煙曲霉COFILIN與人GOSR1蛋白相互作用并抑制HEK293T細胞的增殖

邵駿驊，石 超，王亞倩，霍克克

(1.復旦大學 生命科學學院，上海 200438； 2.復旦大學 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438)

煙曲霉是一種條件致病的腐生真菌，在自然界中能夠產生大量的孢子存活于各種環(huán)境中[1]．近年來，隨著器官移植后免疫抑制劑的廣泛應用、艾滋病患者及HIV病毒攜帶者的增多、對血液病及惡性腫瘤等疾病的放化療使用等因素，使得免疫受損的人群逐年增長．在這些免疫力低下的人群中，煙曲霉的侵襲感染率高達50%，病死率約90%[2-3]．雖然煙曲霉導致的侵襲性肺曲霉病、重癥型哮喘、鼻竇炎等疾病的發(fā)病率逐年上升，但目前對其發(fā)病的分子機理尚未完全清楚，對其早期診斷方法和特效藥物研發(fā)方面也還沒能取得重大的突破，這也意味著煙曲霉將是人類戰(zhàn)勝真菌感染的征途上的一大難題[4]．

在真核生物中COFILIN基因編碼的絲切蛋白(COFILIN)和肌動蛋白解聚因子(Actin Depolymerizing Factor, ADF)是肌動蛋白的結合蛋白，它們可以用來切割或是解聚肌動蛋白的細絲，并且能使細胞骨架產生活力．COFILIN基因序列和結構具有高度的保守性，物種親緣關系越近則相似度越高[5]．它的活性是通過磷酸化、去磷酸化、磷酸肌醇、pH改變等因素進行調節(jié)．COFILIN蛋白介導了細胞內的信號途徑參與調節(jié)細胞內的多種生理活動，如細胞凋亡、胞質分裂、細胞遷移等[6]．在誘導物的刺激下，COFILIN能誘導形成片狀偽足并調節(jié)肌動蛋白骨架重組，從而引導癌細胞的侵襲[7]．

已知當病原菌侵染人體時，首先接觸到宿主細胞表面，激活細胞內的小G蛋白酶，通過LIMK(LIM kinase)、ROCK(Rho associated protein kinase)等信號分子調節(jié)COFILIN的磷酸化，從而在宿主細胞表面形成偽足或絲足，這類偽足或絲足易于病原菌的吸附．接著COFILIN會解開包裹在病原菌周圍囊泡后面的肌動蛋白絲，讓病原菌順利侵入細胞[8-9]．在這個過程當中，不僅宿主細胞的COFILIN在進行調控，某些病原菌自身的COFILIN也會參與其中[10]．當真菌作為病原體侵入人體時，COFILIN也同樣發(fā)揮著不可替代的作用．前人的研究[11]發(fā)現，煙曲霉孢子會引起上皮細胞出現褶皺，這種形態(tài)上的改變使得它更易于侵入A549細胞．在整個侵染的過程中，檢測到肌動蛋白的骨架會重新排列，并伴隨有COFILIN磷酸化循環(huán)變化．也有研究報道煙曲霉孢子在侵染A549細胞時會膨脹并與宿主細胞表面的受體結合，誘導細胞內脯氨酸肽酶(Prolidase, PLD)活性升高，從而提高侵染率[12]．而當抑制PLD活性時，侵染率顯著降低．由于COFILIN與PLD有著密切的信號聯系，因此推測在煙曲霉入侵的過程中COFILIN也發(fā)揮著重要的作用[13-14]．

雖然相關的研究都表明COFILIN在煙曲霉侵染宿主細胞的過程中起到重要的作用，但其具體的作用機制仍未完全清楚．本文以煙曲霉COFILIN為誘餌從人巨噬細胞膜蛋白酵母雙雜交文庫篩選它的互作蛋白，從蛋白相互作用的角度探索煙曲霉COFILIN在宿主細胞中的作用機制及其生物學效應．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

DNA限制性內切酶SfiⅠ、dNTP Mix、10×DNA Loading Buffer購自TaKaRa公司．EasyTaq DNA Ploymerase、EasyPfu DNA Ploymerase、DNA Ladder購自北京全式金生物技術有限公司．Bacto-Agar、Yeast Nitrogen Base、Annexin V FITC/PE試劑盒購自BD公司．Tryptone和Yeast extract購自Oxoid公司．氨基酸混合物Dropout、X-gal、Triton X-100、HEPES、Nodient P-40、IPTG、Tween-20均購自于Amresco公司．鮭魚精ssDNA、氨基-1,2,4-三唑(3-AT)、PEG3350、鼠抗Myc、Flag、GST、6×His的單克隆抗體和巰基乙醇以及FACS流式細胞術染色試劑碘化丙錠(PI)均購自Sigma & Aldrich公司．鼠抗GAPDH的單克隆抗體購自Abmart公司．HRP交聯的兔抗鼠二抗購自Proteintech公司．細胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清和胰酶Trypsin-EDTA(0.25%)購自Gibco公司．Lipofectamine 2000脂質體購自Invitrogen公司．蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail tables, complete EDTA-free)購自Roche公司．

膜蛋白酵母雙雜交試劑盒(DUALmembrane starter kit)購自Dualsystems Biotech公司質粒抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司．酵母質粒抽提試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司．PVDF膜、化學發(fā)光底物檢測試劑(ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate, Cat. No. WBKLS0100)均購自Millipore公司．Protein G beads購自GE公司．Glutathione Sepharose 4B購自于Pharmacia Biotech公司．6、12、24和96孔板購自Corning公司．35mm玻底細胞培養(yǎng)皿購自NEST公司．厚濾紙購自上海天能公司．X光片為Kodak公司產品．蛋白預染分子量標準為Thermo Scientific公司產品，其它試劑均為國產分析純．

1.1.2 克隆、文庫、質粒和菌株

煙曲霉COFILIN基因cDNA克隆(AFUA_5G10570)源自A.fumigatusAf293菌株，由軍事醫(yī)學科學院疾病預防控制研究所韓黎教授惠贈．煙曲霉Af293菌株的膜蛋白酵母雙雜交文庫由本實驗室構建．膜蛋白酵母雙雜交菌株為S.cerevisiaeNMY32，酵母雙雜交誘餌載體質粒為pBT3SUC，獵物載體質粒為pPR3N．大腸桿菌菌株為E.coliBL21(DE3)，哺乳動物細胞株分別為HEK293T、HeLa和THP-1．

1.2 方法

1.2.1 膜蛋白酵母雙雜交文庫篩選及回轉驗證

將煙曲霉COFILIN基因的cDNA克隆構建到誘餌載體pBT3SUC上并轉化酵母NMY32菌株．用化學轉化方法將人巨噬細胞cDNA膜蛋白酵母雙雜交文庫質粒轉入已含有誘餌質粒的感受態(tài)細胞，涂布SD-Leu-Trp-His-Ade+60mmol/L 3-AT(SD-4)平板進行培養(yǎng)．從文庫篩選板上挑取能激活HIS3、ADE2和LacZ3個報告基因的陽性菌落轉接到含有更高(120mmol/L)3-AT濃度的(SD-4)平板做進一步鑒定確認．抽提陽性酵母菌落質粒并轉化大腸桿菌擴增后進行DNA測序和BLAST分析．對分離得到的陽性克隆質粒再重新回轉僅含有誘餌克隆質粒的酵母細胞，以驗證相互作用的真實性．

1.2.2 GST pull-down

構建pGEX-5x-1-GOSR1和pET28a-COFILIN兩個原核表達質粒，分別表達GST-GOSR1和6×His-COFILIN融合蛋白．將這兩個重組質粒和pGEX-5x-1空載體分別轉化E.coliBL21(DE3)菌株，活化后以終濃度0.2mmol/L的IPTG在16℃誘導16h．誘導完成后冰浴0.5h，用超聲破壁儀裂解菌體得到上清，破壁參數： 220W，破壁2s，暫停3s，60次．將GST-GOSR1和GST蛋白用Glutathione Sepharose 4B珠子純化，將6×His-COFILIN蛋白用Ni-NTA親和樹脂珠子純化．將結合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B懸浮于500μL NETN buffer(100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl pH 7.0，0.5% Nonidet P-40，1mmol/L PMSF)，加入50μL純化的6×His-COFILIN融合蛋白，4℃結合過夜．沉淀用適量buffer H(20mmol/L Tris-HCl pH 7.7，50mmol/L KCl，20% Glycerol，0.1% Nonidet P-40，0.007% β-巰基乙醇)洗滌3次．沉淀用anti-His單克隆抗體進行Western blot檢測．

1.2.3 免疫共沉淀(Co-IP)

構建pEGFP-GOSR1和pEF-Flag-COFILIN這兩個真核表達質粒，分別表達GFP-GOSR1和Flag-COFILIN融合蛋白．先將這兩個重組質粒連同pEGFP空載體和pEF-Flag-COFILIN作為陰性對照共轉染HEK293T細胞，培養(yǎng)48h后收獲細胞，用細胞裂解液(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCL，1% NP-40，1mmol/L DTT，5mmol/L EDTA，使用前加入蛋白酶抑制劑)裂解后，取上清加入少量Protein G Agarose親和凝膠珠子震蕩1h進行預沉淀，再加入anti-GFP和Protein G Agarose親和凝膠珠子震蕩過夜進行免疫共沉淀，沉淀用anti-Flag的單克隆抗體進行Western blot檢測．

1.2.4 亞細胞共定位

分別構建兩組真核表達質粒pEGFP-GOSR1和pDsRED-COFILIN；pEGFP-COFILIN和pDsRED-GOSR1．將轉染試劑(LipofectamineTM2000 Transfection Reagent)稀釋于Opti-MEM中，輕輕混勻，避免劇烈吹打，3000r/min，3s，室溫靜置5min；將這兩組質粒按照1∶1混合后稀釋于Opti-MEM中，輕輕混勻，避免劇烈吹打，3000r/min，3s，室溫靜置5min．將轉染試劑溶液緩慢地滴加到質粒混合溶液中，輕輕混勻，3000r/min，3s，室溫靜置20min．吸去原來的培養(yǎng)液，更換適量Opti-MEM(約為正常培養(yǎng)液用量的一半)，將混合液慢慢加入培養(yǎng)皿中，輕輕晃勻．繼續(xù)培養(yǎng)24h，用4%多聚甲醛固定，DAPI染細胞核，采用共聚焦顯微鏡觀察結果．

1.2.5 細胞內基因表達檢測

用不同劑量的pEF-Flag-COFILIN分別轉染HEK293T細胞并轉染pEF-Flag空載體和shRNA作為對照．培養(yǎng)48h后收獲細胞，加入TRIzol，提取總RNA．選用逆轉錄引物建立反轉錄體系，用待檢測基因的RT-PCR專用引物，在實時熒光定量PCR儀中進行反應，每個樣品進行3個平行反應，相對定量的檢測GOSR1基因的表達情況．

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡

細胞轉染24h后(對數生長期)，倒去培養(yǎng)液，胰酶適度消化制成單細胞懸液，用PBS(137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 10mmol/L Na2HPO4, 2mmol/L KH2PO4)洗兩次．打孔： 0.3% Triton X-100至終濃度為0.03%．染色： 加入PI至終濃度為50μg/mL，室溫避光染色10min．48μm(300目)濾網過濾，用流式細胞儀(BD FACS)檢測細胞周期變化．

細胞轉染24h后(對數生長期)，加入100mmol/L H2O2至終濃度為2mmol/L處理細胞以誘導凋亡．在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h．經胰酶適度消化后，用PBS洗兩次，用BD FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I檢測細胞凋亡．用1×Binding Buffer重懸細胞使細胞濃度約為1.0×106/mL并取100μL轉移至5mL離心管．加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，混合均勻，25℃避光反應15min．每個離心管再加入400μL的1×Binding Buffer，上機做檢測細胞凋亡情況，1h內完成檢測．

2 結 果

圖1 陽性克隆與COFILIN的回轉驗證結果Fig.1 Rotary verification of the 62 positive clones with COFILIN將62種陽性克隆質粒(其中7號為GOSR1)分別與COFILIN誘餌質粒共轉化酵母菌株后接種在SD-TLHA平板培養(yǎng)3d后的結果．不生長或生長極弱者(如： 25、33、78、89號)為沒有通過驗證．+： 陽性對照(pNubG-Fe65+pTSU2-APP)，—： 陰性對照(pPR3N+pTSU2-APP)．

2.1 煙曲霉COFILIN能與人GOSR1發(fā)生蛋白相互作用

為了尋找煙曲霉菌COFILIN在宿主細胞中的相互作用蛋白，本文采用基于分裂的泛素(split ubiquitin)重構原理建立的膜蛋白酵母雙雜交技術篩選人巨噬細胞cDNA文庫．首先將構建好的誘餌克隆質粒pBT3SUC-COFILIN轉化酵母受體菌株NMY32進行自激活檢測，結果顯示pBT3SUC-COFILIN存在一定程度的自激活作用，但能被濃度≥60mmol/L的3-AT所抑制．因此，將人巨噬細胞文庫質粒DNA轉化含有誘餌克隆pBT3SUC-COFILIN的酵母菌株后，先涂布在含有60mmol/L 3-AT的SD-TL平板上進行培養(yǎng)，共得到102個初始陽性菌落．對這些陽性菌落中的質粒進行DNA測序，并對序列進行BLAST比對，結果表明它們分別屬于62種蛋白的編碼基因克?。疄檫M一步檢驗這些陽性克隆序列所表達的蛋白與COFILIN之間的相互作用，將它們再次分別轉化含有誘餌克隆pBT3SUC-COFILIN的酵母菌株并涂布含有120mmol/L 3-AT的SD-TLHA平板進行回轉驗證．結果顯示GOSR1等58個陽性克隆通過了回轉驗證(圖1)．

2.2 COFILIN與GOSR1的相互作用

為了排除酵母細胞內其他因素介導而產生的假陽性相互作用，我們構建了pGEX-5x-1-GOSR1和pET28a-COFILIN兩個原核表達質粒，分別轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)菌株進行表達，經過分離純化后將這兩種融合蛋白進行GST pull-down實驗，同時以pGEX-5x-1空載體表達產物為陰性對照．結果顯示6×His-COFILIN蛋白能被結合有GST-GOSR1蛋白的親和樹脂珠子吸附，而不能被僅結合GST蛋白的珠子吸附．這表明在體外沒有任何其他蛋白介導的情況下，COFILIN可以與GOSR1發(fā)生直接的蛋白相互作用(圖2)．

圖2 COFILIN與GOSR1在體外的蛋白相互作用驗證Fig.2 Verification of the interaction between COFILIN and GOSR1 in vitro1. pET28a-COFILIN表達產物；2. pGEX-5x-1空質粒和pET28a-COFILIN表達產物；3. pGEX-5x-1-GOSR1和pET28a-COFILIN表達產物.

為了進一步了解這兩個蛋白在細胞環(huán)境內是否真實存在相互作用，我們構建了pEGFP-GOSR1和pEF-Flag-COFILIN這兩個真核表達質粒，并將pEGFP-GOSR1分別與pEF-Flag-COFILIN及與pEGFP空載體共轉染HEK293T細胞進行表達，將培養(yǎng)收獲的細胞裂解液進行Co-IP檢測．結果如圖3所示，Flag-COFILIN及GFP-GOSR1兩種融合蛋白都能順利表達(泳道3、泳道4)，其中結合有GFP-GOSR1融合蛋白的凝膠珠子可以把Flag-COFILIN融合蛋白免疫共沉淀下來(泳道2)，而只結合GFP蛋白的珠子則不能共沉淀Flag-COFILIN融合蛋白(泳道1)．這表明COFILIN和GOSR1可以在細胞內發(fā)生特異性的蛋白直接相互作用．

圖3 COFILIN與GOSR1在體內的相互作用驗證Fig.3 Verification of the interaction between COFILIN interacts and GOSR1 in vivo1和4： pEF-Flag-COFILIN與pEGFP質粒共轉染；2和3： pEF-Flag-COFILIN與pEGFP-GOSR1質粒共轉染．

2.3 COFILIN與GOSR1相互作用區(qū)段的確定

由于全長GOSR1蛋白共有250個氨基酸殘基，為了分析GOSR1中與COFILIN蛋白相互作用的結合部位，我們構建了GOSR1的兩個截短體： pEGFP-GOSR1△A(1～105 aa)和pEGFP-GOSR1△B(96～250 aa)，如圖4(a)所示．將pEGFP-GOSR1、pEGFP-GOSR1△A、pEGFP-GOSR1△B和pEGFP空載體分別與pEF-Flag-COFILIN共轉染HEK293T細胞，經培養(yǎng)48h后收獲細胞做Co-IP實驗，用anti-FLAG單克隆抗體檢測不同的GOSR1截短體與COFILIN的蛋白相互作用．結果如圖4(b)所示，轉染有pEGFP-GOSR1和pEGFP-GOSR1△A的細胞可以將Flag-COFILIN共沉淀下來，而pEGFP-GOSR1△B和pEGFP空載體則不能與Flag-COFILIN共沉淀．這表明GOSR1△A和全長GOSR1一樣可以與COFILIN在體內發(fā)生蛋白相互作用，而GOSR1△B則喪失了與COFILIN發(fā)生蛋白相互作用的能力．這提示GOSR1中含有兩個Coiled coil結構域的1～105 aa區(qū)段是其與COFILIN發(fā)生蛋白結合的重要部位．

圖4 COFILIN和GOSR1相互作用區(qū)域確定Fig.4 COFILIN and GOSR1 Interaction region determination(a) GOSR1的缺失體構建示意圖，其中9～30位和68～95位aa內各有一個Coiled coil結構域，230～250位aa為跨膜結構;(b) 1. pEGFP-GOSR1和pEF-Flag-COFILIN共轉染為陽性對照；2. 截短體pEGFP-GOSR1△A與pEF-Flag-COFILIN共轉染；3. 截短體pEGFP-GOSR1△B與pEFlag-COFILIN共轉染；4. pEGFP和pEF-Flag-COFILIN共轉染為陰性對照．箭頭標示Flag-COFILIN．

2.4 COFILIN與GOSR1在細胞中的共定位

兩個蛋白在細胞中具有共同的空間定位是它們之間能發(fā)生相互作用的前提條件．為了檢驗COFILIN與GOSR1在細胞內是否有相互接觸并且發(fā)生相互作用的基礎，我們進行了細胞內熒光共定位檢測實驗．結果如圖5所示，GFP-GOSR1和RED-COFILIN在HeLa細胞內的熒光共定位檢測結果顯示，GFP-GOSR1僅在細胞質中定位；而RED-COFILIN在整個細胞中都有分布，且在細胞質中的分布量高于細胞核內．GFP-COFILIN和RED-GOSR1在細胞內的熒光共定位檢測結果顯示，GFP-COFILIN在整個細胞中都有分布，而RED-GOSR1只在細胞質中定位．此實驗結果表明雖然GOSR1只定位在細胞質，但由于COFILIN蛋白在整個細胞都有分布，且在細胞質中的含量高于細胞核，因此這兩個蛋白具有在細胞質中相遇并發(fā)生相互作用的空間基礎．

2.5 COFLIN的過表達會抑制GOSR1

為了研究煙曲霉COFILIN蛋白與宿主內源GOSR1蛋白的相互作用會對細胞產生什么生理效應，我們首先通過調節(jié)煙曲霉COFILIN表達質粒對HEK293T細胞的轉染量，檢測COFILIN的過表達對細胞內源GOSR1蛋白表達量的影響．結果如圖6所示，隨著pEF-Flag-COFILIN轉染量的增加，Flag-COFILIN融合蛋白的表達水平也相應提高，但細胞內源GOSR1蛋白的表達量均顯著低于僅轉染pEF-Flag空載體的陰性對照．提示煙曲霉COFILIN的過表達會使細胞內源GOSR1的蛋白表達受到抑制．

圖6 過表達COFILIN在蛋白水平上抑制GOSR1Fig.6 COFILIN decreases the protein expression of endogenous GOSR1泳道從1到4依次是轉染pEF-Flag-COFILIN 1μg、2μg、3μg和pEF-Flag空載體2μg到HEK293T細胞．

因GOSR1是具有重要功能的蛋白質，如果COFILIN抑制了它的表達，勢必會引起一系列生物學效應．為了確認這些效應是由于這兩個蛋白相互作用引起的，我們通過RNA干擾改變細胞內GOSR1蛋白的表達水平，作為后續(xù)實驗的對照．小分子的RNA能夠在轉錄水平與目的基因的mRNA結合，從而抑制該基因的表達．本實驗共設計了3條針對GOSR1的shRNA(shRNA768、shRNA769、shRNA770)用于在HEK293T細胞內瞬時表達，以削減內源GOSR1的表達．

為了進一步分析COFILIN對GOSR1表達的抑制是發(fā)生在蛋白水平還是轉錄水平，我們又進行了實時熒光定量PCR實驗．將不同量的pEF-Flag-COFILIN、pEF-Flag空載體以及shRNA768分別轉染HEK293T細胞，并在12孔板培養(yǎng)，轉染48h后，通過抽提總RNA，逆轉錄合成cDNA，進行RT-PCR檢測，對每個樣品中的每個基因都做3個平行重復．

實時定量PCR實驗的結果顯示，作為陽性對照的shRNA可以顯著降低內源GOSR1的mRNA水平，在用不同劑量轉染pEF-Flag-COFILIN質粒的3組細胞內，GOSR1的mRNA水平都不同程度地低于陰性對照組，但降低幅度與pEF-Flag-COFILIN質粒轉染量并不呈現正相關性．表1、圖7(看第160頁)表明煙曲霉的COFILIN對GOSR1在轉錄和翻譯的水平都有抑制，但主要表現在翻譯水平．

表1 RT-PCR檢測GOSR1相對hACTB的mRNA水平

注： 樣品1、2、3分別轉入了pEF-Flag-COFILIN重組質粒0.5μg、1μg、2μg；樣品4轉入了shRNA768作為陽性對照；樣品5轉入了pEF-Flag空載體2μg作為陰性對照．以轉入pEF-Flag空載體的細胞內GOSR1的mRNA水平為參照，熒光定量PCR檢測不同轉染條件下細胞內GOSR1與內參ACTB(Actin-β)的相對mRNA水平．

圖7 GOSR1相對hACTB的mRNA水平Fig.7 mRNA levels of endogenous GOSR1 relative to hACTB樣品1、2、3依次轉入了pEF-Flag-COFILIN重組質粒0.5μg、1μg、2μg；樣品4轉入了shRNA768作為陽性對照；樣品5轉入了pEF-Flag空載體2μg作為陰性對照.

2.6 COFILIN的過表達會抑制細胞增殖

為研究COFILIN與GOSR1相互作用對細胞的生理效應，我們又檢測了這對蛋白互作對HEK293T細胞增殖的影響．本實驗共設置了3個實驗組，第一組轉染pEF-Flag空載體和pEF-Flag-COFILIN，第二組轉染pEGFP空載體和pEGFP-GOSR1，第三組分別轉染CON55(陰性對照)、shRNA768、shRNA769和shRNA770．培養(yǎng)24h后，采用MTT細胞活性法(OD490)對細胞的增殖情況進行檢測．結果如圖8所示，煙曲霉COFILIN的過表達會抑制細胞增殖(圖8(a))，內源GOSR1的過表達能促進細胞增殖(圖8(b))，但敲減內源GOSR1的表達會抑制細胞增殖(圖8(c))．提示煙曲霉COFILIN通過與內源GOSR1相互作用降低后者表達而使細胞增殖受到抑制．

圖8 MTT細胞活性檢測Fig.8 MTT cell activity assay(a) pEF-Flag空載體和pEF-Flag-COFILIN共轉染HEK293T細胞；(b) pEGFP空載體和pEGFP-GOSR1共轉染HEK293T細胞；(c) CON55對照質粒分別與shRNA768、shRNA769、shRNA770共轉染HEK293T細胞．

2.7 COFILIN與GOSR1的相互作用影響細胞周期

為進一步了解煙曲霉COFILIN過表達導致細胞增殖減緩所產生的細胞生物學效應，我們又檢測了它對細胞周期的影響，檢測結果如圖9所示．

圖9 細胞周期的流式細胞儀檢測結果Fig.9 Cell cycle results detected by flow cytometry(a) 實驗組1，分別轉染pEGFP空載體、pEGFP-COFILIN、pEGFP-GOSR1的HEK293T細胞24h后流式細胞檢測細胞周期的分析圖表．實驗組2，分別轉染CON55、shRNA768、shRNA769、shRNA770細胞24h后流式細胞檢測細胞周期的分析圖表．結果用ModFit LT V3.311(Mac)進行分析．(b) 細胞周期百分比圖．

在實驗組1中，過表達GFP-COFILIN融合蛋白的細胞G2期較陰性對照(轉染pEGFP空載體)相比有所增多，但過表達GFP-GOSR1的細胞G2期細胞與陰性對照無明顯差別；在實驗組2中，RNA干擾內源GOSR1后的細胞與陰性對照(轉染CON055)相比，G2期細胞也有所增多．提示過表達的煙曲霉COFILIN蛋白可通過與GOSR1相互作用并降低GOSR1蛋白的表達而導致細胞發(fā)生G2期阻滯．

2.8 COFILIN與GOSR1的相互作用影響細胞凋亡

經過前面的實驗發(fā)現，煙曲霉COFILIN在HEK293T細胞中過表達會在一定程度上抑制細胞增殖并導致細胞G2期阻滯．那么它是否會引起細胞凋亡？我們用BD ANNEXIN-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測了細胞的凋亡情況．結果如圖10(看第162頁)所示，在實驗組1中，細胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)分別為25.49%、37.10%和22.61%，其中轉染pEF-Flag-COFILIN的細胞早期凋亡和晚期凋亡均比空載體上升，而轉染pEF-Flag-GOSR1則有所下降．在實驗組2中，細胞凋亡率為26.01%、34.71%、42.74%和51.46%，轉染shRNA的細胞早期凋亡和晚期凋亡均高于對照組．表明煙曲霉COFILIN過表達會促進細胞凋亡，而內源的GOSR1的表達減少也會加速細胞的凋亡．提示細胞內源GOSR1對于H2O2毒性而導致的細胞凋亡具有一定的保護作用，煙曲霉COFILIN可通過與內源GOSR1蛋白的相互作用抑制其功能促進細胞凋亡．

圖10 細胞凋亡的流式細胞儀檢測結果Fig.10 Cell apoptosis results detected by flow cytometry實驗組1： 分別轉染pEF-Flag、pEF-Flag-COFILIN、pEF-Flag-GOSR1到HEK293T細胞；實驗組2： 分別轉染CON055、shRNA768、shRNA769、shRNA770到HEK293T細胞．

3 討 論

本文首次以煙曲霉COFILIN基因為誘餌從人巨噬細胞膜蛋白酵母雙雜交文庫中篩選發(fā)現了一批新的相互作用蛋白，并重點對COFILIN與GOSR1之間的蛋白相互作用及其細胞生物學效應進行了探索研究．

GOSR1屬于SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)大家族，即可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子連接復合體[15]．它在高爾基體內部囊泡的運輸及高爾基體與內質網之間囊泡的運輸中發(fā)揮著重要的作用[16]．GOSR1的主要功能是參與內質網到高爾基體運輸的對接和融合，它在高爾基體超低密度脂蛋白運輸囊泡的融合中具有重要的功能[17]，但它的其他細胞生物學功能還沒有被清楚地報道過．

在真核生物中，細胞器與細胞器之間，細胞與細胞間的物質與信息交流是細胞生命活動的基本保證，而囊泡的運輸是細胞器之間和細胞之間物質交流和信息傳遞的主要方式[18]．大多數的囊泡融合過程由SNARE介導，因此不同物種間的SNARE具有高度的保守性．SNARE蛋白家族成員組成的膜融合系統(tǒng)調控著細胞內和細胞間的主要運輸[19-21]．

致病力蛋白是致病真菌入侵機體的關鍵因素，也是其逃逸宿主免疫系統(tǒng)防御的主要手段．煙曲霉侵入宿主黏膜上皮細胞、血管內皮細胞等，是其躲避宿主免疫攻擊、穿越組織屏障的重要機制．其間發(fā)生細胞肌動蛋白骨架重排，而COFILIN是此過程的重要調控核心，因此也被認為是其主要的致病力蛋白之一，但目前人們對其過程了解仍非常有限[22-24]．

我們通過在細胞內過表達煙曲霉COFILIN，發(fā)現其會導致內源性的GOSR1表達量下調，熒光定量PCR實驗的結果也顯示COFILIN抑制了GOSR1 mRNA的轉錄，提示COFILIN與GOSR1在體內的相互作用降低了內源GOSR1的表達量．進一步研究發(fā)現當煙曲霉的COFILIN進入宿主細胞表達后，細胞的增殖會受到抑制并發(fā)生G2期阻滯，同時促進在H2O2誘導下的細胞凋亡．這與采用RNA干擾將GOSR1的蛋白表達水平敲低出現的結果相同．反之，若通過轉染外源GOSR1過表達增加其蛋白水平，就能使細胞增殖速度加快并抑制H2O2誘導的細胞凋亡，且G2期細胞與空載體陰性對照沒有明顯差異．這表明煙曲霉COFILIN與宿主內源GOSR1蛋白的相互作用對細胞增殖和細胞凋亡等生理過程的調控有重要影響．

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