玉米抗南方銹病性狀遺傳分析與連鎖分子標(biāo)記的篩選

王文潔 周聯(lián)東 張瑞平 孫佩 劉經(jīng)緯 王蕊

摘要?[目的]對(duì)玉米南方銹病性狀進(jìn)行遺傳分析，篩選南方銹病基因連鎖的SSR引物標(biāo)記，并進(jìn)行初步定位。[方法]以抗南方銹病玉米自交系K381和感病自交系LX9801為材料，構(gòu)建6個(gè)世代群體（P1、P2、F1、F2、B1CF1、B2CF1），對(duì)玉米南方銹病進(jìn)行遺傳分析，利用SSR標(biāo)記對(duì)南方銹病連鎖基因進(jìn)行引物篩選，并利用篩選的分子標(biāo)記對(duì)輔助抗南方銹病材料進(jìn)行前景選擇。[結(jié)果] F2代分離群體抗病株與感病株比例符合3∶1分離比例，B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]群體抗感株接近1∶1分離比例，推測(cè)其抗性基因?yàn)閱我伙@性基因控制的，與10.02區(qū)域內(nèi)的2對(duì)SSR引物phi059和umc2018緊密連鎖，初步認(rèn)為K381的抗南方銹病基因位于第10號(hào)染色體短臂上。[結(jié)論]引物phi059可以用于玉米抗南方銹病材料輔助選擇。

關(guān)鍵詞?玉米;南方銹病;SSR分子標(biāo)記;基因定位

中圖分類(lèi)號(hào)?S503.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2018）35-0100-03

2015年玉米南方銹病在河南南陽(yáng)、駐馬店、周口、商丘等15個(gè)地（市）暴發(fā)流行，覆蓋全省主要玉米種植區(qū)，全省共計(jì)發(fā)生188.55萬(wàn)hm2，占玉米種植面積的56.1%[1]。在流行年份，南方銹病能造成玉米大幅減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)超過(guò)45%[2-3]。暴發(fā)流行時(shí)，除造成品質(zhì)下降外，減產(chǎn)可達(dá)80%以上，甚至絕收[4]。南方銹病是一種暴發(fā)性、毀滅性病害，防治非常困難，最有效的方法是選擇抗病品種。由于該病害并非常年發(fā)生，因此常規(guī)育種過(guò)程中，在缺乏病害選擇的情況下，很容易造成抗病基因的丟失。這是目前生產(chǎn)上應(yīng)用的玉米自交系大多數(shù)感染南方玉米銹病的主要原因之一，目前生產(chǎn)上大部分品種不抗南方銹病。分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用不受環(huán)境、時(shí)間、地點(diǎn)和病害發(fā)生與否的影響。該技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移可在早代進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定地選擇，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率。與常規(guī)育種相比，該技術(shù)可提高育種效率2～3倍。

目前在分子標(biāo)記輔助玉米抗南方銹病育種方面也做了大量研究。2003年，陳翠霞等[5]以齊319×340的F2和BC1F1群體為材料，通過(guò)SSR-BSA分析，將齊319抗病基因RppQ定位在第10號(hào)染色體短臂上，與標(biāo)記phi041和phi118連鎖，遺傳距離分別為2.45、3.33 cM。2009年，張斌[6]也利用齊319為供體親本，以南方玉米銹病感病自交系L189、DH4866、502、5003、鄭58、昌7-2、9801等為受體親本，通過(guò)回交育種，利用phi041和phi118這2個(gè)標(biāo)記輔助選擇，得到了抗南方玉米銹病良好的BC4Fl代材料。李少博等[7]用引物phill8和P2輔助選擇，對(duì)骨干自交系京24進(jìn)行抗南方銹病改良。譚華等[8]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，利用引物phi048對(duì)南方玉米銹病抗病材料進(jìn)行早代選擇是有效的，可淘汰大量感病家系，減輕田間工作量;利用分子標(biāo)記輔助定向選擇結(jié)合抗病接種鑒定，能有效改良溫帶種質(zhì)的抗銹性。

該研究為了利用分子標(biāo)記輔助玉米抗南方銹病育種，利用抗南方銹病玉米自交系K381和感病自交系LX9801構(gòu)建6個(gè)世代群體，對(duì)玉米南方銹病基因的連鎖標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步篩選。利用篩選的分子標(biāo)記對(duì)輔助抗南方銹病材料進(jìn)行前景選擇，結(jié)合田間鑒定驗(yàn)證分子標(biāo)記輔助選擇玉米抗南方銹病基因的選擇效果，以期為分子標(biāo)記輔助玉米抗南方銹病育種工作提供參考。

1?材料與方法

1.1?分離群體的構(gòu)建

田間試驗(yàn)于2016年冬在河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南三亞南濱基地進(jìn)行，室內(nèi)分析在新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

以抗南方銹病玉米自交系K381和感病自交系LX9801構(gòu)建6個(gè)世代群體，30個(gè)P1（K381）、30個(gè)P2（LX9801）、30個(gè)F1（K381×LX9801）、386個(gè)F2群體、284個(gè)B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]群體、198個(gè)B1CF1[（LX9801×K381）×K381]群體。

1.2?南方銹病接種方法

田間試驗(yàn)于2016年冬在河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南三亞南濱基地進(jìn)行，該地點(diǎn)為南方銹病高發(fā)區(qū)，在3～5片葉時(shí)人工接種1次，接種后3～5 d進(jìn)行人工噴水，促使病原菌早發(fā)。

1.3?分子標(biāo)記分析

采用2×CTAB法提取并純化DNA。參照已經(jīng)發(fā)表的玉米分子標(biāo)記連鎖圖，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道抗南方銹病基因位于第10號(hào)染色體上，從Maize GDB（http：//www.maizegdb.org）上選取玉米第10號(hào)染色體連鎖群上的50對(duì)標(biāo)記，利用抗感池進(jìn)行多態(tài)性篩選，對(duì)抗感池間有多態(tài)性的標(biāo)記再進(jìn)行分離群體的連鎖分析。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)總體積為20 μL，包括0.2 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物和20 ng模板DNA，加滅菌純水補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃40 s，60 ℃35 s，72 ℃45 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色過(guò)程在低速轉(zhuǎn)動(dòng)的水平搖床上進(jìn)行，方法為①10%乙醇+0.5%冰醋酸固定10～15 min;②0.2%硝酸銀滲透10～15 min;③用蒸餾水漂洗2次;④1.5%氫氧化鈉+0.4%甲醛顯色，直到顯出清晰條帶，終止顯色。結(jié)果照相分析。

1.4?抗感池分析

在父母本各取15株高抗、高感的DNA等量混合，組成DNA分析的抗、感基因池（Bulk R，Bulk S）。

2?結(jié)果與分析

2.1?分離群體的表現(xiàn)型

抗病指數(shù)按玉米南方銹病抗性全國(guó)統(tǒng)一記載，標(biāo)準(zhǔn)病級(jí)劃分見(jiàn)表1，6個(gè)世代群體抗性表現(xiàn)見(jiàn)表2，根據(jù)抗性表型鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)P1（K381）、F1、B2CF1 [（LX9801×K381）×K381]群體均表現(xiàn)高抗;F1代正反交抗性無(wú)明顯差異，說(shuō)明該抗性性狀受細(xì)胞質(zhì)遺傳影響小;F2分離群體386個(gè)，扣除臨界抗性無(wú)法分清等級(jí)的12個(gè)，其抗感表現(xiàn)明顯呈單峰偏態(tài)分布（圖1），抗、感株比例為283∶91，經(jīng)χ2檢驗(yàn)抗感株比例符合3∶1，B1CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群體284個(gè)，抗、感株比例（148∶129）接近1∶1，符合孟德?tīng)枂我伙@性基因分離規(guī)律，推測(cè)在該分離群體中南方銹病的抗性為單一顯性基因控制。

2.2?分子標(biāo)記連鎖分析

選取均勻分布在玉米10號(hào)染色體短臂上的50對(duì)標(biāo)記，通過(guò)抗感反應(yīng)池進(jìn)行多態(tài)性篩選（圖2），其中有5對(duì)引物存在多態(tài)性差異。

利用抗感池間有差異的5對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)F2分離群體、B2CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群體再進(jìn)行分離群體的標(biāo)記連鎖檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于第10號(hào)染色體的2對(duì)SSR標(biāo)記與抗病基因表現(xiàn)一定的連鎖關(guān)系（圖3、4），其中位于10.02區(qū)域內(nèi)的1對(duì)SSR標(biāo)記phi059與抗病基因緊密連鎖，通過(guò)檢測(cè)該標(biāo)記在F2分離群體分子標(biāo)記帶型（K381型、LX9801型）接近3∶1的分離比例;B1CF1[（K381×LX9801）×LX9801]群體標(biāo)記帶型（K381型、LX9801型）接近1∶1的分離比例。

3?小結(jié)

該研究通過(guò)對(duì)抗性材料K381/LX9801構(gòu)建的6個(gè)世代群體遺傳分析，F(xiàn)2代分離群體抗病株與感株比例符合3∶1，B2CF1 [（K381×LX9801）×LX9801]分離群體抗感株比例接近1∶1，推測(cè)其抗性基因?yàn)閱我伙@性基因控制的，利用F2代分離群體進(jìn)行SSR分子標(biāo)記連鎖分析，初步認(rèn)為材料K381的抗南方銹病基因與標(biāo)記umc2018和phi059緊密連鎖，其中phi059標(biāo)記與劉章雄等[3]以玉米南方型銹病免疫自交系 P25為材料獲得的研究結(jié)果一致。2個(gè)引物均位于第10號(hào)染色體的10.02區(qū)，所以初步推斷材料K381的抗南方銹病基因位于第10號(hào)染色體短臂上，這與陳翠霞等[5]2003年研究結(jié)果一致。

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