食品中嘌呤含量分布及其高效液相色譜檢測研究進展

李婷婷，任麗琨，王當(dāng)豐，勵建榮

（1.大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧大連 116600）（2.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州 121013）

嘌呤是一種生物堿，由一個嘧啶環(huán)和咪唑環(huán)稠合而成[1]，主要包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤及其衍生物。嘌呤在體內(nèi)不可或缺，它能形成嘌呤核苷酸進而構(gòu)成人體重要的遺傳物質(zhì)-核酸，此外嘌呤參與構(gòu)成能量物質(zhì)三磷酸腺苷（ATP）并以此形式參與機體的各種活動。尿酸是人體嘌呤代謝的終產(chǎn)物，人體血尿酸正常含量為200～410 μmol/L[2]，且男性偏高于女性。當(dāng)男性、女性體內(nèi)血尿酸含量分別超過420 μmol/L、357 μmol/L[3]時稱為高尿酸血癥(Hyperuricemia)，高尿酸血癥是痛風(fēng)的無癥狀表現(xiàn)形式，主要由人體嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄受阻引起[4]。人體內(nèi)嘌呤的獲取途徑主要有三種，即體內(nèi)合成、人體核酸分解及食物獲取[5]，其中食物獲取是外源獲取嘌呤的主要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，嘌呤廣泛存在于各類食品中，而痛風(fēng)的發(fā)生與攝入食品的種類及含量密切相關(guān)，現(xiàn)有研究顯示豆類、菌類、肉類、海產(chǎn)品和啤酒中都含有大量嘌呤，過多的攝入富含嘌呤的食物可顯著影響血尿酸水平，增加痛風(fēng)發(fā)病率[6]。

目前常用的嘌呤檢測法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法等，而嘌呤檢測中樣品前處理的方法主要是酸提取法和超聲提取法。目前國內(nèi)外并沒有建立統(tǒng)一、精確、高效的嘌呤檢測方法。此外，雖然國內(nèi)外對于食品中嘌呤含量的研究較多，但尚未有研究者對其進行歸納，從而不能便捷地為消費者提供健康、科學(xué)的飲食指導(dǎo)。因此本文對國內(nèi)外研究者已檢測出的部分食品中嘌呤含量的結(jié)果進行歸類總結(jié)，并對樣品前處理及嘌呤檢測方法進行分析，以期為確定準(zhǔn)確高效的嘌呤檢測技術(shù)提供借鑒，為預(yù)防痛風(fēng)、指導(dǎo)消費者選擇適合的食品提供依據(jù)。

1 食品中嘌呤含量

食物是人體攝取嘌呤的重要途徑之一。飲食中嘌呤的吸收量能夠顯著影響血尿酸水平，且與高尿酸血癥及痛風(fēng)發(fā)病密切相關(guān)。關(guān)寶生等[7]通過自行設(shè)計的調(diào)查表，對痛風(fēng)病例組及對照組進行問卷調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)良好的飲食習(xí)慣，合理的飲食結(jié)構(gòu)可有效的預(yù)防痛風(fēng)和高尿酸血癥的發(fā)生。但近年來隨著國民生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國痛風(fēng)發(fā)病率逐年升高。因此，痛風(fēng)病的防治尤為重要，目前痛風(fēng)治療的方法主要包括藥物治療和飲食治療，其中飲食治療是一種基礎(chǔ)治療方法，效果優(yōu)于藥物治療[8]。因此，消費者在日常生活中應(yīng)了解各種食品的嘌呤含量，改變膳食結(jié)構(gòu)，食用低嘌呤食物，積極降低自身體內(nèi)尿酸含量，從而減少痛風(fēng)和高尿酸血癥的發(fā)生。

1.1 動物源食品中嘌呤含量

不同食品中嘌呤含量不同，榮勝忠[9]對目前已測出的500種常見食物的嘌呤進行分析，發(fā)現(xiàn)動物源食品的嘌呤含量普遍高于植物源食品。且動物源食品中，內(nèi)臟、海鮮嘌呤含量高于肉及肉制品、血液及血制品的嘌呤含量。潘洪志[10]等利用高效液相色譜法對我國常見動物源食品中的嘌呤含量進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)動物肝臟和魚蝦蟹貝類含量最高，豬肝的總嘌呤值高達(dá)2752.00 mg/kg，與榮勝忠[9]結(jié)果一致。

表1為部分動物源食品嘌呤含量表。由表可知魚類嘌呤總量在100～170 mg/100 g之間，肉類產(chǎn)品嘌呤含量高于70 mg/100 g低于110 mg/100 g。動物內(nèi)臟中鵝肝、鴨肝和豬肝嘌呤含量較高。海膽嘌呤含量一般在150～200 mg/100 g之間，而表1中罐藏海膽總嘌呤值高達(dá)1568.50 mg/100 g，這可能是由于罐藏加工所導(dǎo)致的。此外，不同食品嘌呤含量差異較大，這與其遺傳差異以及生長環(huán)境有關(guān)。

部分研究者還對貯藏及加工過程中嘌呤的變化進行探究，Pi?eiro-Sotelo M等[11]對-18 ℃貯藏下的海膽中的四種嘌呤進行了測定，發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長鳥嘌呤逐漸減少，次黃嘌呤含量持續(xù)升高，黃嘌呤含量先增大后減小，這些變化可能與魚體死亡后自身腐敗產(chǎn)生的多種酶促使嘌呤降解及轉(zhuǎn)化有關(guān)。

王新宴[3]利用高效液相色譜法檢測了多種肉制品在水煮過程中嘌呤的變化情況，結(jié)果顯示水煮10 min時肉中的嘌呤含量急劇下降，湯中的嘌呤含量升高，此外在生肉、熟肉、及肉湯中次黃嘌呤含量始終最高。這是由于動物體內(nèi)的三磷酸腺苷在煮沸的過程中迅速降解為肌苷酸(IMP)，繼而降解為次黃嘌呤腺苷(HxR)和次黃嘌呤[12]，從而導(dǎo)致次黃嘌呤積累，含量升高。

表1 部分動物型食品中嘌呤含量Table 1 Purine content in some animal foods

1.2 植物源食品中嘌呤含量

植物源食品種類繁多，部分研究檢測所得的植物源食品嘌呤含量見表 2，由表可知，豆類、食用菌、啤酒和小麥等食品均含有較多嘌呤。過多的食用這些食品將會導(dǎo)致人體血尿酸水平升高繼而提高罹患痛風(fēng)的風(fēng)險。因此在日常膳食中應(yīng)合理搭配動物源、植物源食品，降低體內(nèi)血尿酸含量，減少痛風(fēng)的發(fā)生。

1.2.1 豆類食品中嘌呤含量

豆類食品營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特，常食用豆類制品可減少人體脂肪含量，增加免疫力。但由于其高嘌呤值，限制了痛風(fēng)病人的食用。劉少林[17]通過高效液相色譜法測定了大豆中四種嘌呤的含量，結(jié)果顯示四種嘌呤中大豆以腺嘌呤和鳥嘌呤為主，含量分別為0.73及0.82 mg/g。崔素萍等[5]利用超聲波輔助技術(shù)，以脫脂豆粕為原料，研制出了嘌呤含量為123.50 mg/100 g的低嘌呤脫脂豆粕粉。李慧慧[4]對豆?jié){分別采用吸附、鹽析、吸附-鹽析、鹽析-吸附等前處理方法，發(fā)現(xiàn)鹽析-吸附法可有效地脫除嘌呤，脫除率高達(dá)59.7%，繼而研發(fā)了低嘌呤豆?jié){，供痛風(fēng)患者食用。這些研究的成功為開發(fā)低嘌呤食品提供了切實可行的理論依據(jù)。

1.2.2 食用菌中嘌呤含量

總之，基于碳氟鍵斷裂或活化的硼化反應(yīng)作為新的氟化學(xué)和硼化學(xué)的交叉研究領(lǐng)域正日益引起人們的關(guān)注，新反應(yīng)、新方法也層出不窮。我們相信將碳氟鍵的惰性與硼酯基團強大的反應(yīng)能力相結(jié)合，一定會為藥物的后階段修飾策略 (the late-stage drug modification) 提供強有力工具。鈀或鐵催化的芳基氟的硼化反應(yīng)[12]發(fā)表在Organic Letters, 2018, 20, 5564上，銅催化的偕二氟烯烴的硼化反應(yīng)[14]發(fā)表在Organic Letters, 2017, 19, 3283上。該兩項工作得到了國家自然科學(xué)基金和中國科學(xué)院有機氟化學(xué)重點實驗室開放課題的支持。

菌類食品具有良好的食用和藥用價值，是素食主義者重要的的營養(yǎng)來源。食用菌中的嘌呤含量相對較高。在痛風(fēng)患者參考食譜中，被視為需限量食用的食品[18]。劉桂英等[19]檢測了香菇、金針菇、銀耳、平菇、木耳及茶樹菇中的嘌呤含量，結(jié)果顯示，不同菌中嘌呤含量差異較大，其中香菇總嘌呤含量高達(dá) 323.70 mg/100 g。此外鳥嘌呤和腺嘌呤在以上檢測的六種菌類食品中的含量均較高，這與陳月菊等[20]的研究結(jié)果一致。榮勝忠等[21]對不同種類鮮菌和干菌的嘌呤含量進行了比對，發(fā)現(xiàn)干菌中的嘌呤含量在681.00～4049.20 mg/kg之間，鮮菌中的嘌呤含量則在213.80～730.30 mg/kg之間。干菌中嘌呤含量明顯高于鮮菌，從而推測嘌呤含量與食品含水量密切相關(guān)。

1.2.3 飲品中的嘌呤含量

飲品是指經(jīng)加工制造形成的適于供人體飲用的液體，具有一定的營養(yǎng)價值。Kaneko等[22]以150 mmol/L（pH=2.5～2.8）磷酸鈉緩沖溶液為流動相，設(shè)置流速0.6 mL/min、柱溫35 ℃，成功檢測出部分常見飲品中的嘌呤含量，其中普通啤酒嘌呤含量較高為225.0～580.2 mol/L，威士忌 8 μmol/L、白蘭地 26.4 μmol/L、日本燒酒1.3 μmol/L、酸奶和牛奶嘌呤的含量小于5.2 mg/100 g，除啤酒外均屬于嘌呤含量極低的飲品，痛風(fēng)病人可放心食用。謝芳?xì)J[23]對國內(nèi)購買的啤酒、牛奶、果汁、碳酸飲料和礦泉水中的嘌呤含量進行測定，測定結(jié)果與 Kaneko結(jié)果一致，除啤酒中嘌呤含量較高外，其余飲品中的嘌呤含量均較低，可放心飲用。眾多研究表明，啤酒中嘌呤含量較高，但其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費喜愛，素有“液體面包”的美譽[24]。工業(yè)生產(chǎn)中啤酒主要以麥芽為原料經(jīng)酵母發(fā)酵制得，麥芽發(fā)芽時核酸大量生成，發(fā)芽后期及啤酒生產(chǎn)過程中核酸酶會促使核酸分解，在糖化過程中繼而降解生成大分子嘌呤物質(zhì)[25]，致使啤酒中嘌呤含量升高。研究表明，大量飲用啤酒后，人體尿酸水平顯著升高，嚴(yán)重者將導(dǎo)致高尿酸血癥。因此很多學(xué)者在測定啤酒中嘌呤含量的同時積極呼吁改進啤酒生產(chǎn)工藝，降低啤酒中嘌呤含量，生產(chǎn)低嘌呤啤酒。李惠萍等[26]通過增加小麥芽在生產(chǎn)原料中的比例，采用高濃度釀造后稀釋的工藝，釀造出嘌呤含量低于18 mg/L的啤酒。此外在啤酒生產(chǎn)的同時使用活性炭對其進行吸附操作，發(fā)現(xiàn)嘌呤含量降低了50%，但吸附作用同時顯著降低了啤酒原有的口感及風(fēng)味。商曰玲等[27]使用反相色譜法檢測了 14種啤酒的游離嘌呤和總嘌呤含量，并且分析了嘌呤含量與啤酒常規(guī)指標(biāo)間的相關(guān)性，結(jié)果顯示 14種啤酒中的游離嘌呤含量為7.11～24.93 mg/L，總嘌呤含量為28.65～79.35 mg/L，游離嘌呤含量與酒精度、色度及總酸度密切相關(guān)，而總嘌呤含量與各指標(biāo)間的相關(guān)性不大。

1.2.4 其他植物源食品嘌呤含量

除以上幾種植物源食品外，劉春鳳等[28]經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，不同品種小麥中嘌呤含量具有較大差異，且小麥中的游離嘌呤堿主要是次黃嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá) 90%以上。曲欣[14]等以水-甲醇-冰乙酸-10%四丁基氫氧化銨（V/V/V/V，879/100/15/6）為流動相，經(jīng)Agilent XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5.0μm）對菠菜、海帶、豆腐和蘋果等非動物型食品的嘌呤進行檢測，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘋果中并未檢測出任何嘌呤成分，可視為痛風(fēng)病人的理想食品。而豆腐中嘌呤含量(329.35 mg/kg)高于本實驗中測定的其他植物源食品，因此在痛風(fēng)病人日常飲食中應(yīng)注意其攝入量。

2 樣品處理及檢測方法

目前眾多食品的嘌呤含量數(shù)據(jù)尚不完整，因此需要對其進行補充和完善?，F(xiàn)有的嘌呤檢測方法主要有高效液相色譜法[31]、氣相色譜法[32]、毛細(xì)管電泳法[33]和離子對交換法[34]等，此外胡奇杰等[35]通過重氮化反應(yīng)及黃嘌呤氧化酶將四種嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸，通過測定尿酸含量確定總嘌呤值。在以上幾種方法中高效液相色譜法是近幾年來使用最廣泛的檢測方法，其具有高效、快速和高靈敏度等[36]優(yōu)點，能夠?qū)κ称分械泥堰屎窟M行快速且準(zhǔn)確的檢測。但由于樣品種類、樣品前處理方法、流動相、色譜柱、柱溫和流速等眾多因素能夠顯著影響高效液相色譜法的檢測結(jié)果，故目前尚未建立統(tǒng)一的檢測方法。因此本文從樣品前處理及檢測方法兩方面，對現(xiàn)有嘌呤檢測方法進行比對，以期為日后使用高效液相色譜法檢測嘌呤提供借鑒。

2.1 樣品前處理方法

嘌呤主要存在于核酸中，因此嘌呤檢測的第一步是將核酸中的嘌呤進行提取?，F(xiàn)有的嘌呤提取方法主要有酸提取法，超聲提取法等。不同的提取方法對樣品嘌呤提取率影響不同。研究者從多方面對樣品前處理方法進行探究，力求獲取最有效的嘌呤提取方法。

2.1.1 酸提取法

冷酸提取法常用于游離嘌呤的提取[37]，而總嘌呤的提取一般使用熱酸。酸的種類及其用量均對嘌呤提取結(jié)果有顯著影響。三氟乙酸及高氯酸是目前嘌呤酸提取法中最常用的兩種酸，此外，部分研究者對硫酸、磷酸、乙酸等[38,39]的水解效果進行了探究，發(fā)現(xiàn)在色譜分析中高氯酸的效果優(yōu)于其它酸提取，這是由于進行樣品水解的高氯酸可以用鉀鹽冰浴除去，即使高氯酸少量溶解也不會對色譜分析造成干擾[40]。但高濃度的高氯酸會使嘌呤降解回收率降低，Kaneko K[8]采用高氯酸處理樣品，黃嘌呤加標(biāo)回收率僅為 87.4%。此外高氯酸在消化過程中會產(chǎn)生大量有毒氣體[41]，造成污染。因此在色譜分析中，高氯酸效果雖好，但應(yīng)盡量避免使用。尤玉如等[42]通過高效液相色譜法檢測啤酒中的嘌呤含量，使用不同的酸對樣品進行處理。發(fā)現(xiàn)使用三氟乙酸與甲酸（1:1）混合液可高效的提取食品中的嘌呤物質(zhì)，樣品加標(biāo)回收率在99.41%～101.31%之間嘌呤損失較小。單獨使用高氯酸效果較優(yōu)但無法使鳥嘌呤與雜峰分離，從而導(dǎo)致其損失較大。乙酸的單獨使用不能將嘌呤完全提取，只能水解出樣品中少量的腺嘌呤、鳥嘌呤和次黃嘌呤且水解度不高，鹽酸雖然能水解出四種嘌呤，但嘌呤檢測量小于三氟乙酸和甲酸的混合液對樣品的水解結(jié)果，這可能是由于鹽酸對嘌呤沒有保護作用。因此最終選擇三氟乙酸與甲酸（1:1）混合液作為最佳嘌呤提取條件。實驗結(jié)果與曲欣等[43]的樣品前處理條件優(yōu)化結(jié)果相同。Havlik J等[44]使用三氟乙酸與甲酸（1:1）混合液作為嘌呤提取液，較好地分離了四種嘌呤并檢測了部分常見素肉食品中的嘌呤含量，此外呂兵兵[13]和凌云[16]等使用 V（三氟乙酸）:V（甲酸）:V（水）=5:5:1的混合溶液對帶魚糜及肉類樣品進行水解，發(fā)現(xiàn)水解效果亦較優(yōu)，嘌呤損失率小，四種嘌呤加標(biāo)回收率均高于91.5%。

2.1.2 超聲提取法

超聲波具有機械效應(yīng)、空化效應(yīng)等，可增大分子間的運動速度及介質(zhì)的穿透力，因此常被用于提取生物堿等成分。不同的樣品固液比及超聲時間對嘌呤提取率都有一定的影響。程慶紅等[45]利用超聲法對貽貝水溶液中的嘌呤進行提取，并探究了其最佳提取條件。結(jié)果顯示當(dāng)料液質(zhì)量比為80:1，提取時間為150 min時嘌呤提取效果最佳，其總提取率達(dá)到1.68 mg/g。但曲欣[43]和陳月菊等[20]認(rèn)為超聲提取雖然設(shè)備簡單、操作方便但不能將樣品中的嘌呤物質(zhì)提取完全，而僅能提取游離嘌呤，因此只能作為樣品前處理的一種輔助手段。劉秀艷等[46]采用稀乙醇浸提地龍粉末并以超聲作為輔助手段，最終得到次黃嘌呤的平均回收率為100.3%，RSD=1.9%。實驗表明該方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定。

2.2 嘌呤檢測方法

高效液相色譜法是目前最常用的嘌呤檢測方法，但由于不同樣品間性質(zhì)差異較大，因此沒有較為統(tǒng)一的檢測方法。研究者對不同樣品的嘌呤檢測色譜條件進行探究，從色譜柱、流動相、柱溫和流速等多方面對條件進行優(yōu)化，力求探尋最優(yōu)的嘌呤高效液相檢測方法。表3為部分樣品檢測色譜條件。表中實驗方法所得相關(guān)系數(shù)及精密度均符合分析檢測實驗要求。其中使用Ultimate AQ-C18色譜柱、以四丁基氫氧化銨:冰乙酸:水（1.5/1.5/997）:10%甲醇為流動相時樣品精密度最好，達(dá)到0.5%。但在樣品檢測中最終色譜條件的確定，需根據(jù)所檢測樣品及檢測時的具體情況而定。因此本文對色譜柱、流動相等色譜條件的選擇進行分析，以期指導(dǎo)研究者合理的選擇色譜條件，準(zhǔn)確、高效的檢測食品中嘌呤含量。

2.2.1 色譜柱的選擇

嘌呤檢測通常使用C18色譜柱作為固定相，且不同型號的C18色譜柱分別有其相適應(yīng)的色譜條件。宋學(xué)英[50]采用兩種C18色譜柱（Agilent SB-C18、Waters SymmetryShield RPC18）分離 ATP、ADP、AMP，發(fā)現(xiàn)結(jié)果差異較大，因此得出采用不同廠家或相同廠家不同系列的色譜柱分析樣品時對色譜峰保留時間及分離度都有較大影響。曲欣[14]與凌云[16]同樣使用C18色譜柱，且在相同的流動相磷酸二氫鉀（0.02 mol/L、pH=3.8）及其他色譜條件下分離嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲備液，結(jié)果存在明顯差異。凌云使用上訴條件成功使四種嘌呤基線分離、峰型較好，而曲欣得到的標(biāo)準(zhǔn)儲備液色譜圖中，腺嘌呤和鳥嘌呤出現(xiàn)分峰，無法進行后續(xù)樣品檢測實驗。推測可能是由于曲欣實驗中使用的色譜柱為Agilent XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），而凌云在檢測過程中使用的是Waters-Atlantis dC18柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）。Agilent XDB-C18與Waters-Atlantis dC18色譜柱均為硅膠填料色譜柱，但前者主要采用三種不同類型的多孔硅膠微球，利用辛基硅烷化學(xué)鍵合到全多孔硅膠顆粒、降低碳載量并使用雙封端技術(shù)將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來，可以高效、準(zhǔn)確的檢測極性物質(zhì)。后者采用高純度硅膠及雙鍵鍵結(jié)合 C18技術(shù)，填料密度低，親水相。嘌呤具有極性，當(dāng)使用的流動相中水的比重較大時建議使用親水相的C18色譜柱，其保留極性化合的能力較強[51]。當(dāng)向流動相中加入庚烷磺酸鈉、四丁基氫氧化銨等離子對試劑時C18會與其結(jié)合形成帶電的基團，親水相的色譜柱與離子對試劑結(jié)合能力不如普通色譜柱[52]，致使極性物質(zhì)分離效果不佳。色譜柱的選擇與流動相及其他色譜條件密切相關(guān)，因此，選擇適宜的色譜柱，是高效、準(zhǔn)確測定嘌呤含量的關(guān)鍵步驟。

表3 嘌呤高效液相檢測方法選擇Table 3 Selection of high performance liquid phase detection method for purine

2.2.2 流動相的選擇

選擇正確的流動相可以有效地改善分離效果，提高嘌呤檢測準(zhǔn)確性。呂兵兵[13]、劉鎮(zhèn)[1]、鐘寧[29]和毛玉濤等[53]采用不同pH的0.02 mol/L KH2PO4作為流動相測定了多種食品中的嘌呤含量，均獲得較好的試驗結(jié)果。食品中的四種嘌呤均屬于弱堿性物質(zhì)，性質(zhì)相對穩(wěn)定而C18色譜柱為硅膠柱其硅羥基的pKa范圍為3.5～4.5，硅羥基會吸引堿性化合物導(dǎo)拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生[4]，因此設(shè)定適宜的pH值可以保持嘌呤活性，幫助嘌呤從固定相中分離[54]，提高檢測準(zhǔn)確度。此外四種嘌呤中鳥嘌呤和腺嘌呤的pKb值為3.20和4.15，改變流動相pH對嘌呤的分離影響顯著。劉少林[17]配制pH分別為3.0、3.4、3.8、4.0、4.6的0.02 mol/L KH2PO4溶液，考察其對四種嘌呤的分離效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用Waters Atlantis dRPC18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）色譜柱，在流速0.6 mL/min，柱溫25 ℃的色譜條件下，流動相pH為4.60時可使分離效果最優(yōu)。同樣毛玉濤[53]等對0.02 mol/L KH2PO4的最佳pH值進行了探究，最終選擇在pH=3的條件下對嘌呤進行沖洗。

此外，楊祥根[30]、王靜瑩等[15]將KH2PO4的濃度減小至 0.007 mol/L，Havlik J[44]采用 0.05 mol/L的KH2PO4，均可較好的分離四種嘌呤，這表明使用KH2PO4作為流動相時其濃度和pH要根據(jù)樣品種類和試驗條件進行選擇。曲欣[14]等采用水-甲醇-冰乙酸-10%四丁基氫氧化銨（V/V/V/V=879/100/15/6）作為流動相成功使腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤基線分離。其中四丁基氫氧化銨可以與嘌呤生成中性離子，增強與非極性相的作用，改善分離效果[25]。冰乙酸用于調(diào)節(jié)流動相pH，甲醇可以提高分離率，改變流動相間的相互作用。崔素萍等[5]將四丁基氫氧化銨、冰醋酸及超純水按1.5:1.5:997體積配制，然后與甲醇按體積比 99:1混合。最終測定結(jié)果的精密度 RSD小于0.50%。

除以上兩種流動相外，程慶紅[48]等以甲醇:水（5:95），謝芳?xì)J等[23]使用 10 mmol/L甲酸銨(pH=3.45)-甲醇（V/V=99:1），Inazawa K[55]等采用 150 mmol Na3PO4-H3PO4（pH=2.5）為流動相時，都可以使四種嘌呤分離且峰型較優(yōu)?？傮w來說，在嘌呤高效液相色譜檢測實驗中常用的流動相為磷酸二氫鉀。使用磷酸二氫鉀作為流動相時，其步驟繁瑣需要尋找適宜的pH值，四種嘌呤峰保留時間較長，較為耗時且鹽溶液會腐蝕色譜柱降低色譜柱使用壽命[51]。因此建議使用含離子對試劑的溶液作為流動相，可以避免調(diào)節(jié)pH的繁瑣步驟，縮短檢測時間，減少鹽溶液對色譜柱腐蝕的危險。

2.2.3 其他色譜條件的選擇

當(dāng)溫度過高時，腺嘌呤和黃嘌呤易分解，這會對嘌呤含量檢測結(jié)果造成不良影響。程慶紅[48]等在保持其他色譜條件不變的情況下，改變柱溫參數(shù)，發(fā)現(xiàn)溫度對腺嘌呤和黃嘌呤的檢測結(jié)果影響較大，而對次黃嘌呤的檢測結(jié)果幾乎沒有影響。目前，大多數(shù)研究者選用柱溫于25～30 ℃之間進行嘌呤檢測。高效液相色譜分析中流速一般在0～2 mL/min之間，研究表明流動相在高流速下，柱效較高且不易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，但較高的流速同樣會使柱壓增大，縮短色譜柱的使用壽命，甚至?xí)斐缮V柱塌陷損壞色譜柱。因此在嘌呤測定中多設(shè)定流速為 0～1 mL/min。程慶紅[48]等在200～300 nm波長范圍內(nèi)對腺嘌呤、黃嘌呤及次黃嘌呤進行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)三種嘌呤紫外最大吸收波長在254～277之間。目前，大多研究者均使用254 nm作為檢測波長，而 Pi?eiro-Sotelo M[11]、Inazawa K[55]等分別在255、260 nm紫外波長下對食品中的嘌呤進行檢測，檢測結(jié)果差異并不顯著。因此推測波長對嘌呤檢測結(jié)果影響不大，保證在254～277 nm之間即可。

3 總結(jié)

目前，嘌呤樣品前處理及高效液相色譜法檢測沒有統(tǒng)一的方法，因此同一食品檢測得到的結(jié)果也不盡相同。通過比較發(fā)現(xiàn)，在樣品前處理中使用三氟乙酸和甲酸混合液對嘌呤的提取效果優(yōu)于其他提取液，樣品回收率可達(dá) 99.41%～101.31%。液相檢測中常采用KH2PO4作為流動相，但其濃度和pH要根據(jù)檢測樣品種類及其他實驗條件確定，步驟繁瑣、耗時。建議使用含離子對試劑的溶液作為流動相，可以避免調(diào)節(jié)pH的繁瑣步驟，節(jié)省時間。色譜柱應(yīng)根據(jù)選定的流動相成分中水相比例進行選擇，當(dāng)水相比例過大時，建議選擇親水相色譜柱提高分離效率。溫度可以影響嘌呤的穩(wěn)定性因此檢測柱溫常設(shè)定在25～30 ℃之間。高流速會縮短檢測時間減少拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生但會對色譜柱造成一定的損害，建議流速設(shè)定在0～1 mL/min。現(xiàn)有檢測方法種類繁多，但大多需要調(diào)節(jié)pH或流動相配比，較為繁瑣。樣品前處理多使用高氯酸和三氟乙酸，具有揮發(fā)性對環(huán)境及人體呼吸道危害較大，因此在現(xiàn)有實驗方法的基礎(chǔ)上，探尋出更為簡便、環(huán)保的方法仍需進一步研究，同時，了解各種食品的嘌呤底值，掌握其在不同生產(chǎn)加方式中的變化規(guī)律。從而幫助痛風(fēng)患者合理飲食，為痛風(fēng)病的防治提供科學(xué)指導(dǎo)，也是未來需要深入探究的主要方向。

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