響應面法優(yōu)化鏈霉菌LG—9發(fā)酵條件及對棉花黃萎病菌的抑菌作用

陳明 穆凱熱姆·阿卜來提 劉政 王曉東

摘要：為提高鏈霉菌菌株LG-9發(fā)酵液的抑菌活性，在單因素試驗的基礎上，利用Minitab軟件中的Plackett-Burman設計和響應面分析，以發(fā)酵液對棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）的抑菌圈大小為響應值，對鏈霉菌LG-9的液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結果表明，菌株LG-9的最佳發(fā)酵條件為250 mL三角瓶裝樣量101.19 mL、培養(yǎng)基初始pH 7.2、接種量7.5%、溫度31.32 ℃、轉速160 r/min和搖培時間69.02 h。在此條件下的抑菌圈直徑大小為22.45 mm，較未優(yōu)化前提高10.43%。

關鍵詞：棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）；鏈霉菌；響應面分析；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號：TQ920.1；S435.621 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）08-0071-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.019

Optimization of Fermentation Conditions for Anti-streptomyces LG-9 Using Response Surface Methodology and Its Inhibiton on Verticillium dahliae

CHEN Ming1，MUKARAM Ablat1，LIU Zheng2，WANG Xiao-dong1

（1.College of Agronomy，Shihezi University/Key Laboratory of Oasis Crop Disease Prevention and Control，Shihezi 832000，Xinjiang，China；

2.Institute of Plant Protection，Shihezi Academy of Agricultural Sciences，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

Abstract： In order to improve the antibacterial activity of Streptomyces isolate LG-9，on the basis of single factor test，using the Plackett-Burman experiment design and response surface analysis of Minitab software，with the inhibition circle size of the fermentation broth on Verticillium dahliae as the response value，and the liquid fermentation condition of Streptomyces LG-9 were optimized. The results showed that the optimal fermentation conditions of the strains LG-9 were loading volume of liquid medium 101.19 mL in 250 mL triangle bottle，pH 7.2，inoculation amount of 7.5%，temperature 31.32 ℃，rotate 160 r/min，time 69.02 h. The diameter of the inhibition zone under these conditions was 22.45 mm，which was 10.43% higher than that before optimization.

Key words： Verticillium dahliae； streptomyces； response surface analysis； optimization of fermentation conditions

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起的土傳維管束病害，病原菌寄主范圍廣、危害重且缺乏有效的防治手段，被稱為棉花的“癌癥”。利用拮抗微生物來防治棉花黃萎病已經成為該領域的研究熱點[1]?！耙跃尉钡纳锓乐螌Νh(huán)境友好，無殘留，作物不易產生抗藥性，有些生防微生物還能促進農作物的生長。目前，防治棉花黃萎病報道最多的生防微生物有細菌[2，3]、真菌[4，5]和放線菌[6-8]。其中，放線菌是一類數量大、種類多、具有重要實用價值和開發(fā)潛力的微生物資源，是非常重要的生物活性物質的來源，迄今從微生物中發(fā)現的大約12 000多種生理活性物質中，有近2/3是放線菌產生的[9]，其中鏈霉菌是產生活性物質的主要菌屬，約占總數的一半。在放線菌的生防利用中，通過液體發(fā)酵，產生次級代謝產物是最常見的。由于不同微生物的生理生化特性不同，所需要的營養(yǎng)物質和環(huán)境條件也不相同。因此，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的種類、合理的濃度配比及適宜培養(yǎng)條件的優(yōu)化對微生物正常生長及目標代謝物質的產生起著關鍵性的作用。發(fā)酵條件的優(yōu)化在微生物發(fā)酵產業(yè)中占舉足輕重的地位，是微生物產品從實驗室到工業(yè)生產轉化的必要環(huán)節(jié)。

響應面法（Response Surface Methodology，RSM）是由Box和Wilson在1950年最早提出來的用于獲得最優(yōu)試驗條件的方法，是數學方法和統(tǒng)計方法結合的產物，最初應用在化學和化學工程領域[10]，隨后，RSM也被廣泛應用于生物學，研究反應混合物中各反應成分所占比例與其生物學活性之間的關系，確定生物材料的最優(yōu)試驗條件[11]。

石河子大學農學院植物病理實驗室篩選出一株對棉花黃萎病原菌有顯著抑菌效果的鏈霉菌菌株LG-9，利用常規(guī)基礎培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在培養(yǎng)條件單因子優(yōu)化試驗的基礎上，采用Plackett-Burmam設計[12]、最陡爬坡路徑實驗[13]和響應面分析法中的Box-Behnken設計[14]相結合對鏈霉菌LG-9菌株液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以提高發(fā)酵液的抑菌活性，為后續(xù)LG-9發(fā)酵液有效抑菌組分的鑒定及田間防效試驗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 鏈霉菌菌株LG-9分離自新疆棉田根際土壤，經過平板對峙，證明該菌株對棉花黃萎病菌具有顯著拮抗活性，將該菌株接種于高氏一號斜面培養(yǎng)基，4 ℃保存。棉花黃萎病菌菌株301-3由石河子大學農學院植物病理實驗室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 基礎培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO3 1 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂粉15 g、去離子水1 000 mL，pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：小米10.0 g、葡萄糖10.0 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 2.5 g、CaCO3 2.5 g、去離子水1 000 mL，pH 7.2。

馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）和馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)液（PDB）、高氏一號培養(yǎng)基參考方中達[15]描述的方法制備。以上培養(yǎng)基均121 ℃滅菌30 min后備用。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株活化與種子液的制備 將冷藏菌株LG-9接種于高氏一號培養(yǎng)基上，28 ℃活化4 d，挑取菌絲塊接種于裝有100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，160 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d。

1.2.2 發(fā)酵粗提液的制備 鏈霉菌菌株LG-9在Plackett-Burman試驗、最陡爬坡路徑試驗和優(yōu)化驗證試驗中獲得發(fā)酵液，經10 000 r/min離心20 min，取其上清液經無菌微孔濾膜（孔徑0.45 μm）過濾，過濾液為發(fā)酵粗提液，并保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 發(fā)酵粗提液抑菌活性測定 采用瓊脂擴散法[16]進行抑菌活性測定。供試棉花黃萎病菌菌株301-3經活化后，挑取生長良好的菌絲塊，接種于PDB中，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d后，用4層無菌紗布過濾，配制成1×107 CFU/mL孢子懸浮液，吸取100 μL孢子懸浮液涂布于PDA平板上，晾干表面后，用無菌打孔器（5 mm）進行打孔，每皿均勻分布3個孔，將不同處理的發(fā)酵粗提液注入孔中，每孔100 μL。28 ℃下培養(yǎng)3 d后，觀察其抑菌情況，并采用十字交叉法測量和記錄抑菌圈直徑。

1.3 試驗設計

1.3.1 單因素選擇 利用基礎培養(yǎng)液，選擇發(fā)酵時間、轉速、接種量、溫度、裝樣量以及pH對LG-9發(fā)酵液抑菌活性的影響作為Plackett-Burman試驗的因子。

1.3.2 Plackett-Burman試驗設計 在Plackett-Burmam試驗設計（PB設計）中，每個因子取2個水平，以-1和1編碼，低水平為原始培養(yǎng)條件，高水平約取低水平的1.25倍。設置6個主效因子和3個空項因子，試驗次數N=12的Plackett-Burmam試驗設計，以C、F、I作為空項以估計試驗誤差，A、B、D、E、G、H分別代表時間（h）、轉速（r/min）、接種量（%）、溫度（℃）、裝樣量（mL/250 mL）和pH。具體試驗設計見表1。

1.3.3 最陡爬坡路徑試驗設計 根據Plackett-Burman設計結果的評價效應，確定重要因子的最適范圍。以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，其他因子根據效應系數的正負來確定，正系數選取較高值，負系數選取較低值[17]，同時測定不同處理發(fā)酵液粗提液的抑菌活性，確定關鍵因子的最優(yōu)范圍。

1.3.4 Box-Behnken試驗設計 以最陡爬坡試驗設計的結果確定3個關鍵因素的最適范圍，以250 mL三角瓶裝樣量100 mL，接種量7.5%，溫度28 ℃為中心點進行Box-Behnken設計，設計3因子3水平的響應面分析試驗，中心點設置3次重復，用Minitab16軟件對試驗結果進行二次多項擬合，求得最優(yōu)值，最后依據回歸方程繪制響應面分析圖。

1.3.5 驗證試驗 用最佳培養(yǎng)條件進行3次平行試驗，取平均值，以驗證模型是否可靠，進而得出最終優(yōu)化結果。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗

由表2、表3可知，對菌株LG-9發(fā)酵粗提液抑菌活性具有明顯影響的因子表現為E>A>G，即溫度>時間>裝樣量，它們的P分別為0.032、0.051和0.053，均對發(fā)酵粗提液抑菌活性的影響大于90%，因此選擇這3個因素作為下一步試驗的關鍵因素。

2.2 最陡爬坡試驗

溫度、時間和裝樣量是影響發(fā)酵粗提液抑菌活性的關鍵因素，其中溫度對抑菌活性是負效應，應依次減小，時間和裝樣量對抑菌活性是正效應，應依次增大。由表4可知，隨著溫度的減小、時間和裝樣量的增加，抑菌活性呈現先增大后減小的趨勢，當溫度為31 ℃，時間為72 h，250 mL三角瓶裝樣量為100 mL時，抑菌活性最大，為3個因素的最大響應值區(qū)域，因此，以此為中心點進行響應面設計。

2.3 Box-Behnken試驗

確定3個關鍵因子的最適范圍后，以溫度31 ℃，時間72 h，250 mL三角瓶裝樣量100 mL為中心點進行響應面分析，各變量水平見表5，Box-Behnken設計3因子3水平的響應面分析試驗，中心點設置3次重復，試驗設計和結果見表6、表7。

用Minitab16軟件對數據進行回歸分析，得出模型回歸方程：

Y=-456.228+2.325 40X1+22.106 0X2+0.444 977

X3-0.010 140 7X12-0.351 667X22-0.004 272 12X32-

0.006 333 33X1X2-0.001 083 33X1X3+0.008 125 00X2X3。

從表7可以看出，模型平方的影響是顯著的，線性和交互作用的影響不顯著。二次模型多元相關性系數R2=0.939 5，R2調整值為0.830 5，P（Prob>F）=0.014，表明該模型是顯著的，回歸模型失擬項P=0.119>0.05，說明模型擬合程度較好且失擬不顯著，模型穩(wěn)定，預測值與實際值間具有高度的相關性，能進行較好地預測。

根據上述擬合回歸方程，利用軟件繪制響應面及等高線（圖1、圖2、圖3）。從圖1、圖2、圖3可以看出，裝樣量、溫度、時間三者存在顯著的相關性。由圖1可知，當發(fā)酵時間固定為最優(yōu)69.02 h，溫度固定在某一水平，裝樣量在85～115 mL時，發(fā)酵液抑菌圈呈現先增大后減小的趨勢；由圖2可知，當溫度固定為最優(yōu)31.32 ℃，裝樣量固定在某一水平，發(fā)酵時間在54～90 h時，發(fā)酵液抑菌圈呈現先增大后減小的趨勢；圖3顯示，當裝樣量固定為最優(yōu)101.19 mL，時間固定在某一水平，溫度固定在29～33 ℃時，發(fā)酵液抑菌圈呈現先增大后減小的趨勢，曲面的頂點即為最大抑菌圈值點。

2.4 最優(yōu)條件驗證

由以上模型得出，當250 mL三角瓶裝樣量為101.19 mL、溫度為31.32 ℃、轉速160 r/min、接種量7.5%、初始培養(yǎng)液pH 7.2、搖菌培養(yǎng)時間為69.02 h時，預測的抑菌圈直徑最大響應值為22.93 mm。在此條件下對預測結果進行驗證，試驗重復3次，抑菌圈直徑分別為22.25、22.42、22.67 mm，平均值為22.45 mm，與預測值接近，證實了模型的有效性。

3 小結與討論

微生物發(fā)酵產品實現工業(yè)化的重要環(huán)節(jié)之一是培養(yǎng)條件的優(yōu)化。通過改進發(fā)酵條件，可以促進發(fā)酵過程朝著提高目的產物的方向進行，縮短發(fā)酵周期，降低發(fā)酵成本，使投入產出比達到最小，以利于工業(yè)化生產[18，19]。本研究通過PB試驗設計，從6個影響鏈霉菌LG-9發(fā)酵液抑菌活性的因素中確定3個明顯影響因素為溫度、時間和裝樣量，后利用最陡爬坡法和Box-Behnken設計得出菌株LG-9最佳液體發(fā)酵條件為250 mL三角瓶裝樣量101.19 mL、pH 7.2、接種量7.5%、溫度31.32 ℃、轉速160 r/min、搖菌培養(yǎng)69.02 h，在此條件下的抑菌圈直徑為22.93 mm，且由回歸方程得到的最大預測值與驗證值非常接近，說明回歸方程能較真實地反映實際情況，因此，用響應面法優(yōu)化LG-9發(fā)酵條件是有效可行的。

拮抗微生物發(fā)酵液的抑菌活性與代謝產物的產量是密切相關的，不同發(fā)酵條件可顯著影響代謝產物的產量，進而影響其抑菌活性，表現為抑菌圈直徑和面積的大小等[20，21]。在試驗中，對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化是提高抑菌活性的有效手段。微生物培養(yǎng)優(yōu)化常用的方法有單因素和正交試驗，單因素試驗只是考察某一影響因素在一定范圍內對目標值的影響，不考慮多個影響因素間的交互作用，進而難以獲得最優(yōu)結果[22]。正交試驗能得到最佳因素水平的組合，同時考慮多種因素間的交互作用，但會增加試驗次數，且對于不顯著因素的選取一般是憑經驗。液體發(fā)酵是一個復雜的生物過程，各因素對目標值的影響可能不是簡單的線性關系。響應面分析法是一種綜合試驗設計和數學建模的優(yōu)化方法，可考察影響因素之間的交互作用，并有效減少試驗次數。同時，響應面法還克服了正交試驗不能給出直觀圖形的缺陷，可直接通過回歸方程模型得出顯著因素間交互作用的三維立體響應曲面和等高線圖，直觀反映影響因子的影響趨勢[23]。目前，RSM被廣泛應用于微生物發(fā)酵的優(yōu)化篩選中[24-27]。鄭虹等[28]優(yōu)化鏈霉菌D-8菌株發(fā)酵工藝，使抑菌圈直徑較優(yōu)化前提高了2.21倍。本試驗在通過RSM獲取的優(yōu)化發(fā)酵條件下，使菌株LG-9發(fā)酵粗提液的抑菌圈直徑為22.45 mm，未優(yōu)化發(fā)酵條件下，抑菌圈直徑為20.33 mm，驗證優(yōu)化后發(fā)酵較未優(yōu)化發(fā)酵菌株LG-9抑菌圈的直徑提高了10.43%。首先利用Plackett-Burman設計，得出對鏈霉菌LG-9發(fā)酵粗提液抑菌活性具有明顯影響的因子為溫度、時間、裝樣量，后利用Box-Behnken設計得出模型回歸方程，在回歸分析中發(fā)現，裝樣量的二次項（P<0.01）及溫度和時間的二次項（P<0.05）均顯著影響鏈霉菌LG-9發(fā)酵粗提液的抑菌活性，推測這可能與LG-9菌株的好氧性及其抑菌活性物質對溫度和時間的穩(wěn)定性有關。本研究中菌株LG-9產生的抑黃萎病菌物質屬性及生防機制還有待于進一步研究。

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