降解率最高，分別為(35.33±4.51)%和(33.53±2.92)%，SD21的膽固醇降解率最低，為(12.67±3.21)%。選出菌株YXB23與YDA12進行進一步的菌株鑒定。

圖1 12株乳酸菌膽固醇降解率Fig.1 Screening of 12 lactic acid bacteria for cholesterol absorption

2.2 乳酸菌16S rDNA鑒定及同源性分析

將乳酸菌YXB23和YDA12的16S rDNA測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast分析，并繪制進化樹。結(jié)果如圖2，乳酸菌YXB23與5株植物乳桿菌Lactobacillusplantarumstrain b2、Lactobacillusplantarumstrain BCH-2、Lactobacillusplantarumstrain BM4、Lactobacillusplantarumstrain KCC-1、Lactobacillusplantarumstrain L544具有最高的同源性均為99%。因此，乳酸菌YXB23命名為植物乳桿菌YXB23。乳酸菌YDA12與乳酸片球菌PediococcusacidilacticiG1、PediococcusacidilacticiJCM15055、PediococcusacidilacticiGL16、PediococcusacidilacticiN8和PediococcusacidilacticiNBRC3885具有最高的同源性均為99%，因此，乳酸菌YDA12命名為乳酸片球菌YDA12。

圖2 YXB23與YDA12分別與其他同源性序列的菌種系統(tǒng)進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of YXB23 and YDA12 with other strains which have homology sequence

2.3 耐酸性試驗

植物乳桿菌YXB23和乳酸片球菌YDA12的耐酸性試驗結(jié)果如圖3和圖4。

圖3 YXB23不同pH培養(yǎng)基中的生長情況Fig.3 Crowth status of YXB23 in culture medium with different pH values

圖4 YDA12在不同pH培養(yǎng)基中的生長情況Fig.4 Crowth status of YDA12 in culture medium with different pH values

經(jīng)過8 h的培養(yǎng)，植物乳桿菌YXB23和乳酸片球菌YDA12都呈現(xiàn)了較強的耐酸性，在pH 3.0的條件下YXB23存活率為(102.89±0.26)%，YDA12為(102.32±0.20)%。當(dāng)pH下降到2.5時，YXB23的存活率為(99.42±0.30)%，YDA12的存活率為(97.42±0.62)%。通常人體進食后胃部pH維持在3.0～5.0之間[15]，因此2株功能菌均能進入人體的腸道，對其降膽固醇活性沒有影響。

2.4 耐膽鹽試驗

從圖5、圖6中可以看出，植物乳桿菌YXB23和乳酸片球菌YDA12在膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時均表現(xiàn)出良好的耐受性；在膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時，植物乳桿菌YXB23在2 h后活菌數(shù)略有降低，存活率為(81.85±1.26)%，在2～8 h期間基本保持穩(wěn)定， 8 h后存活率為(77.51±0.46)%；乳酸片球菌YDA12活菌數(shù)則無明顯變化，8 h后存活率為(98.86±0.13)%。但是在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時，植物乳桿菌YXB12在2 h后活菌數(shù)降為0，證明植物乳桿菌YXB23無法耐受0.3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膽鹽，而乳酸片球菌YDA12在膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時培養(yǎng)8 h后存活率高達(dá)(95.36±1.11)%，證明其有良好的膽鹽耐受性。人體腸道內(nèi)膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%～0.3%內(nèi)波動[15]，因此功能菌進入胃腸道后需要有一定的膽鹽耐受性才可有效發(fā)揮降膽固醇功效，相比之下，乳酸片球菌YDA12更具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖5 YXB23在不同濃度膽鹽培養(yǎng)基中的生長情況Fig.5 Growth status of YXB23 in culture medium with different bile salt

圖6 YDA12在不同濃度膽鹽培養(yǎng)基中的生長情況Fig.6 Growth stants of YDA12 in culture medium with different bilt salt

2.5 模擬胃腸道試驗

一般情況下，食物在胃部的停留時間為2～4 h，因此，選用pH 3.0的人工胃液。將功能菌消化3 h后的活菌數(shù)來作為耐受胃液的依據(jù)，結(jié)果如圖7。經(jīng)過人工胃液消化1 h后2株功能菌活菌數(shù)略有降低，1～3 h期間活菌數(shù)無明顯變化，消化3 h后植物乳桿菌YXB23的存活率為(85.46±1.76)%，乳酸片球菌YDA12的存活率為(85.41±1.47)%，由此可見，2株功能菌對人工胃液的耐受性較強。

圖7 功能菌在人工胃液中的耐受性評價(pH 3.0)Fig.7 Tolerance of probiotics in artifical gastric juice

在小腸中，除了膽汁酸對乳酸菌的生長有抑制作用之外，還有各種消化酶對其有影響。將消化3 h后的菌液轉(zhuǎn)接至pH8.0的人工小腸液中，再消化8 h，每2 h取樣計算活菌數(shù)，結(jié)果如圖8。人工小腸液消化2 h后活菌數(shù)略有降低，2～8 h期間2株乳酸菌活菌數(shù)無明顯變化。8 h后植物乳桿菌YXB23的存活率為90.47%±2.94%，乳酸片球菌YDA12的存活率為88.95%±2.29%，證明2株乳酸菌對人工小腸液的耐受性較強。

圖8 功能菌在人工小腸液中的耐受性評價(pH 8.0)Fig.8 Tolerance of probiotics in artifical intestinal juice

3 討論

本次研究從12株乳酸菌中篩選出了2株降膽固醇能力較強的菌株，分別為植物乳桿菌YXB23和乳酸片球菌YDA12,降解率分別為(35.33±4.51)%和(33.53±2.91)%,汪曉輝[15]從泡菜中分離篩選出的2株乳酸菌膽固醇降解率為49.11%和50.03%，而章秀梅[16]篩選出的乳酸菌膽固醇降解率在35.99%～46.37%。表明2株乳酸菌均具有較良好的體外降解膽固醇的功效。

乳酸菌要在人體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的益生功效，必須要有一定的耐酸性和耐膽鹽性。經(jīng)過耐性試驗證明，植物乳桿菌YXB23與乳酸片球菌YDA12在pH 3.0下生長良好，在pH 2.5環(huán)境下脅迫8 h后植物乳桿菌YXB23的存活率仍高達(dá)(99.42±0.30)%，乳酸片球菌YDA12的存活率為(97.42±0.62)%。郭心悅[17]從金針菇中篩選出的具有降膽固醇效果的益生菌4J17在pH 3.0下存活率僅為20.00%。

乳酸菌要到達(dá)并定植于人體腸道必須對膽鹽有一定耐受性，其耐受力的高低意味著該菌株在腸道中的存活能力的高低，人體小腸中膽汁鹽含量在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動。在膽鹽耐受性實驗中，植物乳桿菌YXB23在膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時生長良好，在膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時脅迫2 h，全部失活。而乳酸片球菌YDA12在膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時培養(yǎng)8 h后存活率高達(dá)(95.36±1.11)%，證明其有良好的膽鹽耐受性。

在人體胃腸道中，除了胃酸和膽鹽之外，還有許多消化酶的存在，也會影響益生菌在活性，通過模擬胃腸道試驗發(fā)現(xiàn)，人工胃液消化3 h后，植物乳桿菌YXB23和乳酸片球菌YDA12的存活率分別為(85.46±1.76)%和(85.41±1.47)%，按2%體積比將消化液轉(zhuǎn)接入人工小腸液消化8 h后，植物乳桿菌YXB23與乳酸片球菌DA12的存活率分別為(90.47±2.94)%和(88.95±2.29)%。張麗[18]從傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵奶中篩選出來的乳桿菌G12在人工胃腸液中的存活率僅52.47%，胃腸道耐受性較差，而石超[19]從傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶中篩選出的乳酸菌在3 h人工胃液培養(yǎng)后存活率均在90%以上，最高可達(dá)98.93%，在人工腸液中培養(yǎng)8 h后存活率達(dá)80%以上。

綜合比較2株乳酸菌，篩選出乳酸片球菌YDA12為具有良好胃腸道耐性的潛在降膽固醇乳酸菌。

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