擬南芥生物鐘突變體gi延遲營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變

郭 蕊，傅 鈺，馬婉琪，王 苓，白 惠，龍 鴻

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384)

營養(yǎng)生長是高等植物早期形態(tài)建成的重要時期，由幼齡期和成熟期組成[1]。只有經(jīng)歷幼齡期和成熟期，實現(xiàn)營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變(vegetative phase change, VPC)，植物體才能進(jìn)入生殖生長，完成開花、結(jié)果[2]。

最早關(guān)于VPC的研究是Knight對木本植物梨樹(Pyruscommunis)和蘋果(Malusdomestica)進(jìn)行的嫁接實驗，實驗說明了植物的營養(yǎng)特性與其未來生殖能力密切相關(guān)[3]。

模式植物擬南芥中，幼齡期葉片近圓形，葉緣平滑，葉片長寬比小，僅在近軸面出現(xiàn)表皮毛；成熟期葉片近匙形，葉緣卷曲，近軸面和遠(yuǎn)軸面均具有表皮毛[2-3]。調(diào)控VPC的分子基礎(chǔ)仍不清楚，擬南芥和玉米(Zeamays)中VPC的分子遺傳分析表明，一種小分子RNA，miR156，及其靶基因SPL(SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEINLIKE)基因家族，在這個轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用。miR156表達(dá)量在幼齡期較高，而在成熟期則降低；SPL3基因表達(dá)則相反，并受到miR156的強(qiáng)烈抑制[2,4]。

生物體中，以約24 h為一個時間節(jié)點，周期反復(fù)振蕩，這一節(jié)律，接近地球自轉(zhuǎn)周期，在原核和真核生物中都存在，是為生物鐘[5-6]。研究表明，生物鐘參與調(diào)控植物生理和生長發(fā)育過程，如細(xì)胞伸長、氣孔開閉、葉片運(yùn)動和開花等[5]。生物鐘由輸入途徑、輸出途徑及核心振蕩器組成；生物鐘核心振蕩器又由中心反饋環(huán)、早反饋環(huán)及晚反饋環(huán)組成[7-8]。擬南芥中，該反饋調(diào)節(jié)環(huán)由3個基因組成:CCA1 (CIRCADIANCLOCKASSOCIATED1)、LHY(LATEELONGATEDHYPOCOTYL)和TOC1 (TIMINGOFCABEXPRESSION1)，其中LHY和CCA1負(fù)調(diào)控TOC1表達(dá)，TOC1則正向調(diào)控LHY和CCA1表達(dá)[9]。GI(GIGANTEA)是植物特異的核蛋白，GI在開花時間調(diào)控、光信號傳導(dǎo)、下胚軸伸長、生物鐘調(diào)控、糖和淀粉積累、抗植物逆境脅迫等許多生理反應(yīng)中起作用[10]。在參與生物鐘調(diào)控中，GI是維持CCA1和LHY啟動子高表達(dá)所必需，并可能是一個TOC1的共同作用因子[5]。

營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變是植物生長發(fā)育的一個重要生理過程，與植物自身生物鐘節(jié)律密切相關(guān)，但其調(diào)控機(jī)制仍不清楚，生物鐘相關(guān)基因在此轉(zhuǎn)變中的作用仍不明確。本研究對擬南芥gi突變體VPC過程進(jìn)行了觀察研究，以探討GI對VPC的影響，為生物節(jié)律與VPC之間的關(guān)聯(lián)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源參見文獻(xiàn)[11]。WT-Col背景下的gi突變體在突變體庫中編號為SALK_092757。

1.2 方法

1.2.1 植物種植

方法參見文獻(xiàn)[11]。植物生長箱中培養(yǎng)周期為：光照培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h。

1.2.2 植株形態(tài)觀察

待種子長出子葉后，開始觀察野生型Col-0及突變體gi的表型，并記錄其生長速率。方法參見文獻(xiàn)[11]。抽薹后，將所有蓮座葉片摘下，測量其長和寬，計算其長寬比。

1.2.3 石蠟切片

方法參見文獻(xiàn)[11]。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)與熒光定量PCR(Q-PCR)

利用RT-PCR與Q-PCR做miR156表達(dá)分析，為Actin-2。植株的總RNA采用CTAB法提取，反轉(zhuǎn)錄方法參見文獻(xiàn)[11]。miR156擴(kuò)增采用頸環(huán)法，Col-0擴(kuò)增33個循環(huán)，gi擴(kuò)增31個循環(huán)。Q-PCR實驗過程中使用BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)[11]。引物序列：Actin2-F:5′-GCTGAGAGATTCAGATGCCCA-3′，Actin2-R:5′-GTGGATTCCAGCAGCTTCCATACT-3′；miR156-F:5′-CATCTTGTAGATCTCTGAAGTTGGACT-3′，miR156-R: 5′-GAGATTGAGACATAGAGAACGAAGACA-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 gi突變體蓮座葉遠(yuǎn)軸面表皮毛出現(xiàn)和生長發(fā)育進(jìn)程

為探討GI對植物生長發(fā)育過程和VPC的影響，我們觀測了gi突變體的生長周期特征。通過對各自25株植株進(jìn)行詳細(xì)的表型觀察統(tǒng)計及分析可看出，野生型Col-0蓮座葉葉片總數(shù)為10片，gi突變體蓮座葉葉片總數(shù)為40片，數(shù)量明顯增多(表1)，說明突變體gi生長周期明顯延長；Col-0蓮座葉出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛為第6片(15 d時)，而gi則是在第8片(18 d時)，表明突變體的遠(yuǎn)軸面表皮毛出現(xiàn)晚于野生型(表1;圖1)，說明其VPC被延遲；生長發(fā)育進(jìn)程觀察顯示，野生型Col-0在生長約23 d出現(xiàn)可見花芽，而突變體在約43 d才出現(xiàn)可見花芽(表1)，開花明顯延遲。

表1 擬南芥野生型和突變體營養(yǎng)生長發(fā)育情況統(tǒng)計Table 1 Growth characteristics of wild-type Col-0 and mutant gi

2.2 gi突變體的葉形和葉片長寬比

為進(jìn)一步探討gi突變體的VPC過程特點，我們對野生型Col-0和gi突變體的葉形變化進(jìn)行了觀察比較。結(jié)果顯示，野生型Col-0的前4片蓮座葉接近圓形，后期的葉片則呈漸長的匙形，葉片長寬比在第6片葉時達(dá)到高位值1.55，隨后逐漸增大；gi突變體的前5片蓮座葉也近圓形，后期的葉片逐漸呈較長的匙形，葉片長寬比在第8片葉時達(dá)到高位值1.89，隨后逐漸增大(圖1)，說明野生型和突變體分別在第6和第8片葉時完成VPC，與遠(yuǎn)軸面表皮毛出現(xiàn)的時間一致，突變體的VPC被延遲。

圖1 野生型Col-0與gi突變體的葉形圖及不同生長時期gi突變體和野生型的葉片長寬比Fig 1 Leaf morphology of wild-type Col-0 and gi mutant and the length width ratio of leaves in wild-type Col-0 and mutant giA：Col-0從第1片真葉開始至第11片蓮座葉葉形；B：gi從第1片真葉至第39片蓮座葉葉形。箭頭處表示VPC發(fā)生時期，即從箭頭后的葉片開始出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛，Bars=1 cm。C：葉片長寬比是以葉片頂端到葉柄聯(lián)合處的距離為長，葉片中部最寬位置為寬得到的比值。* P<0.05 (Student′s t-test)

2.3 gi突變體的莖尖分生組織解剖結(jié)構(gòu)特征

我們在解剖結(jié)構(gòu)層面對莖尖分生組織(shoot apical meristem, SAM)的發(fā)育過程進(jìn)行了顯微觀察。莖尖石蠟切片結(jié)果顯示：Col-0在生長第5 天時，植株分化出2片葉，此時SAM生長錐縱切面呈平坦?fàn)?，?xì)胞尚未分化(圖2-A)；在生長第10天時，植株分化出4片葉，生長錐縱切面稍有凸起，SAM的原套細(xì)胞為單層(圖2-B)；在生長第15天時，植株分化出6片葉，生長錐明顯凸起，原套細(xì)胞開始分化成多層，原體和髓分生組織細(xì)胞分裂，數(shù)目增多(圖2-C)；在第19天，植株分化出8片葉，生長錐繼續(xù)生長、發(fā)育，凸起增高(圖2-D)；在第23天時，植株分化出12片葉，花原基出現(xiàn)(圖2-E)。gi突變體在生長第5天時，植株分化出2片葉，SAM縱切面也為平坦?fàn)?，?xì)胞無分化(圖2-F)。在生長第10天和第15天時，植株分別分化出4片葉和6片葉，生長錐縱切面開始凸起，但莖尖分生組織原套細(xì)胞無分化或為單層(圖2-G和2-H)；在生長第19天時，植株分化出8片葉，生長錐縱切面凸起明顯，原套、原體和髓分生組織均分化、發(fā)育(圖2-I)；在生長第43天時，植株分化出20片葉，花芽發(fā)育(圖2-J)。根據(jù)野生型和突變體莖尖生長錐明顯凸起且分化的時間(分別為第15天和第19天)，判定突變體VPC延遲，與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。

2.4 miR156表達(dá)量水平顯示GI突變導(dǎo)致VPC推遲

我們還檢測了植株發(fā)育過程中miR156的表達(dá)變化。RT-PCR顯示，在野生型Col-0和突變體gi植株中miR156的轉(zhuǎn)錄水平都隨著生長進(jìn)程呈下降趨勢。Col-0植株在第15 d時，miR156表達(dá)量比第11天明顯降低，只約為前者的一半(圖3)，說明在15天時發(fā)生VPC；突變體植株則是在第19天時表達(dá)量約為15天時的一半(圖3)，說明在19 d時發(fā)生VPC。這一結(jié)果表明，突變體VPC延遲。隨后發(fā)育中，當(dāng)植株進(jìn)入開花期(即Col-0生長到23 d，gi生長到43 d)時，幾乎檢測不到miR156的表達(dá)(圖3)。

圖2 野生型Col-0與gi突變體莖尖分生組織解剖結(jié)構(gòu)Fig 2 The anatomical structure of SAM of wild type Col-0 and mutant gi

A-E：Col-0在LD下生長5、10、15、19、23 d時SAM縱切圖；F～J：gi在LD下生長5、10、15、19和43 d時SAM縱切圖。A～J：Bars=50 μm。左上角為切片取材時植株的生長發(fā)育情況，Bars=1 cm

圖3 RT-PCR檢測Col-0與gi不同發(fā)育過程中miR156的表達(dá)Fig 3 Expression analysis of miR156 in Col-0 and gi with RT-PCR amplification

A：Col-0植株中在LD下生長11、15、19、23 d時miR156的表達(dá)量變化; B：gi植株中在LD下生長11、15、19、23、27、31、35、39和43 d時miR156的表達(dá)量變化；Actin-2基因為內(nèi)參，其表達(dá)量作為對照

進(jìn)一步熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，隨著生長發(fā)育進(jìn)程，野生型和突變體植株中的miR156表達(dá)均呈下降趨勢，且miR156在gi中的表達(dá)量高于相應(yīng)發(fā)育時期的Col-0(圖 4)；Col-0植株在生長第15天時，miR156的表達(dá)量下降最快，比前面11 d時測定的量下降1倍多，而gi突變體植株則在第19天時miR156的表達(dá)量下降到前面的1倍多，之后均緩慢下降，說明野生型和突變體植株分別在第15天和第19天時發(fā)生VPC，gi突變體中相對于野生型Col-0延遲了VPC，與本文中其他實驗(包括RT-PCR檢測)結(jié)果相符。

3 討論

在對長日照開花途徑的研究過程中，鑒定出了與開花相關(guān)的重要基因CO(CONSTANS)、FT(FLOWERINGLOCUST)和GI(GIGANTEA)[12]。其中GI是一個與生物鐘相關(guān)的控制開花周期的基因，GI發(fā)生突變導(dǎo)致擬南芥在長日照條件下開花延遲[13]，GI超表達(dá)會造成早花表型[14]。由于開花是營養(yǎng)生長的延續(xù)，GI作為生物鐘相關(guān)基因，參與調(diào)節(jié)了開花的進(jìn)程，但它對營養(yǎng)生長發(fā)育進(jìn)程的影響仍未知。

圖 4 Col-0與gi不同發(fā)育過程中Q-PCR檢測miR156表達(dá)Fig 4 Relative expression analysis of miR156 in Col-0 and gi with Q-PCR amplification

Col-o植株在生長第15 d時，miR156的表達(dá)量比gi植株在生長第19 d時下降較快，結(jié)果表明，突變體相對于野生型Col-o延遲了VPC。*P<0.05 (Student′st-test); **P<0.01

本文中，我們從觀察突變體gi的生長發(fā)育進(jìn)程起始，對其VPC進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究。結(jié)果顯示，從形態(tài)特點、解剖結(jié)構(gòu)以及調(diào)控VPC的miR156表達(dá)的分子檢測等各方面分析，對比野生型Col-0，gi突變體的VPC延遲；而且，gi突變體全部生長發(fā)育歷時較長，至第43天才出現(xiàn)可見花芽，果實成熟需要80 d以上，而野生型Col-0在生長約23 d即出現(xiàn)可見花芽，約60 d果實即成熟，說明gi突變體營養(yǎng)生長時期中成熟期被延長，植株進(jìn)行較長時間的營養(yǎng)生長，產(chǎn)生更多的葉片，導(dǎo)致遲遲不開花，結(jié)果期也延長。據(jù)此推測，GI可能參與VPC的調(diào)控，使得植株從幼齡期及時轉(zhuǎn)變到成熟期，同時，通過和其他開花基因互作，及時完成從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變，調(diào)控植物正常開花；GI基因突變，導(dǎo)致VPC延遲的同時，也產(chǎn)生晚花、晚結(jié)果的表型。此外，我們的前期研究[11]表明，蓮座葉數(shù)目減少的突變體mgo3推遲了VPC的發(fā)生；而蓮座葉數(shù)目增多突變體amp1-1并未使VPC的發(fā)生提前，切除第1、2片真葉推遲了Col-0的VPC發(fā)生。本研究中，gi突變體蓮座葉葉片總數(shù)明顯增多，但其VPC延遲；推測突變體幼齡期產(chǎn)生的真葉受GI基因突變影響較大，數(shù)量較少，造成VPC發(fā)生延遲，而在VPC完成后的成熟期，突變體產(chǎn)生了較多的葉片，使得其成熟期被延長。Yang等[15]通過葉原基切除實驗證明，VPC起始于葉原基的信號，這些信號抑制了miR156的轉(zhuǎn)錄而起作用，這種葉原基產(chǎn)生的因子可能與植物葉片數(shù)量相關(guān)。從本研究的結(jié)果分析，這種相關(guān)性可能更集中在幼齡期葉片的發(fā)生上，且也是通過miR156的表達(dá)調(diào)控的。

SAM的解剖結(jié)構(gòu)在擬南芥發(fā)育成熟過程中產(chǎn)生了凸起的變化[11,16]。gi突變體營養(yǎng)生長期間SAM解剖觀察表明，突變體莖尖分生組織原套、原體細(xì)胞和髓分生組織的高度均低于野生型，且分裂的細(xì)胞層數(shù)和分化狀態(tài)發(fā)生變化，說明GI活性缺失改變了生長的節(jié)律，延遲了SAM的發(fā)育，原套產(chǎn)生多層細(xì)胞較晚，原體和髓分生組織的細(xì)胞發(fā)育延遲，使得突變體蓮座葉生長速率落后于野生型。GI可能通過調(diào)控SAM細(xì)胞活性使其發(fā)育延緩，從而造成營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變的延遲。我們在前期工作[11]的基礎(chǔ)上，通過本研究進(jìn)一步說明VPC的發(fā)生與莖尖分生組織中原套、原體細(xì)胞和髓分生組織的細(xì)胞分化相關(guān)，進(jìn)一步的工作有待GI的時空表達(dá)原位雜交定位。

4 小結(jié)

我們的研究結(jié)果表明GI除了參與開花調(diào)控外，也在VPC調(diào)控中起作用，因此，GI具有功能冗余作用，這些結(jié)果也暗示了營養(yǎng)生長和生殖生長可能存在的發(fā)育相關(guān)性，其他生物鐘基因是否也具有此特性尚待研究。

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