高三尖杉酯堿聯(lián)合JQ1對急性髓系白血病細(xì)胞株Kasumi-1、Mv4-11的凋亡誘導(dǎo)作用

樂靜 李楓林 牧啟田 袁嬌嬌 裴仁治 金潔 陸瀅

高三尖杉酯堿（Homoharringtonine，HHT）是從我國植物三尖衫中提取的一種具有細(xì)胞毒性的生物堿，目前在國內(nèi)是治療急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的常規(guī)藥物之一，其中HHT聯(lián)合阿克拉霉素、阿糖胞苷的HAA方案是治療中青年AML的一線治療方案[1]。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HHT聯(lián)合不同藥物可以對特定的AML細(xì)胞株發(fā)揮協(xié)同抑制作用，例如HHT聯(lián)合FLT3-ITD抑制劑索拉菲尼可以協(xié)同抑制FLT3-ITD突變的AML細(xì)胞株[2]。JQ1是近年來合成的靶向表觀遺傳蛋白BRD4的小分子抑制劑，它具有廣泛的抗AML作用[3]。本研究觀察HHT聯(lián)合JQ1對AML細(xì)胞株的殺傷作用，以探討HHT聯(lián)合JQ1治療AML的可行性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 AML細(xì)胞株Kasumi-1及Mv4-11（由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院饋贈），Gibco FBS的IMDM培養(yǎng)基及1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），HHT、JQ1（美國 Sigma公司），MTS細(xì)胞增殖測試試劑盒（批號：0000282257，美國Progema公司），Annex－inV-FITC/PI凋亡測試試劑盒（批號：83001302，上海聯(lián)科生物公司），兔抗人 Gapdh、Bcl-2、Caspase-3，Parp 一抗及兔二抗（美國CST公司）。安全柜（型號：1374，美國Thermo公司），CO2培養(yǎng)箱（型號：3111，美國 Thermo公司），電熱恒溫水槽（型號：DK-8D，上海精宏公司），高速離心機(jī)（型號：Legend Micro17R，美國 Thermo公司），倒置生物顯微鏡（型號：CKX31，日本奧林巴斯公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（型號：3001，美國Thermo公司），流式細(xì)胞儀（型號：FACS-Cantoll，美國BD公司），蛋白印記檢測系統(tǒng)（型號：ChemiDoc-MP，美國BioRad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將Mv4-11細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%FBS的IMDN培養(yǎng)液中，Kasumi-1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS的 1640 培養(yǎng)液中，在 37℃、75%N2、5%CO2、20%O2的環(huán)境中培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTS法檢測單藥及兩藥聯(lián)合對AML細(xì)胞株的抑制作用 （1）單藥細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：Mv4-11、Kasumi-1細(xì)胞鋪24孔板，細(xì)胞鋪板密度為1.0×105/ml。鋪板48h后移板至96孔板，加入20μl MTS，4h后用酶標(biāo)儀檢測490nm 的 OD 值 。 HHT 濃 度 采 用 1、2、4、8、16、32、64nmol/L，JQ1 濃度采用 50、100、200、400、800nmol/L。細(xì)胞存活率=（用藥組OD值-空培養(yǎng)基OD值）/（對照組OD值-空培養(yǎng)基OD值）×100%，根據(jù)公式計算各個濃度作用72h的細(xì)胞存活率。利用Graphpad Prism軟件計算 HHT、JQ1 對 AML 細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度（IC50）。（2）兩藥聯(lián)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：根據(jù)HHT及JQ1單藥的IC50，對于 Mv4-11 細(xì)胞，HHT 濃度采用 2、4、8nmol/L，分別與100、200、400nmol/L 的 JQ1聯(lián)合；對于 Kasumi-1細(xì)胞，HHT 濃度采用 5、10、15、20nmol/L，分別與 100、200、300、400nmol/L的JQ1聯(lián)合。細(xì)胞鋪板密度為1.0×105/ml，鋪板72h后移板至96孔板，加入20μl MTS，4h后用酶標(biāo)儀檢測490nm的OD值。根據(jù)上述細(xì)胞存活率公式，計算兩藥聯(lián)合作用72h的細(xì)胞存活率。（3）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：Mv4-11、Kasumi-1細(xì)胞鋪96孔板，細(xì)胞鋪板密度為5.0×103/100μl，鋪板 0、24、48、72、96h，加入 20μl MTS，4h后用酶標(biāo)儀測490nm的OD值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均OD值。對于Mv4-11細(xì)胞，HHT濃度采用4nmol/L，與200nmol/L的JQ1聯(lián)合；設(shè)置空白對照組、HHT組、JQ1組、兩藥聯(lián)合組。對于Kasumi-1細(xì)胞，HHT濃度采用15nmol/L，與300nmol/L的JQ1聯(lián)合；設(shè)置空白對照組、HHT組、JQ1組、兩藥聯(lián)合組。細(xì)胞增殖倍數(shù)=每個時間點(diǎn)OD值/0h的OD值，根據(jù)公式計算每組各個時間點(diǎn)的細(xì)胞增殖倍數(shù)，同時利用Graphpad Prism軟件描繪細(xì)胞生長曲線。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測兩藥聯(lián)合對AML細(xì)胞株凋亡的作用 Mv4-11細(xì)胞的HHT濃度采用4nmol/L，JQ1濃度采用200nmol/L；Kasumi-1細(xì)胞的HHT濃度采用15nmol/L，JQ1濃度采用300nmol/L，鋪板6孔板，細(xì)胞鋪板密度為 1.0×105/ml；培養(yǎng) 48h 后，1 500r/5min 離心，收集細(xì)胞團(tuán)塊。用冷的PBS洗細(xì)胞團(tuán)塊2次，加入500μl Binging Buffer懸浮細(xì)胞，再加入5μl AnnexinV-FITC和10μl PI混勻，室溫避光15min。1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 Western blot法檢測兩藥聯(lián)合對凋亡相關(guān)蛋白的作用 Mv4-11細(xì)胞HHT濃度采用4nmol/L，JQ1濃度采用 200nmol/L；Kasumi-1細(xì)胞的 HHT濃度采用15nmol/L，JQ1濃度采用300nmol/L。鋪板6孔板，細(xì)胞鋪板密度為1.0×105/ml；培養(yǎng)48h后，1 500r/5min離心，收集細(xì)胞團(tuán)塊。加入RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞團(tuán)塊，冰上孵育30min，12 000r/15min離心，取上清液于EP管。采用BCA法檢測蛋白濃度，蛋白上樣量為40μg。SDS-PAGE凝膠電泳后PVDF膜轉(zhuǎn)膜，1∶1 000過夜孵育一抗，1∶5 000孵育辣根過氧化物酶二抗，顯色并用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)采集并分析數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用Graphpad Prism統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HHT、JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用AML細(xì)胞株的存活率 不同濃度HHT及JQ1處理AML細(xì)胞株Mv4-11、Kasumi-1后，證實(shí)兩藥聯(lián)合對AML細(xì)胞株有生長抑制作用。HHT、JQ1作用Mv4-11細(xì)胞的IC50分別為7.2（95%CI：5.6~9.2）、345.7（95%CI：333.2~358.6）nmol/L，作用Kasumi-1細(xì)胞的IC50分別為22.3（95%CI：20.75~23.94）、356.9（95%CI：338.0~374.9）nmol/L。對于 Mv4-11細(xì)胞，4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用72h的細(xì)胞存活率分別為62.5%、93.1%和42.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；8nmol/L的 HHT、400nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用72h的細(xì)胞存活率分別為24.0%、62.1%和8.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1a。對于Kasumi-1細(xì)胞，5nmol/L的HHT、100nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用72h的細(xì)胞存活率分別為97.0%、113.3%和44.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；10nmol/L的 HHT、200nmol/L的 JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用72h的細(xì)胞存活率分別為55.0%、108.0%和26.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用72h的細(xì)胞存活率分別為33.2%、95.6%和15.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；20nmol/L 的 HHT、400nmol/L 的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用72h的細(xì)胞存活率分別為25.1%、62.5%和9.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1b。

圖1 HHT、JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用AML細(xì)胞株的存活率（a：2、4、8nmol/L的HHT與100、200、400nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用 Mv4-11 細(xì)胞 72h 的存活率；b：5、10、15、20nmol/L 的 HHT 與 100、200、300、400nmol/L 的 JQ1 單藥及兩藥聯(lián)合作用 Kasumi-1 細(xì)胞72h的存活率）

2.2 HHT、JQ1單藥及兩藥聯(lián)合對AML細(xì)胞株增殖的抑制作用 進(jìn)一步選擇4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用Mv4-11細(xì)胞，15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用Kasumi-1細(xì)胞，以觀察單藥及兩藥聯(lián)合對AML細(xì)胞株增殖的抑制作用。生長曲線顯示HHT聯(lián)合JQ1作用于2個細(xì)胞系后，細(xì)胞生長速度明顯慢于單藥作用（均P＜0.05），見圖2。

圖2 HHT、JQ1單藥及兩藥聯(lián)合對AML細(xì)胞株增殖的抑制作用（a：4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合對Mv4-11細(xì)胞增殖的抑制作用；b：15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合對Kasumi-1細(xì)胞增殖的抑制作用）

2.3 HHT、JQ1單藥及兩藥聯(lián)合對AML細(xì)胞株凋亡的誘導(dǎo)作用 對于Mv4-11細(xì)胞，4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用后，細(xì)胞凋亡率分別為27.7%、12.8%和59.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3ab。對于Kasumi-1細(xì)胞，15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用后，細(xì)胞凋亡分別為9.1%、8.5%和31.2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3c-d。

2.4 HHT、JQ1單藥及兩藥聯(lián)合對AML細(xì)胞株凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 由于HHT聯(lián)合JQ1可以明顯誘導(dǎo)AML細(xì)胞株的凋亡，筆者應(yīng)用Western blot法檢測了凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。對于Mv4-11細(xì)胞，4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1兩藥聯(lián)合較單藥能明顯抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3蛋白表達(dá)，見圖4a。對于Kasumi-1細(xì)胞，15nmol/L的 HHT、300nmol/L的 JQ1兩藥聯(lián)合較單藥能明顯抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)Parp的降解而出現(xiàn)裂解條帶，見圖4b。

3 討論

圖3 HHT、JQ1單藥及兩藥聯(lián)合對AML細(xì)胞株凋亡的誘導(dǎo)作用（a-b：4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合對Mv4-11細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用；c-d：15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合對Kasumi-1細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用）

在我國，HHT用于治療AML已有20余年歷史。目前HAA方案作為＜60歲患者一線治療方案而寫入中國AML患者診療指南，同時作為候選治療方案而寫入復(fù)發(fā)難治的AML患者診療指南中[1，4-5]。以HHT為基礎(chǔ)藥物聯(lián)合經(jīng)典及新型的小分子抑制劑對AML患者的療效是近年來研究的方向，以探索AML治療的新方案。JQ1是表觀遺傳蛋白BRD4的靶向抑制劑，單藥對白血病干、祖細(xì)胞及多種AML細(xì)胞株具有明顯的抑制作用[3]。本文通過研究HHT聯(lián)合JQ1對AML細(xì)胞株的作用，以探索HHT聯(lián)合JQ1的可行性。

BRD4是近年來發(fā)現(xiàn)的BET家族的一員。研究表明BET蛋白家族可能與一些疾病通路相關(guān)，因此認(rèn)為其可作為潛在的藥物治療靶點(diǎn)，其中最顯著的是BRD4[6]。JQ1是靶向BRD4的新合成的小分子抑制劑，最早由Filippakopoulos研究小組合成并應(yīng)用于人鱗狀細(xì)胞癌，結(jié)果顯示JQ1通過與溴結(jié)構(gòu)域競爭性結(jié)合而抑制BRD4與組蛋白乙?；嚢彼釟埢慕Y(jié)合，促進(jìn)鱗狀細(xì)胞癌的分化并顯示特殊的抗增殖作用[7]。進(jìn)一步研究表明，JQ1對血液系統(tǒng)惡性腫瘤多發(fā)性骨髓瘤（MM）[8]、非霍奇金淋巴瘤[9]、急性淋巴細(xì)胞白血病[10]具有抑制作用。Zuber等[11]用RNAi干擾的方法證實(shí)了BRD4抑制在AML中可作為治療靶點(diǎn)；體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白血病干、祖細(xì)胞及多種AML細(xì)胞株對JQ1敏感，可引起白血病細(xì)胞的生長抑制及凋亡，雖然對正常骨髓細(xì)胞株也有一定的抑制，但相較于AML細(xì)胞株需要更高的IC50值；同時發(fā)現(xiàn)HHT聯(lián)合阿糖胞苷可以發(fā)揮協(xié)同抗AML細(xì)胞株的作用。本研究結(jié)果也驗(yàn)證了JQ1對AML細(xì)胞株Mv4-11及Kasumi-1均有明顯抑制作用，但是目前并無相關(guān)文獻(xiàn)研究JQ1聯(lián)合HHT對AML細(xì)胞株的作用。

圖4 HHT、JQ1單藥及兩藥聯(lián)合對AML細(xì)胞株凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（a：4nmol/L的HHT、200nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用Mv4-11細(xì)胞48h對Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響；15nmol/L的HHT、300nmol/L的JQ1單藥及兩藥聯(lián)合作用Kasumi-1細(xì)胞48h對Bcl-2、Parp蛋白表達(dá)的影響）

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HHT聯(lián)合JQ1對AML細(xì)胞株的抑制作用明顯強(qiáng)于單藥，且兩藥聯(lián)合可以明顯抑制AML細(xì)胞株的生長；提示HHT聯(lián)合JQ1是治療AML的可行方案。本文進(jìn)一步探索HHT聯(lián)合JQ1對AML細(xì)胞株凋亡的作用，結(jié)果表明HHT聯(lián)合JQ1對AML細(xì)胞株凋亡的誘導(dǎo)作用明顯強(qiáng)于單藥，Western blot檢測又發(fā)現(xiàn)HHT聯(lián)合JQ1相較于單藥可以明顯抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，并激活Caspase-3蛋白表達(dá)，引起Parp的裂解。Bcl-2是凋亡途徑中重要的凋亡抑制因子，細(xì)胞發(fā)生凋亡可以抑制其表達(dá)水平，且細(xì)胞在發(fā)生凋亡時伴隨Caspase-3的激活并引起Parp的降解，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[12]。

綜上所述，HHT聯(lián)合JQ1可以增強(qiáng)抗AML細(xì)胞株的作用，促進(jìn)AML細(xì)胞株的凋亡，是有效的聯(lián)合方案。但具體作用機(jī)制及臨床應(yīng)用的可行性有待進(jìn)一步研究。

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