用于增強抗腫瘤功效的共載紫杉醇和基因的殼聚糖衍生物載體

王 石，唐 翠

(1.復旦大學 生命科學學院，上海 200438； 2.復旦大學 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438)

臨床治療惡性腫瘤的方法主要有手術和化療等，而化療配合其他療法已成為腫瘤臨床治療的重要手段[1-3].但化療藥物長期用藥后腫瘤細胞出現(xiàn)多藥耐藥[4-5]，藥物抗腫瘤功效降低[6-7].腫瘤細胞也可通過調節(jié)其復雜的信號通路逃避化療藥物所誘導的細胞凋亡[8].近年，基因治療已成為治療惡性腫瘤的一種新手段[9]，但腫瘤發(fā)生涉及多種基因的改變，對某個或數(shù)個基因功能進行干擾難以達到理想治療效果，如Bcl-2[10].因此，基于化療藥物和基因的聯(lián)合治療近年來被廣泛用于抗腫瘤研究中，通過靶向腫瘤細胞內多個信號通路，協(xié)同增強抗腫瘤功效[11].但常見的化療藥物多為細胞毒性藥物，易對正常組織造成毒副作用[12]；基因藥物等核酸大分子體內穩(wěn)定性差，體內外轉染效率低[13].二者均需借助合適的藥物遞送載體以改善藥物選擇性和穩(wěn)定性，降低毒副作用，增強抗腫瘤功效.納米遞送載體因其較高的靶向性及可顯著提高治療效果而受到廣泛關注，常見的納米遞送載體有聚合物納米粒[14]、無機納米粒[15]等.

殼聚糖(Chitosan)具有生物相容、生物可降解等特點，已被廣泛用作藥物遞送載體[16].殼聚糖含大量活潑氨基和羥基，接枝疏水基團和親水基團，可制得兩親性殼聚糖衍生物[17].兩親性殼聚糖衍生物在水中可自組裝形成以疏水基團為核心、親水基團為外殼的核-殼結構納米粒.疏水修飾可增強納米粒的穩(wěn)定性、提高難溶性藥物的包封率、增強穿透細胞的能力，如烷基化修飾[18]和油酸(oleic acid)修飾[19].親水修飾可改善納米粒的溶解性，提高轉染效率，如PEG化修飾[20]和季胺化修飾[21].為提高納米遞送載體的主動靶向能力，可對其進行配體修飾，如葉酸(Folic Acid, FA)修飾[22].

紫杉醇(Paclitaxel, PTX)是一種天然抗腫瘤藥物，促進微管蛋白聚合抑制微管蛋白解聚，可使細胞阻滯于G2/M期，從而有效抑制細胞分裂導致細胞死亡，已廣泛用于多種實體瘤的治療[23].Survivin基因是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis Protein, AP)基因家族的新成員，編碼產物Survivin蛋白既可與半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)、半胱氨酸蛋白酶7(Caspase7)等結合，通過抑制Caspase活性來抑制細胞凋亡；也可與微管蛋白結合，促進細胞增殖分裂，故抑制Survivin蛋白表達可增強腫瘤細胞對PTX等微管靶向類化療藥物的敏感性[24].Survivin shRNA表達質粒(iSur-pDNA)進入細胞核，方可啟動基因轉錄，下調Survivin蛋白表達，發(fā)揮基因沉默功效[25].故iSur-pDNA可促進PTX的化療功效，PTX與iSur-pDNA具協(xié)同抗腫瘤作用.

本研究制備了兩親性殼聚糖衍生物OTC(Oleic acid and Trimethyl Chitosan),經葉酸(FA)修飾得到FOTC,以此用作難溶性抗腫瘤藥物和基因藥物的共遞送載體.PTX和iSur-pDNA分別經疏水作用和靜電作用包載至納米粒形成納米復合物(FOTC/PTX/pDNA NPs)，同步遞送至病灶部位，體外和體內抗腫瘤試驗表明二者有共同的作用靶點可協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤功效.

1 材料與方法

1.1 材料與動物

殼聚糖(脫乙酰度： 85%，分子量： 100kDa)購自浙江金殼生物化學有限公司；油酰氯，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；碘甲烷購自太倉鑫鵠化工有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)購自Sigma；無內毒素質粒抽提試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；PTX購自浙江海正藥業(yè)有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、Survivin抗體購自Proteintech，美國；其他試劑均為分析純.

QGY-7703細胞(人肝癌細胞，購自美國ATCC)以含10%(體積分數(shù))胎牛血清(FBS)、1%(體積分數(shù))谷氨酰胺、1%(體積分數(shù))非必需氨基酸、100U/mL氨芐青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

昆明小鼠，雌性，體重(20±2)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 OTC和FOTC的合成與表征

參照文獻[26-27,22]方法分別合成N,N,N-三甲基殼聚糖季銨鹽(TMC)、OTC和FOTC.稱取適量TMC、OTC和FOTC，分別溶于氘水(D2O)、D2O和D2O與氘代DMSO混合液，AVANCE DMX500型核磁共振儀分別測定樣品的核磁圖譜.稱取適量TMC、OTC和FOTC樣品，分別與適量KBr粉末混勻、研磨、壓片，NEXUS470型傅立葉變換紅外光譜儀測定樣品的紅外光譜.

1.2.2 納米粒與納米復合物的制備與表征

稱量OTC和FOTC，分別加入H2O，冰浴下脈沖式超聲20min(輸出功率220W，工作2s，間歇2s)，制得2mg/mL OTC和FOTC納米粒.

量取50μL 10mg/mL PTX儲備液，加5mL 2mg/mL納米粒溶液，冰浴下脈沖式超聲20min(輸出功率220W，工作2s，間歇2s)，5000r/min離心30min，制得載PTX的OTC/PTX NPs和FOTC/PTX NPs.

2mg/mL OTC和FOTC納米粒分別與等體積的133μg/mL iSur-pDNA溶液混合，渦旋30s，37℃靜置30min，制得載iSur-pDNA的OTC/pDNA NPs和FOTC/pDNA NPs.

2mg/mL OTC/PTX和FOTC/PTX納米粒分別與等體積的133μg/mL iSur-pDNA溶液混合，渦旋30s，37℃靜置30min，制得共載PTX和iSur-pDNA的OTC/PTX/pDNA NPs和FOTC/PTX/pDNA NPs.

透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米粒.Zetasizer Nano-ZS型電位及粒度測定儀測定納米粒及納米復合物的粒徑和Zeta電勢.量取一定體積的裸pDNA或納米復合物(iSur-pDNA含量為1μg)，加入適量溴酚藍混合均勻，加樣至1%瓊脂糖凝膠上樣孔，120V電泳40min，Gel Safe核酸染料顯色，F(xiàn)R-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)觀察iSur-pDNA條帶并拍照.

參照文獻[28]方法測定納米復合物的載藥量(Loading Capacity, LC)和包封率(Encapsulation Efficiency, EE).

1.2.3 體外釋放

參照文獻[28]方法測定納米復合物的PTX體外釋放；參照文獻[29]方法制備異硫氰酸熒光素(FITC)標記iSur-pDNA，制備含F(xiàn)ITC-iSur-pDNA的納米復合物，分別量取30μL OTC/pDNA NPs、OTC/PTX/pDNA NPs和FOTC/PTX/pDNA NPs，13300r/min離心30min，棄上清，沉淀加入200μL PBS(pH 7.4，0.2mol/L)，重懸分散，37℃、100r/min恒溫震蕩，分別于1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60和72h吸取50μL釋放介質，同時補充50μL新鮮介質，13300r/min離心30min，取上清液，酶標儀測定FITC-pDNA含量(λex=488nm，λem=519nm)，計算pDNA濃度和累積釋放百分率(η累積釋放，%)，繪制釋放曲線.

1.2.4 細胞毒性

QGY-7703細胞以1×104/孔的密度接種至96孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)24h.每6孔為一組，每組分別加入適量OTC和FOTC納米粒，使終濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2和0.5mg/ml，以0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)為陰性對照，37℃、5% CO2培養(yǎng)72h.吸棄孔內液體，每孔分別加入200μL新鮮培養(yǎng)基和20μL以0.2mol/L PBS(pH 7.4)配制的5mg/mL MTT溶液，37℃、5% CO2培養(yǎng)4h.吸棄孔內液體，每孔加入200μL DMSO，37℃、100r/min振搖至甲瓚完全溶解，酶標儀測定570nm處吸光值.以陰性對照組吸光值為100%細胞存活率，計算各試驗組細胞存活率(η細胞存活，%).

1.2.5 細胞攝取

參照文獻[22]方法制備羅丹明B(RhB)標記PTX，QGY-7703細胞以1×105/孔的密度接種至24孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)24h.每3孔為一組，分別加入100μL納米復合物(1mg/mL)，37℃、5% CO2培養(yǎng)4h.吸棄孔內液體，0.2mol/L PBS(pH 7.4)洗滌3次，加入0.5mL 0.5 %(質量濃度)SDS溶液(pH 8.0)，37℃、100r/min振蕩培養(yǎng)30min以裂解細胞.酶標儀測定細胞裂解液中RhB-PTX(λex=560nm，λem=590nm)和FITC-pDNA含量Lowry法測定蛋白含量.細胞攝取量以每毫克蛋白對應的pDNA量(mpDNA,μg)和PTX量(mPTX,μg)表示.

1.2.6 體外轉染

QGY-7703細胞以2×105/孔的密度接種至6孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)24h，更換新鮮無血清培養(yǎng)基，每孔分別加入100μL裸pDNA(66.5μg/mL)或100μL納米復合物(1mg/mL)，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4h，以不加裸pDNA和納米復合物的孔為對照.吸棄孔中液體，每孔加入2mL培養(yǎng)基(含10% FCS)，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)68h.吸棄孔內液體，加入200μL RIPA緩沖液，4℃避光條件下裂解20min.收集裂解液，13300r/min離心10min，吸取200μL上清，加50μL蛋白上樣緩沖液，沸水浴煮10min.加樣20μL至聚丙烯酰氨凝膠(12%)上樣孔，80V電泳2h.轉膜至PVDF膜，浸入30mL脫脂牛奶(5%(質量濃度))，室溫封閉1.5h.50mL Tris-HCL緩沖鹽溶液洗滌3次，浸入適量Survivin抗體工作液(以封閉液1∶1000稀釋)或GAPDH抗體工作液(以封閉液1∶5000稀釋)中，4℃孵育12h.50mL 1× BST洗滌3次，浸入適量辣根過氧化物酶結合的二抗工作液(以封閉液1∶7000稀釋)中，37℃孵育2h.50mL 1× TBST洗滌3次，加入2mL ECL Plus顯色試劑，G：BOX Chemi XR5儀器曝光蛋白條帶觀察并拍照.陽性對照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)內參蛋白.

1.2.7 腫瘤細胞增值抑制

QGY-7703細胞以1×104/孔的密度接種至96孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)24h.每6孔為一組，分別加入適量納米復合物和PTX注射液，使孔內PTX終濃度分別為0.005、0.01、0.05、0.1和0.5μg/mL，以加入0.2mol/L PBS(pH7.4)的細胞為陰性對照，37℃、5% CO2分別培養(yǎng)24h、48h和72h.吸棄孔內液體，每孔分別加入200μL新鮮培養(yǎng)基和20μL以0.2mol/L PBS(pH 7.4)配制的5mg/mL MTT溶液，37℃、5% CO2培養(yǎng)4h.吸棄孔內液體，每孔加入200μL DMSO，37℃、100r/min振搖至甲瓚完全溶解，酶標儀測定570nm處吸光值.以陰性對照組吸光值為100%細胞存活率，計算各試驗組細胞存活率和半數(shù)抑制濃度(IC50).

1.2.8 細胞凋亡

QGY-7703細胞以密度為2×105/孔接種至6孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)24h，每孔加入90μL PTX注射液(40μg/mL)或納米復合物(100μg/mL)，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h.吸棄孔內液體，1mL PBS(pH 7.4，0.2mol/L)洗滌1次，適量胰酶消化30s，加入1mL新鮮培養(yǎng)基，混勻；1500r/min離心5min，吸棄上清，加入PBS(pH 7.4，0.2mol/L)，混勻；1500r/min離心5min，吸棄上清，加入100μL結合緩沖液(1×Binding Buffer)，混勻；分別加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶(PI)，混勻，室溫避光條件下靜置10min.加入400μL結合緩沖液，混勻，F(xiàn)ACS Caliber型流式細胞儀測定細胞凋亡率.以未加PTX注射液和納米復合物的細胞為空白對照.

1.2.9 體內抗腫瘤功效

無菌環(huán)境下，抽取H-22肝癌腹水鼠的腹水，置于已滅菌的50mL燒杯中，加入等體積生理鹽水，混勻，制得腫瘤細胞懸液.健康昆明小鼠右前肢腋下部位于無菌條件下接種0.2mL腫瘤細胞懸液.游標卡尺測量瘤塊長徑(L，mm)和短徑(S，mm)，計算腫瘤體積(Vt，mm3)，Vt=(L×S2)/2，待其長至150mm3時，隨機分組，以便進行后續(xù)實驗.

42只H-22雌性肝癌小鼠，隨機分為7組，每組6只，分別尾靜脈注射給予生理鹽水、空白OTC納米粒、PTX注射液、OTC/pDNA NPs、OTC/PTX/pGL NPs、OTC/PTX/pDNA NPs和FOTC/PTX/pDNA NPs(給藥劑量： 按iSur-pDNA計為2.20mg/kg，按PTX計為1.65mg/kg).第一次給藥時間設為第0天，隔兩天給藥，給藥4次.隔天測量肝癌小鼠瘤塊長徑和短徑，計算腫瘤體積Vt，繪制腫瘤生長曲線.隔日稱量小鼠體重，觀察小鼠精神狀態(tài).第16d時，處死小鼠，解剖出瘤塊，稱量瘤塊重量并拍照.按以下公式，計算各試驗組抑瘤率：

RTI=(mc-mt)/mc×100%，

其中mt為給藥組小鼠腫瘤瘤重(g)，mc為生理鹽水對照組小鼠腫瘤瘤重(g).

2 結果與分析

2.1 OTC和FOTC的制備與表征

圖1為FOTC合成路線圖.殼聚糖游離氨基上的氫分別被甲基、油酸基團取代，制得兩親性殼聚糖衍生物OTC，水中可自組裝形成納米粒.為增強納米粒的主動靶向能力，在水與DMSO混合溶劑中，經EDC·HCL/NHS催化，靶向配體FA羥基與OTC游離氨基形成酰胺鍵連接，制得FOTC.

圖1 FOTC合成路線Fig.1 Synthetic scheme of FOTC①NaOH,NMP,65℃;②DIEA,THF,0℃;③DMAP,TEA,Dioxane/H2O;④EDC/NHS,DMSO/H2O.

圖2(a)為TMC、OTC和FOTC的1H NMR圖譜.δ3.26處為殼聚糖上季胺基團的甲基氫峰，表明季胺取代在殼聚糖C-2位氨基上[30].δ0.87、δ1.20處分別為油酸基團末端的甲基氫峰、油酸基團上亞甲基的氫峰，表明油酸基團已連接至TMC[27].δ6.7處的氫峰代表FA芳香族C-NH的氫，δ8.7處的氫峰代表FA的2-異煙酰胺CH的氫，表明FA已成功接枝至OTC[31].

圖2(b)為TMC、OTC和FOTC的FTIR圖譜.1640cm-1處的信號峰為氨基的反對稱伸縮振動峰，1474cm-1處為季銨基團C-H的反對稱伸縮振動峰，表明殼聚糖的-NH2發(fā)生季銨化取代；1738cm-1為酯鍵與羧基的C=O伸縮振動峰的疊加峰，表明油酸以酯鍵接枝至殼聚糖；1508cm-1處吸收峰的出現(xiàn)和1607cm-1處吸收峰的增強，表明FA以酰胺鍵共價連接至OTC[31].

2.2 納米粒與納米復合物的制備與表征

表1為納米粒、納米復合物的粒徑和Zeta電勢以及PTX載藥量和包封率，可見粒徑為120～160nm，Zeta電勢為25～40mV.與納米粒相比，納米復合物粒徑增大，Zeta電勢降低，這是由于納米粒包載空間位阻較大的PTX進入其疏水核心后，PTX夾在疏水烷基長鏈間，導致納米粒內核緊密度下降，粒徑增大[32]；荷負電pDNA經靜電作用交吸附于納米粒的親水外殼，導致納米粒表面游離氨基減少，Zeta電勢降低.FOTC/PTX/pDNA納米復合物粒徑和電勢無顯著變化，表明FA修飾不影響納米復合物尺度和表面電荷.納米復合物PTX包封率均大于75%，表明納米?？捎行ОdPTX；FOTC/PTX/pDNA NPs的PTX載藥量增加，這是由于FA修飾可增強納米粒的疏水性，增強納米粒與PTX間的疏水作用，提高PTX載藥量[31].

圖2 TMC, OTC, FOTC的1H NMR圖譜和FTIR圖譜Fig.2 1H NMR spectra (a) and FTIR spectra (b) of TMC, OTC and FOTC

注： a，b分別代表OTC與PTX、pDNA的質量比值.

圖3(a)(看第176頁)為納米復合物的凝膠電泳圖，納米復合物可完全阻滯iSur-pDNA的遷移，表明納米粒有效縮合iSur-pDNA.圖3(b)(看第176頁)為OTC納米粒的TEM照片，形態(tài)為球形，粒徑分布均勻，與動態(tài)光散射結果吻合.

圖3 (a) 質量比15∶1時納米復合物的凝膠電泳圖，(b) OTC納米粒的TEM圖Fig.3 (a) Gel retarding assay of NPs at the weight ratios of 15∶1, (b) TEM images of OTC NPs

2.3 體外釋放

圖4(a)(看第176頁)為PTX從不同納米復合物中釋放36h的累積釋放百分率，可見各載藥納米粒均緩慢釋放PTX. FOTC/PTX/pDNA NPs的PTX釋藥速率顯著降低，這是由于FA修飾可增強OTC納米粒與PTX間的疏水作用，減緩PTX從疏水內核向外滲透和擴散[22].

圖4(b)(看第176頁)為iSur-pDNA從納米復合物釋放72h的累積釋放百分率，可見納米復合物pDNA的釋放均為先突釋后緩釋.FOTC/PTX/pDNA NPs的pDNA釋放速率顯著增加，這是由于FA修飾可減弱FOTC納米粒與pDNA間的結合力，加快pDNA向外滲透和擴散.

圖4 PTX和iSur-pDNA的體外累積釋放曲線Fig.4 In vitro release profiles of PTX and iSur-pDNA from NPsn=3.采用Student’s t檢驗，*P<0.05，***P<0.001.

2.4 細胞毒性

圖5(a)為不同濃度的納米粒與QGY-7703細胞共培養(yǎng)72h后的細胞毒性試驗結果，可見在0.02～0.5mg/mL范圍時，細胞存活率均超過85%，與對照組相比無顯著性差異，表明OTC和FPTC納米粒不影響正常細胞的代謝活力，細胞毒性小，安全性好，確保了后續(xù)細胞試驗的可靠性.

2.5 細胞攝取

圖5(b)為納米復合物與QGY-7703細胞共培養(yǎng)4h后細胞攝取量結果，可見PTX和iSur-pDNA的細胞攝取趨勢相似，表明二者共載于納米粒，同步遞送進入細胞，確保PTX和iSur-pDNA聯(lián)合給藥的合理.FA修飾后，QGY-7703細胞對納米復合物的攝取量增加更顯著，這是由于FA受體在QGY-7703細胞表面高表達，通過配體-受體介導的主動靶向作用，促進腫瘤細胞對納米復合物的攝取.

2.6 體外轉染

圖5(c)為納米復合物轉染QGY-7703細胞72h后Survivin蛋白的表達水平，可見對照組和試驗組的GAPDH表達量相同，與對照組、裸pDNA組相比，OTC/pDNA NPs組的Survivin蛋白表達量顯著減少，表明pDNA經納米粒包載后可提高體外轉染效率，介導高效的體外基因沉默；FOTC/pDNA NPs組Survivin蛋白表達量較少，表明FA靶向可介導更為高效的體外基因沉默.

2.7 腫瘤細胞增值抑制

圖5(d)為QGY-7703細胞與不同濃度PTX注射液和納米復合物共培養(yǎng)72h的細胞存活率，可見與游離PTX相比，OTC納米載體可顯著增強PTX對腫瘤細胞增殖的抑制功效.PTX主要與細胞質中微管蛋白結合，作用于細胞周期的G2期和M期，干擾細胞分裂[33-34]；iSur-pDNA干擾Survivin mRNA表達，降低Survivin蛋白表達量，抑制腫瘤細胞非泵多藥耐藥參與者Bcl-2蛋白表達，此外Survivin蛋白也作用于微管，因此抑制Survivin蛋白可提高腫瘤細胞對PTX的敏感性[35-36].由于PTX和iSur-pDNA具有共同的作用靶點且iSur-pDNA可增強PTX的化療效果，PTX與iSur-pDNA可發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤功效，故與OTC/PTX NPs相比，OTC/PTX/pDNA NPs的IC50較低，腫瘤細胞殺傷效果更顯著.FOTC/PTX/pDNA NPs的IC50最低，表明FA修飾可進一步增強納米復合物的抗腫瘤功效[22].

2.8 細胞凋亡

圖5(e)為QGY-7703細胞與PTX注射液或納米復合物共培養(yǎng)24h后經Annexin V-FITC/PI雙染后流式細胞儀檢測的細胞分布圖.PTX經OTX納米粒包載后，其凋亡誘導能力顯著增強，這是由于載藥納米粒細胞攝取量顯著高于游離PTX，可快速達到殺傷腫瘤細胞所需濃度；與OTC/pDNA NPs、OTC/PTX NPs組相比，OTC/PTX/pDNA NPs組的凋亡細胞比例顯著增加，這是由于PTX和iSur-pDNA發(fā)揮了協(xié)同作用，表明聯(lián)合給藥的抗腫瘤功效優(yōu)于單獨給藥.FOTC/PTX/pDNA NPs組凋亡細胞比例最高，這是由于FA修飾可增強OTC納米粒的疏水性，提高PTX包封率；FA修飾可顯著提高iSur-pDNA的基因沉默功效，增強與PTX的協(xié)同抗腫瘤作用；到達腫瘤部位后，F(xiàn)A可通過配體-受體的主動靶向作用，促進腫瘤細胞對納米復合物的攝取.

圖5 不同濃度下空白OTC納米粒和FOTC納米粒與QGY-7703細胞共培養(yǎng)72h后的細胞毒性試驗結果Fig.5 In vitro cytotoxicity of blank OTC NPs and FOTC NPs at various concentrations against QGY-7703 cells after 72 h incubation(a) PTX和iSur-pDNA與QGY-7703細胞共培養(yǎng)4h后細胞攝取試驗結果(n=3);(b) 采用Student’s t檢驗，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.納米復合物轉染QGY-7703細胞72h后Survivin蛋白的表達水平;(c) QGY-7703細胞與不同濃度PTX注射液和納米復合物共培養(yǎng)72h的細胞存活率(n=6);(d) QGY-7703細胞與PTX注射液或納米復合物共培養(yǎng)24h后經Annexin V-FITC/PI雙染后流式細胞儀檢測的細胞分布圖(e)

2.9 體內抗腫瘤功效

圖6(a)為H-22荷瘤小鼠給藥后的體重變化曲線，可見各給藥組小鼠體重均增加，且各組間無明顯差異，表明小鼠體重增長為自然生長過程.

圖6(b)為H-22荷瘤小鼠尾靜脈給藥后的腫瘤生長曲線，可見OTC空白納米粒組與生理鹽水組腫瘤生長迅速，兩者無顯著差異.與生理鹽水組相比，靜脈注射PTX注射液和載藥納米復合物可抑制腫瘤生長，且載藥納米復合物的抑瘤效果更顯著，這是由于PTX經OTC納米粒包載后，可延長其在體內的半衰期，且可通過納米粒EPR效應被動靶向聚集于腫瘤部位[37]，增加腫瘤中PTX的濃度，提高PTX的抗腫瘤功效.與OTC/PTX/pGL NPs、OTC/pDNA NPs相比，OTC/PTX/pDNA NPs組腫瘤生長更為緩慢，表明pDNA與PTX聯(lián)合給藥抗腫瘤效果優(yōu)于PTX、pDNA單獨給藥，證明了PTX與pDNA可協(xié)同抗腫瘤.與OTC/PTX/pDNA NPs組相比，F(xiàn)OTC/PTX/pDNA NPs組腫瘤生長更為緩慢，表明FA修飾后，主動靶向腫瘤細胞，進一步增加腫瘤中PTX和iSur-pDNA濃度，提高抗腫瘤功效.

圖6(c)為給藥后16d荷瘤小鼠的腫瘤照片，生理鹽水組和空白納米粒組腫瘤體積大，表面血管豐富；抑瘤效果最顯著的FOTC/PTX/pDNA NPs組腫瘤體積小，表面血管較少，呈白色，與周圍組織無黏連，易于刨離，表明腫瘤生長受到明顯抑制.

圖6 (a)H-22荷瘤小鼠給藥后的體重變化曲線(n=6);(b)H-22荷瘤小鼠尾靜脈給藥后的腫瘤生長曲線(n=6);(c)給藥后16d荷瘤小鼠的腫瘤照片.結果以mean±SD表示Fig.6 (a) The variation in body weight of H-22 tumor bearing mice treated with different formulations. Values were shown as mean±SD (n=6); (b) Tumor growth curves of H-22 tumor bearing mice after various formulations treatment. Values were shown as mean±SD (n=6); (c) Photographs of tumor from each treatment group excised on day 16.

表2為H-22荷瘤小鼠給藥后16d的瘤重和抑瘤率，可見與生理鹽水組相比，OTC空白納米粒組無顯著差異；其他給藥組均表現(xiàn)出抗腫瘤功效： FOTC/PTX/pDNA>OTC/PTX/pDNA>OTC/PTX/pGL>OTC/pDNA>PTX injection，與腫瘤生長曲線吻合.

表2 H-22荷瘤小鼠給藥后16d的瘤重和抑瘤率

注：n=6.采用Student’st檢驗，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.*表示與生理鹽水之間的差異，#P<0.05,##P<0.01，#表示與PTX注射液之間的差異.&P<0.05,&&P<0.01.&表示與OTC/PTX/pGL之間的差異.εP<0.05.ε表示與OTC/PTX/pDNA之間的差異.

3 討 論

本研究采用兩親性殼聚糖衍生物納米粒共載PTX與iSur-pDNA聯(lián)合給藥，協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用，F(xiàn)A修飾可提高主動靶向能力.粒徑和Zeta電勢影響納米復合物細胞攝取和生物分布，最終影響其抗腫瘤效果[38-39].納米復合物粒徑約150nm，呈致密球形結構，這有利于避免網狀內皮系統(tǒng)的捕獲[40].FA修飾后，納米復合物與PTX的疏水相互作用增強，增加了PTX負載能力，減少了PTX從疏水核心的過早釋放，促進了pDNA的釋放.到達腫瘤細胞后，納米復合物的細胞攝取亦可影響抗腫瘤作用[41].經納米粒包封后，PTX和pDNA的細胞攝取增加，QGY7703細胞上FA受體高表達，F(xiàn)A修飾可顯著促進細胞攝取.pDNA的基因沉默效率和體外抗腫瘤活性可反映納米復合物的遞送效果.OTC/pDNA NPs組Survivin蛋白表達水平明顯降低，這是由于pDNA經納米粒包載后細胞攝取提高；FOTC/pDNA NPs組Survivin蛋白表達水平最低，這是由于FA修飾可顯著促進細胞攝取.FOTC/PTX/pDNA NPs腫瘤細胞增殖抑制能力最強，這是由于較高的細胞攝取，進入細胞后pDNA的快速釋放特征以及PTX與iSur-pDNA協(xié)同效應，與細胞凋亡和體外轉染試驗結果吻合.體內抗腫瘤試驗結果，OTC/PTX/pDNA NPs具有更強的體內抗腫瘤功效，這是由于iSur-pDNA和PTX的同步遞送進入細胞，協(xié)同增強抗腫瘤作用；FOTC/PTX/pDNA NPs抗腫瘤功效最強，這是由于FA修飾提高了PTX的包封率，抑制了PTX的過早釋放，加速了pDNA的細胞內解離，且與腫瘤細胞上FA受體相互作用提高細胞攝取.

FOTC共載PTX與iSur-pDNA，具有理想的粒徑和Zeta電勢，可將PTX和pDNA同步遞送進入腫瘤細胞協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用.因此，F(xiàn)OTC有望作為PTX和pDNA遞送納米載體用于癌癥治療.

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